橄榄苦苷对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响及可能机制

目的 探讨橄榄苦苷对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡及JNK/p38 MAPK信号通路的影响。方法 60只8周龄雌性SD大鼠,随机分为假手术组(Sham)、脊髓损伤组(SCI)和橄榄苦苷处理组(Oleuropein),每组20只。脊髓损伤后3 d,进行BBB评分评估运动功能恢复情况;TUNEL实验检测各组大鼠脊髓组织神经细胞凋亡情况;免疫荧光方法与Western blot方法检测各组大鼠脊髓组织磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)蛋白的表达。结果 与SCI组相比,橄榄苦苷处理组大鼠BBB评分及斜面试验结果明显升高(P<0.05),脊髓组织神经细胞凋亡率明显降低(P<0.05),脊髓组织p-JNK、p-p38蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论 橄榄苦苷能够通过抑制JNK/p38 MAPK信号通路减少神经细胞凋亡继而减轻脊髓损伤。     

大鼠脊髓半横断损伤后脊髓神经细胞凋亡与caspase-3的表达

为研究损伤脊髓神经细胞凋亡和相联系的caspase-3的表达,用原位末端标记法(TUNEL)检测了成年大鼠胸脊髓(T9)半横断损伤(hSCI)后脊髓神经细胞的凋亡变化,并用免疫组织化学染色方法观察了caspase-3的表达。结果显示:hSCI后6h损伤侧脊髓腹角即出现较多的TUNEL阳性神经细胞,并持续至5周。损伤脊髓的吻侧段于手术后4d达高峰,尾侧段脊髓于伤后1d达高峰。与假手术组相比,在所有观察的时间点TUNEL阳性神经细胞的数量在损伤侧均有明显增加。caspase-3免疫组化染色显示,与假手术组相比,伤后6h损伤侧脊髓腹角caspase-3表达也明显增加,并持续至5周。以上结果提示hSCI后,脊髓可出现神经细胞凋亡,且此凋亡的发生可能与caspase-3的表达有关。     

乙酰左旋肉碱对大鼠脊髓损伤的保护作用

目的:研究乙酰左旋肉碱(Acetyl-1-carnitine,ALC)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的保护作用,并探讨其作用机制。方法:成年雄性SD大鼠36只,体重200~250 g,随机分为三组:假手术组(Sham组)、脊髓损伤组(SCI组)、乙酰左旋肉碱组(ALC组)每组12只。Sham组只暴露脊髓,不打击;SCI组采用Allen's重物打击法制备脊髓损伤模型;ALC组在打击脊髓后15 min腹腔注射剂量为300 mg/kg的乙酰左旋肉碱。Sham组和SCI组均腹腔注射相同体积的生理盐水。24 h后取出各组大鼠脊髓组织进行检测。用分光光度法检测各组脊髓组织中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,用Western Blot检测凋亡蛋白caspase-3的表达量,用TUNEL法观测神经细胞的凋亡状况。结果:与Sham组相比,SCI组脊髓组织中MDA含量明显升高,SOD活性明显降低,凋亡蛋白caspase-3表达量明显增加,神经细胞的凋亡比例明显增加(P0.01);与SCI组相比,ALC组脊髓组织中MDA含量明显降低,SOD活性明显增加,凋亡蛋白caspase-3表达量明显降低,神经细胞的凋亡比例明显减少(P0.01)。结论:乙酰左旋肉碱可以减轻氧化损伤,抑制神经细胞凋亡,对脊髓损伤有保护作用。     

体外原代培养大鼠胚胎脊髓神经细胞机械损伤后的凋亡与caspase-3的表达

为了研究体外培养大鼠胚胎脊髓神经细胞损伤前后的凋亡变化及caspase-3的表达情况,本实验建立了一个模拟脊髓横断损伤后脊髓组分-原代培养的脊髓神经细胞机械损伤模型,并用Hoechst33342/PI双染法检测脊髓神经细胞的凋亡变化,用免疫荧光染色方法检测caspase-3的表达。结果显示:(1)损伤前几乎未见凋亡的神经细胞,损伤后6 h凋亡细胞开始出现,损伤后12 h明显增多,1 d时达高峰,但损伤后3 d凋亡细胞开始呈明显下降的趋势,至损伤后7 d又开始增加,一直持续到损伤后14d;(2)相应时刻caspase-3表达趋势的改变与脊髓神经细胞凋亡趋势的变化基本相同;(3)经过caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO干预后,凋亡细胞的数量与caspase-3的表达均减少,并呈剂量依赖性。以上结果提示,机械损伤可以诱发体外培养的脊髓神经细胞凋亡,且此凋亡的发生可能与caspase-3的表达有关。     

丙酮酸通过抑制p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化减轻低氧对PC12细胞的损伤北大核心CSCD

目的观察丙酮酸对低氧诱导神经细胞损伤的保护作用及机制。方法采用丙酮酸处理PC12细胞,10 m L/L O2的低氧环境暴露12、24、48 h。MTT法观察细胞增殖情况,检测胱天蛋白酶3(caspase-3)活性观察细胞凋亡情况,ELISA检测白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,Western blot法检测p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化的p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白水平。结果低氧暴露24、48 h,抑制PC12细胞增殖,caspase-3活性增强,IL-1β、IL-6、TNF-α和p-p38MAPK水平增高;丙酮酸处理可显著增加PC12细胞增殖,减少细胞凋亡,降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平,抑制p38MAPK的磷酸化水平。结论丙酮酸通过抑制p38MAPK的磷酸化而抑制低氧暴露引起PC12细胞炎症因子的表达,对低氧暴露导致的神经元损伤起保护作用。     

利拉鲁肽通过抑制线粒体凋亡途径对大鼠脊髓损伤的保护作用

目的:研究利拉鲁肽注射液对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后线粒体氧化损伤、细胞色素C(Cyt-C)、caspase-3及细胞凋亡的影响。方法:将36只健康SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、脊髓损伤组(SCI组,生理盐水50μg/kg,腹腔注射)、利拉鲁肽组(50μg/kg,腹腔注射),每组12只。采用Allen’s法制作SCI模型,假手术组仅行椎板切除,其余二组行椎板切除并打击。模型建立24 h后取受损脊髓,提取脊髓组织线粒体,分别检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量、Cyt-C与caspase-3表达,JC-1法测定线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞的凋亡情况。结果:利拉鲁肽组较SCI模型组脊髓组织线粒体中GSH的含量明显有所升高,而MDA的含量明显降低(P0.01),JC-1法示利拉鲁肽组大鼠线粒体膜电位较SCI模型组明显有所提高(P0.01)。Western Blot法和TUNEL法分别显示利拉鲁肽组大鼠脊髓内Cyt-C、caspase-3的表达和细胞凋亡数较SCI模型组明显有所减少(P0.01)。结论:利拉鲁肽能够改善SCI后线粒体氧化损伤,保护线粒体膜电位,减少Cyt-C释放,降低caspase-3表达,抑制细胞凋亡,对SCI起到保护作用。     

大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及相关调控蛋白Caspase-3表达的时空分布

目的 观察大鼠脊髓损伤（SCI）后神经元细胞凋亡和相关调控蛋白Caspase-3表达的时间、空间分布规律。方法 SD大鼠50只,分为假手术组和SCI组,钳夹法建立SCI模型,用结晶紫（CV）染色法、TUNEL法和免疫组织化学方法观察SCI后6h、12h、24h、3d和7d损伤中心到头端0～5.00mm空间范围内脊髓神经细胞存活、凋亡以及相关调控蛋白Caspase-3的表达状况。 结果 CV染色发现,SCI后6h～7d在0～0.50mm空间范围内均未发现存活的神经细胞,在1.00～3.50mm距离内,存活的神经细胞数逐渐增加,4.00mm处达峰值;TUNEL结果发现,SCI后6h～7d在1.05～4.55mm范围内,神经细胞出现凋亡,3d时在2.55mm处,细胞凋亡达高峰,7d时显著减少;免疫组织化学结果发现,SCI后6h～7d在1.10～4.60mm范围内,神经元细胞出现Caspase-3阳性表达,3d在3.10mm处Caspase-3表达达到高峰,7d显著减少。 结论 SCI后,凋亡的神经细胞及其相关调控蛋白Caspase-3的表达有一定的时空分布规律。     

活性氧在脊髓损伤中的作用及损伤机制

目的研究脊髓损伤(SCI)后脊髓组织中丙二醛(MDA)的动态水平变化和神经细胞凋亡及其凋亡相关因子表达的变化,探讨活性氧(ROS)在SCI后的作用及其分子机制。方法成年雄性大鼠132只,用改良的Allen法复制大鼠急性SCI模型,致大鼠脊髓(T10)中度挫伤,采用化学比色法测定不同时间段受损脊髓组织的MDA含量;免疫组织化学法分析受损脊髓组织区域凋亡相关因子Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达变化;荧光原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果SCI后6h,脊髓组织中MDA含量明显增高并维持到损伤后5d,期间在6h和3d出现两次高峰,7d基本恢复正常;SCI后6h脊髓组织中凋亡细胞开始增多,3d达高峰,以后逐渐减少,各时间点与假手术组比较有显著性的差异;Bcl-2和Bax蛋白损伤后6h开始有较多的表达,以后快速增多,5d达高峰,然后逐渐回落。Caspase-3蛋白在损伤后6h开始增多,3d达高峰,以后逐渐减少。3种凋亡相关因子在各时间点与假手术组比较有显著性差异;甲基强的松龙(MPSS)治疗组与SCI组比较:MDA含量、凋亡细胞数、凋亡因子Caspase-3和Bax表达减少,Bcl-2表达增加,并且在部分时间点有显著性差异。结论在SCI后ROS可能通过促进Caspase-3表达和降低Bcl-2/Bax之间的比值诱导神经细胞凋亡,从而加重了SCI继发性损伤。     

蛇床子素激活wnt/β-catenin信号通路抑制急性脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡

目的探讨蛇床子素对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响及可能机制。方法将45只SD大鼠平均分为假手术组(Sham)、脊髓损伤组(SCI)与蛇床子素治疗组(Ost),采用Allen法建立大鼠SCI模型。建模7d后评估各组大鼠后肢运动功能,并检测脊髓含水量。TUNEL方法检测脊髓神经细胞凋亡;Western blot和qRTPCR检测Wnt-1、GSK-3β、β-catenin表达。结果急性脊髓损伤导致大鼠后肢功能障碍,脊髓细胞发生凋亡,蛇床子素可以减少急性脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡,抑制炎症反应,改善后肢功能,减轻脊髓损伤,同时可以下调GSK-3β表达水平,上调Wnt-1和β-catenin蛋白表达水平。结论蛇床子素通过激活wnt/β-catenin信号通路抑制神经细胞凋亡,促进大鼠运动功能恢复。     

MAPK和caspase-3在异基因CD8+T淋巴细胞诱导血管内皮细胞凋亡中的作用

目的： 探讨MAPK和caspase-3在异基因CD8+T细胞诱导血管内皮细胞凋亡中的作用。方法：免疫磁珠阳性分选异基因CD8+T细胞,AnnexinⅤ/FITC试剂盒检测异基因CD8+T细胞诱导的HUVECs和HDMECs凋亡率,Western blotting检测血管内皮细胞内caspase-3、MAPK表达。观察SB203580 (p38MAPK抑制剂)、SP600125 (JNK抑制剂)、PD98059（ERK抑制剂）、Z-DEVD-FMK（caspase-3抑制剂）对内皮细胞凋亡的影响。结果：异基因CD8+T细胞作用24 h和48 h后,HUVECs凋亡率分别为41.7％±10.1％和29.4％±8.3％,HDMECs凋亡率分别为28.9％±7.2％和15.2％±4.8％,与对照组相比均具有显著差异（P<0.01）。异基因CD8+T细胞作用后,HUVECs和HDMECs内磷酸化p38MAPK表达、caspase-3裂解增强,而磷酸化JNK、ERK无明显变化。Z-DEVD-FMK和SB203580可显著抑制异基因CD8+T细胞诱导的HUVECs和HEMEC凋亡,并降低内皮细胞caspase-3表达。结论：p38MAPK和caspase-3介导了异基因CD8+T细胞诱导的血管内皮细胞凋亡。     

SB203580, a p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor,fails to improve functional outcome following a moderate spinal cord injury in rat

We examined the spatial and temporal expression patterns of active p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), an important regulator of immune cell function, following spinal cord injury (SCI). We further assessed whether administration of SB203580, an inhibitor of p38 MAPK activity, would reduce inflammation, improve tissue sparing, and improve functional outcome after SCI. Adult Wistar rats were subjected to a T9/10 SCI contusion of moderate severity and killed at several time points after injury, whereas sham-injured (control) animals only received a laminectomy. In control animals, active p38 MAPK expression was primarily localized to resting microglia within the spinal cord. Over the first 24 h after SCI, a continuing increase in active p38 MAPK expression was evident in neutrophils and activated microglia (OX42+) surrounding the spinal lesion site. At 15 days post-injury, active p38 MAPK was localized to macrophages (ED1+) that now dominated the lesion site. In addition, active p38 MAPK was localized to macrophages within white matter fiber tracts undergoing degeneration, several segments rostral and caudal to the injury site, which persisted for at least 6 weeks. Overall, our results demonstrate that active p38 MAPK is increased within resident and invading immune cells after SCI contusion injury and, therefore, may be an important target to regulate the inflammatory cascade after SCI. However, intrathecal application of SB203580 failed to improve functional outcome after a moderate SCI contusion.     

Continuous intrathecal infusion of SB203580, a selective inhibitor of p38 mitogen-activated protein kinase, reduces the damage of hind-limb function after thoracic spinal cord injury in rat

P38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) is one of the key enzymes in apoptosis induction pathways. We tested continuous intrathecal infusion of SB203580, a selective inhibitor of p38-MAPK, after spinal cord compression injury by a 20 g weight for 40 min at the 11th vertebra level-thoracic spinal cord. SB203580 (1 microg/day) was infused for 1 week after the compression. Hind-limb function was evaluated by measuring the frequency of 'standing' posture; raising fore limbs and sustaining body weight with hind-limbs. One-week after the compression, frequency of standing spinal cord injured rat was decreased to about half of that in sham operated animals which underwent laminectomy without compression. The frequency of standing in rats infused SB203580 recovered 2-3 weeks after the spinal cord injury, on the other hand, vehicle animals infused with saline did not recover. Myelin staining by Luxol fast blue showed severe myelin degradation in vehicle animals in lateral and dorsal funiculi. Apoptotic cells, detected by TUNEL staining, appeared in lateral funiculi of spinal cord injured rats. The application of SB203580 decreased the number of apoptotic cells. The SB203580-treated animals showed no significant degeneration of myelin structure. These results suggest that inhibition of p38-MAPK is one candidate for therapeutic agents against neurological deficits after spinal cord injury.     

p38 MAPK在顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的:探讨p38 MAPK在顺铂诱导大鼠近端肾小管上皮细胞(RPTC)凋亡中的作用。方法:首先采用Western blot实验检测0、5、10和20μmol/L顺铂处理24 h对细胞凋亡的影响,确定最佳处理剂量;而后采用20μmol/L顺铂联合50 mg/L p38 MAPK抑制剂SB203580刺激RPTC,实验分为对照组、顺铂组及顺铂+SB203580(加入SB203580处理RPTC 1 h后再给予顺铂处理24 h)。采用相差荧光显微镜观察和流式细胞术分析顺铂处理后RPTC的凋亡情况;采用Ac-DEVD-AFC试剂盒检测RPTC裂解液中的caspase活性;Western blot实验检测p38、磷酸化p38、cleaved PARP和cleaved caspase-3等的蛋白水平;pH计检测顺铂处理后RPTC外环境pH值改变。结果:20μmol/L顺铂处理RPTC 24 h,可以明显诱导细胞凋亡;顺铂处理15 min后RPTC中p38 MAPK开始磷酸化并达到高峰。顺铂处理后12.08%的RPTC呈凋亡形态,具有增强的caspase活性,并且cleaved PARP和cleaved caspase-3水平明显升高(P0.05);p38 MAPK抑制剂SB203580可抑制p38的磷酸化,降低RPTC的凋亡率和caspase活性,并减少cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白水平。同时,SB203580可逆转顺铂诱导的RPTC培养基pH值的改变。结论:p38 MAPK的磷酸化在顺铂诱导的RPTC凋亡中发挥作用。顺铂诱导RPTC凋亡后,可改变细胞外酸性环境,并可被p38 MAPK抑制剂SB203580所抑制。     

TPX2通过p38 MAPK信号通路诱导直肠癌HR-8348细胞凋亡

目的:研究下调非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白(TPX2)对直肠癌细胞凋亡的影响及机制。方法:用TPX2小干扰RNA(si RNA)转染直肠癌HR-8348细胞,记为TPX2 si RNA组;以不做转染的细胞作为正常对照(control)组;以转染si RNA阴性对照(si RNA-NC)的细胞作为si RNA-NC组;用p38 MAPK抑制剂处理敲减TPX2表达后的直肠癌HR-8348细胞记为TPX2 si RNA+SB203580组。RT-qPCR和Western blot测定TPX2的表达水平,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、cleaved caspase-3和Bcl-2的蛋白水平。结果:TPX2 si RNA转染后HR-8348细胞中TPX2的m RNA和蛋白表达水平显著下降(P 0. 05),而转染si RNA-NC对HR-8348细胞中TPX2的m RNA和蛋白水平没有影响。敲减TPX2表达后的直肠癌HR-8348细胞存活率降低,凋亡率升高,细胞中的cleaved caspase-3、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白水平明显升高,Bcl-2水平水平降低,与control组比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。与TPX2 si RNA组相比,TPX2 si RNA+SB203580组的HR-8348细胞凋亡率、cleaved caspase-3水平和p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白水平明显降低,存活率明显升高(P 0. 05)。结论:TPX2表达下调可以通过激活p38 MAPK促进直肠癌HR-8348细胞凋亡。     

P38MAPK、Caspase-8在Fas—AD诱导Bel-7402细胞凋亡中的作用

目的通过P38MAPK抑制剂SB203580及caspase-8抑制剂Ac-IEFD-cho的作用,确定P38MAPK、caspase-8的相互作用关系,进一步揭示Fas—AD诱导Bel-7402细胞凋亡的信号转导机制。方法通过RT—PCR法检测培养的Bel-7402细胞中P38MAPK mRNA、caspase．8 mRNA在Fas．AD、SB203580及Ac—IEFD—cho作用下的表达情况。结果在Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡中,SB203580和Ac—IEFD—cho能分别抑制p38MAPK mRNA、caspase-8 mRNA的表达。结论在Bel-7402细胞凋亡中,P38MAPK与easpase-8参与Fas—AD凋亡途径,并且在mRNA水平进行相互调节。     

Manumycin诱导细胞凋亡抑制乳腺癌细胞SK-BR-3活性

目的:研究manumycin对乳腺癌腹腔转移癌细胞株SK-BR-3的抑癌效应及其诱导凋亡。方法:用MTT法检测manumycin对SK-BR-3细胞的抑癌作用。免疫印迹方法检测p38 MAPK蛋白表达。用caspase-3活性检测试剂盒定量检测manumycin诱导细胞凋亡的水平及评估特异性的p38 MAPK抑制剂SB203580对凋亡的影响。结果:经6 μmol/L、18 μmol/L、54 μmol/L manumycin处理SK-BR-3细胞24 h时,其抑制率分别为(7.4±3.9)%、(21.0±4.4)%和(64.7±4.1)%,呈量效关系。其中后2者的细胞活性与对照组比有显著差异(P<0.01)。用药24 h的IC₅₀为42.5 μmol/L。同时此药物可明显增加caspase-3的活性,且这一效应可部分地被p38抑制剂SB203580阻断。免疫印迹结果显示manumycin促进p38的磷酸化。结论:manumycin可通过诱导SK-BR-3细胞凋亡而产生抑癌作用,p38 MAPK是manumycin诱导细胞凋亡的通路之一。     

Inhibition of the p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway attenuates cerebral vasospasm following experimental subarachnoid hemorrhage in rabbits

The p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) plays an important role in apoptosis and is also involved in the development of cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage (SAH). Here, we sought to examine whether inhibition of p38 MAPK could attenuate cerebral vasospasm and investigate the underlying mechanisms in a rabbit SAH model. SAH was established in rabbits (n=12/group) using the double-hemorrhage method. We observed apparent vasospasm in the basilar arteries of rabbits with SAH, which was significantly attenuated by SB203580, a selective p38MAPK inhibitor. Immunoblotting assays showed enhanced phosphorylation of p38 MAPK and ATF2 and increased caspase-3 cleavage following SAH, which were, however, markedly suppressed by SB203580. TUNEL staining further revealed significant apoptosis in the basilar arteries of rabbits with SAH, which was scantly present in rabbits treated with SB203580. Our results demonstrated that p38 MAPK was activated in cerebral vasospasm and associated with increased apoptosis in the basilar arteries and p38 MAPK inhibition suppressed apoptosis, suggesting that p38 MAPK could be a novel therapeutic target for cerebral vasospasm.     

p38MAPK抑制剂对神经病理性疼痛大鼠脊髓TNF-α合成的影响

 摘要：目的：通过建立坐骨神经慢性压迫损伤模型,研究p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK,p38）与TNF-α在神经病理性疼痛发生与发展中的相互作用。方法：SD大鼠分5组：1）空白对照组,2）假手术组,3）CCI手术未治疗组,4）CCI手术生理盐水治疗组,5）CCI手术SB203580（p38抑制剂）治疗组。上述治疗组中,生理盐水或SB203580分别于术前1天、术后第1天,和术后第7天鞘内注射。各组大鼠分别于术后3、7、14天测定机械痛阈。采用Western blot和免疫组化方法测定脊髓中TNF-α含量及p38活化水平。结果：与假手术组相比,CCI手术后3、7、14天磷酸化p38（p-p38）水平明显增加（p<0.05）。外周神经损伤后引起机械性触诱发痛,并且使脊髓中TNF-α浓度增加（p<0.05）。预先或术后立即给予SB203580抑制p38活化可以减少脊髓TNF-α合成,从而有效缓解病理性疼痛(p<0.05)。结论：外周神经损伤后,作为信号转导通路之一的p38可能通过促进脊髓TNF-α合成,引发神经病理性疼痛。