以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体.方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体.利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构.结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析.一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致.二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础.根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高.结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础.     

人重组S100A8蛋白适配体的筛选和结构分析

目的:筛选人重组S100A8蛋白特异性的适配体。方法:采用配体指数级富集系统进化(systematic evolu-tion of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术,以人重组S100A8蛋白为靶蛋白,以微孔板为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其适配体。利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并进行生物信息学分析。结果:经过11轮筛选,单链DNA文库与人重组S100A8蛋白的亲和力趋向稳定,将第11轮筛选产物克隆测序,对获得的30个适配体进行分析。一级结构分析显示30个适配体并无共同的保守序列,但有3对适配体序列完全一致。二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是适配体与人重组S100A8蛋白特异性结合的基础。根据茎环和口袋的相对比例可将30个适配体分为4组,其中第1组中35号适配体与人重组S100A8蛋白亲和力最高。结论:获得了与人重组S100A8蛋白特异性结合的适配体群,为后续适配体的应用研究以及S100A8蛋白功能的研究奠定了基础。     

人重组S100A8蛋白适配体的筛选和结构分析

目的：筛选人重组S100A8蛋白特异性的适配体。方法：采用配体指数级富集系统进化（systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX）技术,以人重组S100A8蛋白为靶蛋白,以微孔板为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其适配体。利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并进行生物信息学分析。结果：经过11轮筛选,单链DNA文库与人重组S100A8蛋白的亲和力趋向稳定,将第11轮筛选产物克隆测序,对获得的30个适配体进行分析。一级结构分析显示30个适配体并无共同的保守序列,但有3对适配体序列完全一致。二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是适配体与人重组S100A8蛋白特异性结合的基础。根据茎环和口袋的相对比例可将30个适配体分为4组,其中第1组中35号适配体与人重组S100A8蛋白亲和力最高。结论：获得了与人重组S100A8蛋白特异性结合的适配体群,为后续适配体的应用研究以及S100A8蛋白功能的研究奠定了基础。     

鼻咽癌核酸适配子的筛选及鉴定

目的利用指数富集的配套系统进化技术(SELEX)筛选人类疱疹病毒(EB病毒)阳性鼻咽癌细胞核酸适配子。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA文库,通过SELEX技术,以正常鼻咽上皮细胞为靶标进行消减筛选,以EB病毒阳性低分化鼻咽癌细胞为靶标进行10轮的筛选,克隆、测序,并对适配子进行鉴定。结果流式细胞仪检测亚文库与靶细胞的结合能力随着筛选轮数的增加荧光强度增强。聚类分析显示,适配子可以分为3个家族,1、2家族具有保守序列。结论初步建立EB病毒阳性鼻咽癌细胞适配子库,筛选到具有亲和力和特异性的核酸适配子。     

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV gp41抗原适配体

目的 通过消减SELEX技术筛选得到高特异性、强亲和力的HIV gp41抗原适配体,为HIV的早期诊断提供了新的检测技术.方法 以琼脂磁珠为载体,HIV gp41抗原为靶标分子,利用消减SELEX技术和实时定量-PCR技术,筛选得到HIV gp41抗原适配体.结果 通过6轮筛选,筛选得到的次级ssDNA库通过PCR扩增得到dsDNA,dsDNA与pMDTM 18载体链接,进行克隆、测序,获得4条HIV gp41抗原适配体.获得的4条适配体亲和力(Kd)均在纳摩尔水平,其中15号适配体的亲和力最强,特异性检测表明筛选得到的适配体几乎只与HIV gp41抗原结合,不与其他非特异性蛋白结合.结论 利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与HIV gp41抗原特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗HIV gp41抗原的能力.     

利用细胞-指数式富集的配体系统进化技术筛选肿瘤细胞DNA适配子

目的建立一种通用的细胞-指数式富集的配体系统进化（Cell—SELEX）技术平台,用于筛选特异性结合于肿瘤细胞的DNA适配子。方法采用PCR法建立随机双链DNA（dsDNA）寡核苷酸文库,用卵白素包被的琼脂糖珠从dsDNA库分离单链DNA（ssDNA）文库;以体外培养的肿瘤细胞作为正筛选的靶标,以相同组织来源的正常对照细胞作为负筛选的靶标,消减法进行Cell—SELEX筛选和PCR扩增以获取DNA适配子;流式细胞仪监测适配子的富集效率（亲和力）;采用常规分子生物学技术进行适西亡子的克隆、测序和序列分析。结果成功建立了ssDNA库,经过12轮Cell—SELEX筛选,获得了特异性结合于肿熘细胞的DNA适配子;挑选120个阳性克隆送测序,鉴定出21个适配子,采用NCBI网站提供的B]astn程序进行精确比对末发脱相似序列。结论本实验建立的技术平台可在较短时间内获取特异性结合于特定肿瘤细胞的DNA适配子。     

核酸适配体筛选方法研究进展

指数富集的配基数系统进化(SELEX)技术的基本过程是用化学方法合成一个单链寡核苷酸库,将之于与靶标物质混合,寡核苷酸链与靶标物质结合形成复合物,去除未结合的核酸链后,再将结合的核酸分子与靶标物质分离,以此寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增,用其产物进行下一个循环的筛选。经过数次循环,即可得到能与靶标物质高亲和力高特异性结合的核酸适配体分子。本文综述了SELEX技术筛选核酸适配体技术的一些研究进展。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2核酸适配子的筛选

目的获得与丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2特异结合的高亲和力的DNA适配子。方法应用配基指数富集的系统进化(SELEX)技术进行HCV-NS2蛋白适配子筛选,将筛选得到的适配子克隆测序,应用DNAMAN软件对适配子一级结构和二级结构进行比对分析。结果重复筛选7轮后,适配子亲和力和特异性都达到最高,克隆测序得到4个适配子序列,命名为A1、A2、A3、A4,其随机序列部分分别为A1:GTGCGTCCCATGCTGCTGACTTAAATGGGTGGAGGGCAG,A2:CGTGAAATTGTTGACCACTCATGGAATCTGATCTCGTTT,A3:GAAAGGGGATAATCACTTAGGCCTCTCGAATAGTTTATC,A4:AGAAAGTTGAGAACTGCTGTTATTTTGTTAACGTACATG。经软件分析,适配子之间没有共同保守序列和同源序列,适配子的二级空间结构以茎环和口袋结构为主。结论获得了能与HCVNS2蛋白高亲和力和特异性结合的DNA适配子。     

SELEX技术筛选HCV非结构蛋白NS3的DNA适配子

目的 用配基指数富集的系统进化技术(SELEX)技术筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的DNA适配子.方法 构建随机ssDNA文库,两端为固定序列,中间为39 nt的随机序列,总长度为85 nt,将NS3蛋白包被在96孔板上,ssDNA与NS3蛋白进行亲和反应,洗去未结合的ssDNA,洗脱回收与NS3蛋白结合的DNA,PCR扩增后,磁珠法分离成单链.重复以上筛选步骤,直至筛选出高特异性和亲和力的核酸适配子.将核酸适配子连接质粒载体克隆转人大肠杆菌,挑选阳性克隆提取质粒外送到公司进行测序.结果 通过8轮筛选,成功筛选出DNA适配子,并获得其中6条克隆的DNA一级序列.6条适配子序列长度相同,均为85 nt,两端固定序列与设计相符,中间为随机序列,随机序列无共同保守系列.所有寡核苷酸适配子的二级结构以茎环和凸环为主.结论 以NS3蛋白作为药物研究的靶点,结合SELEX筛选技术研究其核酸适配子,具有巨大的潜力和研究价值.     

SELEX技术筛选特异性结合高转移性肺癌细胞Anip973的单链DNA适配子

目的:筛选获得一种高亲和力的能特异性结合高转移性肺癌细胞Anip973的单链DNA适配子.方法:体外合成全长88 nt的单链DNA文库,通过反复的SELEX筛选获得特异性结合Anip973细胞的单链DNA适配子,并通过生物素-辣根过氧化物酶-链霉亲和素系统初步测定筛选的适配子与细胞的亲和力,将结合力最高的适配子库进一步...     

慢性髓细胞性白血病K562细胞适体的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定出慢性髓细胞性白血病（CML）K562细胞的寡核苷酸适体.方法：体外合成长度为88个碱基的随机单链DNA（ssDNA）文库,采用生物素-链霉亲和素磁珠法制备次级文库,以正常人血液中提取的中性粒细胞为反筛细胞,利用指数富集的配基系统进化（SELEX）技术筛选出与CMLK562细胞特异结合的适体.将筛选得到的适体回收纯化后连接pGEM-T质粒载体,经蓝白筛选后,随机挑选24个克隆子进行序列测定.采用荧光标记引物法检测ssDNA文库与K562细胞的亲和力,并用Clustal 2.05和DNA sis V2.5软件对适体序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测.结果：经过13轮循环筛选,CML K562细胞适体的A值从0.12上升到1.25,至第13轮A值无明显增高.一级结构分析无同源序列,但可分为6个家族,其中5个家族各自具有保守序列,家族6无保守序列.二级结构分析表明,适体形成的茎环、凸环结构可能是与K562细胞特异性结合的结构基础.结论：利用SELEX技术成功筛选出高亲和性的CML K562细胞适体.     

肝癌血清肿瘤标志物适配体的筛选及活性鉴定

目的:肝癌血清中含有已知和未知的标志物,可以作为SELEX筛选的靶标,获得一组已知和未知肝癌血清标志物的适配体,为肝癌早期诊断提供新的分子生物学检测方法。方法：收集50例经诊断证实为原发性肝癌患者的血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体。先将磁珠-正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠-肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD18-T载体连接进行转化、挑选单克隆团送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值)。结果：经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个。结论：特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-1、Seq-16、Seq-17、Seq-56、Seq-72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91%以上,为肝癌的早期诊断提供了新方法。     

适配子治疗获得性免疫缺陷综合征的研究进展

适配子(aptamer)是在体外人工合成的具有特定3级结构的单链DNA或RNA分子,从随机寡核苷酸文库中通过配体指数富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential Enrichment,SELEX)筛选出来,能与靶分子以高亲和力、高特异性结合。由于适配子和靶分子结合后可阻断靶分子的生物学活性,与相应抗体分子相比,适配子具有许多优越性,如分子量小、易于修饰、无免疫原性等,因而在各种疾病的治疗中具有广阔的应用前景。文中就适配子治疗人类免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1,HIV-1)感染所致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)的研究进展作一综述,以深入研究适配子对病原体感染的治疗作用。     

炭疽芽孢DNA适配子结构与长度对亲和力的影响

目的 研究炭疽芽孢适配子结构与长度变化对其与芽孢之间亲和力的影响。方法 人工合成f77-1适配子序列，并构建在其7条突变体序列，将这些寡核苷酸序列分别与炭疽芽孢结合，利用TMB显色系统判断读取吸光度A值，确定各序列与芽孢间亲和力大小；同时通过核酸序列分析软件包模拟各序列的二级结构，推断适配子的结构与亲和力之间的关系。结果 适配子f77-1与突变体中的f77-3与芽孢亲和力较好，约是突变体中f77-4亲和力的11倍，二级结构显示：f77-1,f77-3都具有茎环或发卡结构，且3'端都有连续3个G。结论 适配子5'端的茎环结构和发卡结构是这些寡核苷酸序列与芽孢结合的结构基础，3'端的连续3个G可能对提高亲和力起着重要的作用。     

核酸适配体对岩沙海葵毒素细胞毒性保护作用

目的 核酸适配体（Aptamer）是利用指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选得到的单链DNA或RNA片段,能高亲和、高特异性地与靶标分子结合。岩沙海葵毒素（Palytoxin,PLTX）是目前已知的最具毒性的非蛋白质类天然海洋毒素之一。基于核酸适配体对PLTX的特异性靶向功能,探究核酸适配体对细胞毒性的保护作用。方法 采用细胞毒性实验分别检测比较了PLTX对NIH-3T3、CHO-K1、HACAT三种不同细胞的毒性作用,以及适配体拮抗PLTX的细胞毒作用。采用红细胞溶血实验检测PLTX对人红细胞的溶血作用,以及适配体抑制PLTX的溶血活性作用。结果 三种细胞毒性曲线结果显示,HACAT细胞的ID50约为3.42ng/ml,CHO-K1细胞的ID50约为1.06×10-2ng/ml,NIH-3T3细胞的ID50约为1.39×10-2ng/ml。在不同浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对HACAT细胞的毒性作用（P<0.05）。在50nM PLTX浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对人红细胞溶血活性作用（P<0.05）。结论 实验结果表明HACAT细胞对2.5×10-3~2.5×102ng/ml浓度范围的PLTX毒性作用较敏感;核酸适配体对HACAT细胞具有细胞毒性保护作用。在50nM PLTX浓度下,相应浓度适配体能够有效抑制PLTX对人红细胞的溶血活性,起到显著细胞保护作用。     

雌激素受体核酸适配体在乳腺癌免疫组织化学检测中的应用

  目的  筛选出能应用于乳腺癌免疫组织化学检测的雌激素受体（ER）核酸。  方法  制备ER蛋白,用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术筛选出对ER具有高亲和力和特异性的核酸适配体。采用配体－受体相互反应实验来测定合成的ER适配体复合物的亲和力,用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗对105例乳腺癌组织进行免疫组化染色,以检测合成的ER适配体在癌组织中的特异性表达。用Kappa检验进行一致性检验。  结果  线性回归法计算获得生物素化适配体与ER复合物的解离常数Kd值为（0.34±0.05）nmol/L (n=3, r=0.989),最大结合力（B_max）为769.23 fmol/(mg prot·nmol-1·L-1)。实验结果表明,分别用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗进行免疫组化染色的结果具有高度一致性。其中ER阳性和阴性样本n=105,kappa值=0.943,95%可信区间=0.879~1.006,P<0.05;而ER弱阳性和中度/强表达样本n=75,kappa值=0.805,95%可信区间=0.642~0.967,P<0.05。进一步观察发现,ER适配体和ER抗体能使乳腺癌组织同一部位出现阳性表达,而阴性对照组均无表达。2例子宫内膜癌用生物素化ER适配体检测,癌细胞ER表达均为阳性。  结论  我们合成的ER适配体在体外能高度结合ER,ER适配体和ER抗体都能检测乳腺癌组织中ER的特异性表达。