结核分枝杆菌Ag85B/GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建结核分枝杆菌Ag85B／GSF融合蛋白表达质粒，并在大肠杆菌(E．coli)中诱导表达。方法 以质粒pUC18／Ag85B为模板，用PCR法扩增结核杆菌Ag85B基因，扩增的Ag85B上游含有EcoR Ⅰ酶切位点，下游含有SalⅠ酶切位点；将Ag85B基因定向插入质粒pGEX-4T-1中，构建原核表达质粒pGEX-Ag85B并转化E．coli B121，筛选阳性重组子，限制性内切酶切鉴定和DNA序列测定，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-PAGE和Westem blot鉴定结果。结果 成功构建原核表达质粒pGEX-Ag85B并表达出Mr约56000大小的Ag85B／GSY融合蛋白，表达量占总菌体的30％。结论 为进一步进行纯化Ag85B蛋白和研究其在膀胱肿瘤治疗中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B与IL-12基因真核共表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌Ag85B和鼠IL 12基因的共表达载体pBud85B IL12。方法 :将结核分枝杆菌Ag85B基因和鼠IL 12基因同时克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4 .1中 ,构建真核共表达质粒pBud85B IL12。以pBud85B IL12转染COS 7细胞 ,通过RT PCR及ELISA方法检测目的基因的表达。结果 :在COS 7细胞中同时可检测到Ag85B和IL12的表达。结论 :pBud85B IL12共表达质粒的成功构建 ,为对其免疫原性、免疫反应性及免疫保护作用的进一步研究奠定了基础     

结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ａｇ８５Ｂ基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌Ｈ３７Ｒａ株基因组中,扩增出蛋白Ａｇ８５Ｂ的成熟蛋白的编码基因,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体ｐＵＣ１９中。经酶切鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的相应酶切位点。结果 结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒａ株Ａｇ８５Ｂ成熟蛋白的编码基因经序列测定证实,与Ｅｒｄｍａｎ株完全一致;用Ｅｃｏ     

结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性

目的通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白。方法用PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达。用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性。利用PCR技术鉴定fbpA基因在不同分枝杆菌的分布。结果32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化。表达Ag85A蛋白的fbpA基因在结核分枝杆菌H37Rv、H37Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达。结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度最高。结论重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性。     

结核杆菌Ag85A/GM-CSF嵌合表达质粒的构建及表达

目的：探讨对结核病DNA疫苗进行基因修饰的新方法。方法：以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因的成熟肽编码区，以经PHA诱导后的小鼠脾组织总RNA为模板，通过RT－PCR获得小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的cDNA，将二者定向克隆入质粒pBK-CMV中构建含嵌合目的基因的重组质粒，转染培养的COS7细胞后检测嵌合目的基因的表达。结果：成功构建了小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子cDNA与结核杆菌Ag85A抗原基因的真核嵌合表达质粒，重组质粒能在COS7细胞中进行稳定表达。结论：本研究首次将细胞因子基因与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合构建嵌合DNA疫苗，为进一步研究其在动物体内的免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。     

pS2融合蛋白的原核表达及其性质鉴定

目的：获得ｐＳ２融合蛋白。方法：ＲＴ－ＰＣＲ法从乳腺癌组织中扩增ｐＳ２片段，定向克隆到ＰＭＳ－３１ｂ载体上，重组质粒ＰＭＳ－ｐＳ２转化温度敏感型细菌ＰＯＰ２１３６，使之高效表达融合蛋白ＭＳ２－ｐＳ２。结果：免疫组织化学试验（ＩＨＣ）结果表明：纯化的融合蛋白ＭＳ２－ｐＳ２能与抗ｐＳ２进口单抗特异反应。酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ试验表明；ＭＳ２－ｐＳ２能与ｐＳ２Ｃ端     

结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究

目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。     

人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备

目的利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒,制备TrxA/IκBα融合蛋白,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体. 方法以重组质粒pGEM-T-IκBα为模板,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基因cDNA,经相应酶切后插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达TrxA/IκBα融合蛋白.Western blot试验鉴定表达蛋白.超声波破菌后采用Ni-NTA树脂对TrxA/IκBα融合蛋白进行纯化. 结果酶切鉴定证实人IκBα基因cDNA已插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了TrxA/IκBα融合蛋白,其相对分子质量(Mr)约为56×103,表达量约占细菌总蛋白的25%.Western blot试验显示TrxA/IκBα融合蛋白与兔抗IκBα多克隆抗体呈特异性免疫反应.经Ni-NTA树脂纯化后,TrxA/IκBα融合蛋白的纯度可高达95%以上. 结论人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备为进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体奠定了物质基础.     

Nogo-66融合蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达轴突再生抑制蛋白Nogo-66,并对其进行鉴定。方法采用聚合酶链反应方法从含Nogo-66编码序列的质粒DNA中扩增出Nogo-66基因开放阅读框,构建原核表达载体,转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,裂解细菌抽提蛋白,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western免疫印迹鉴定。结果测序鉴定Nogo-66开放阅读框成功插入pET-46-EK/LIC质粒;重组质粒在大肠杆菌中成功表达大鼠Nogo-66蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量(Mr)约7000,WesternBlot结果证实表达产物融合有聚组氨酸标签。结论应用原核表达系统成功表达了Nogo-66蛋白,为下一步制备Nogo-66蛋白疫苗及疫苗功能研究打下了基础。     

结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的构建结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒。方法采用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B及ESAT-6基因,将其分别定向克隆入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子重组质粒。进行酶切分析及序列测定后,用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及ESAT-6的表达。结果核酸序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及ESAT-6mRNA。结论成功构建了结核杆菌Ag85B及ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌抗原Ag85B-Mpt64190-198-HspX融合蛋白免疫原性的初步观察

目的 为了建立对潜伏感染细菌的保护性免疫应答,本研究选择结核分枝杆菌休眠期、对数生长期最重要的保护性抗原HspX、Mpt64的190～198位的氨基酸多肽(CD8+T细胞表位)及Ag85B,构建融合蛋白Ag85B-Mpt64190-198-HspX(AMH),并对其免疫原性进行研究.方法 PCR分别扩增Ag85B、Mpt64190-198-HspX基因,并依次插入pET-28a质粒中,在大肠杆菌BL21中表达纯化AMH蛋白.将该蛋白和佐剂二甲基三十六烷基铵和卡介苗多糖核酸(DDA+BCG-PSN)混合构建亚单位疫苗,分别于1、4、7周皮下免疫C57BL/6小鼠3次,最后一次免疫5周后检测体液免疫与细胞免疫反应.结果 该融合蛋白以包涵体形式能在大肠杆菌中稳定表达,经Ni-NTA层析柱纯化得到纯度较高的蛋白;构建的亚单位疫苗免疫动物能产生针对结核杆菌特定抗原(PPD、Ag85B、Mpt64190-198和HspX)的特异性的细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性.结论 融合蛋白AMH作为结核亚单位疫苗候选的融合蛋白抗原有必要进一步研究.     

T-bet佐剂对Ag85B抗结核DNA疫苗的免疫调节

目的:构建以Th1转录因子T-bet为基因佐剂的Ag85B新型DNA疫苗,并研究其免疫调控作用。方法:RT-PCR法扩增出Ag85B基因和T-bet基因,克隆入pcDNA3.1质粒构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞系,Western blot法检测质粒蛋白表达情况。3次肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后,ELISA法检测血清中抗Ag85B抗体滴度。同时将脾脏淋巴细胞悬液于Ag85B刺激下培养,ELISA法检测培养液中细胞因子分泌情况。结果:质粒蛋白成功表达,并且质粒剂量与质粒蛋白表达水平呈正相关。此外,T-bet/Ag85B不仅诱导IgG2a滴度显著增高伴随IgG1显著降低,而且还刺激IL-2/IFN-γ(Th1类)分泌增加伴随IL-4/IL-10(Th2类)减少。结论:T-bet增强抗Ag85B特异性IgG2a抗体反应,并诱导显著的Th1细胞优势免疫。     

可表达结核分枝杆菌融合蛋白Ag85A-ESAT-6重组卡介苗免疫保护作用研究

目的以Balb/c小鼠为动物模型,评价重组卡介苗新型结核病疫苗rBCG-Ag85A-ESAT-6(rBC-AE)的免疫保护效应。方法将重组卡介苗rBCG-AE免疫动物10周后,结核分枝杆菌H37Rv尾静脉注射进行感染攻击,分别于感染攻击后3、6和9周,通过观察肺组织大体病变、脾肺组织细菌载荷量计数、肺组织抗酸染色、HE染色结合肺组织病理变化,综合评价该疫苗诱导的免疫保护作用。结果 rBCG-AE组脾肺组织细菌载荷量在各时间点均显著低于阴性对照组(PBST组,P0.01),但明显高于卡介苗(BCG)组(P0.01)。rBCG-AE组肺组织病变在感染攻击后6～9周逐渐改善,但其病理打分在各时间点均明显高于BCG组(P0.01)。各组肺组织大体病变与组织病理打分变化相似。结论重组卡介苗rBCG-AE仅能诱导产生与BCG疫苗相当甚至较低的免疫保护作用。