稳定表达人类疱疹病毒6型U94基因血管内皮细胞株的建立及U94对内皮细胞增殖和血管生成能力的影响

目的:构建人类疱疹病毒6型U94基因慢病毒载体,研究U94基因对血管内皮细胞增殖及血管生成的影响?方法:以质粒pSR2PH－U94为模板,PCR扩增U94－6×His片段,克隆至慢病毒载体pLenti6.3－MCS－IRES2－EGFP,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T细胞,获得含U94－6×His基因的重组慢病毒?重组慢病毒感染血管内皮细胞EA.hy926,经Blasticidin筛选,RT－PCR和Western blot鉴定,获得稳定表达细胞株?CCK－8和小管形成实验研究U94基因对血管内皮细胞的增殖及血管生成能力的影响?结果:成功构建含U94基因的慢病毒表达载体pLenti－U94－IRES2－EGFP,重组慢病毒经包装?纯化后测得滴度为2.35 × 107 TU/ml?重组慢病毒感染血管内皮细胞EA.hy926,获得能稳定表达U94基因的细胞株EA.hy926－U94?CCK－8及小管形成实验结果显示EA.hy926－U94细胞与阴性对照细胞EA.hy926－NC?正常EA.hy926细胞相比,细胞增殖活性明显降低,小管形成能力变差?结论:成功建立了慢病毒介导的稳定表达U94基因的血管内皮细胞株,研究表明U94可以抑制内皮细胞的增殖及血管生成?     

VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。     

整合素β1小干扰RNA载体构建及其在表皮干细胞干扰效应检测

目的设计和构建整合素β1 (integrin β1)特异性的小干扰RNA表达载体,并初步验证其对靶基因的抑制作用.方法设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ-HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上.转染重组质粒到表皮干细胞,通过免疫印迹(Western blotting)实验检测靶基因的抑制情况.结果构建的小RNA干扰质粒siIntegrinβ1转染表皮干细胞能够抑制靶基因整合素β1的表达.结论成功构建了针对整合素β1的siRNA质粒,为进一步研究整合素在表皮干细胞增殖与分化调控中的作用奠定了基础.     

ZNF580过表达对内皮细胞血管内皮生长因子的表达及增殖能力的影响

【目的】研究人锌指蛋白新基因ZNF580过表达对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及增殖能力的变化,为探讨ZNF580基因功能提供科学依据。【方法】重组质粒pEGFP-ZNF580经LipofectamineTM2000脂质体转染法转染EA.hy926细胞,48h后荧光显微镜下观察ZNF580-EGFP在内皮细胞中的表达情况;应用半定量RT-PCR、Western blotting及ELISE法检测转染前后内皮细胞ZNF580和VEGFmRNA、蛋白表达的变化;运用MTT实验检测转染前后内皮细胞增殖能力的改变。【结果】荧光显微镜下示融合蛋白ZNF580-EGFP在EA.hy926细胞核中表达;ZNF580基因过表达后,内皮细胞VEGFmRNA及蛋白的表达均上调(P<0.05),且其增殖能力显著升高(P<0.01)。【结论】ZNF580可以调控EA.hy926细胞VEGF的表达,且ZNF580在内皮细胞增殖过程中具有重要的调节作用。     

重组慢病毒载体介导HIV-1 Nef蛋白对原发性渗出性淋巴瘤细胞系和血管内皮细胞增殖作用影响的初探

目的:构建含有HIV-1负调控因子(Nef)基因的重组慢病毒表达载体,并检测Nef蛋白在人胚肾293T细胞、体腔渗出性淋巴瘤细胞BCBL-1和人血管内皮细胞EA.hy926中的表达情况及其对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。方法:从本实验室已构建好的含Nef基因的重组真核表达质粒pCI-neo-Nef中扩增出Nef基因,插入到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs-Green中构建成pHAGE-Nef,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达并收集培养上清,此上清经0.45μm滤器过滤后即获得慢病毒悬液。梯度稀释法测定慢病毒滴度。将重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,用Western blot检测Nef蛋白的表达。通过细胞增殖实验检测Nef蛋白对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建了含HIV-1 Nef基因的重组慢病毒表达载体,病毒滴度为1×107 TU/ml。以重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.h...     

含KSHV vIL-6基因重组分泌型表达载体的构建及其分泌蛋白对内皮细胞增殖和血管生成能力影响的初探

目的:构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-assoliated herpesvirus,KSHV)致瘤基因vIL-6的重组分泌型质粒.将其导入内皮细胞系EA.hy926中进行表达,并检测vIL-6对内皮细胞增殖和血管生成作用的影响.方法:根据本实验室先前构建的pvIL-6 F表达载体中的核酸...     

整合素β1在人表皮细胞株HaCaT增殖中影响的研究

目的探讨β1整合素对表皮细胞增殖的影响.方法将重组整合素β1小干扰RNA表达载体(siIntegrin β1)转染到HaCaT细胞株中,应用免疫印迹(Western blotting)方法检测靶基因的抑制情况,应用细胞计数法检测表皮细胞增殖情况.结果重组siIntegrinβ1 转染HaCaT细胞株能够抑制靶基因整合素β1 的表达,抑制细胞增殖.结论在人表皮细胞株HaCaT中抑制整合素β1表达可抑制HaCaT增殖,为进一步研究整合素在表皮细胞中的基因表达调控奠定了基础.     

CASK在血管内皮细胞缺氧应激增殖反应中的作用

目的 建立钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase, CASK)剔降血管内皮细胞株,初步探讨其对短暂缺氧的反应性.方法 采用RNAi技术和脂质体介导的细胞转染技术,建立CASK表达下调的血管内皮细胞株,并观察缺氧应激条件下培养0(常氧)、1、3、6、12 h细胞增殖指数的变化.结果 血管内皮细胞在短暂缺氧后细胞增殖指数升高(常氧:42.93%,1 h:50.46%, 3 h:52.53%),随着缺氧时间延长增殖指数则低于常氧对照组(6 h:40.71%,12 h:25.18%).而CASK剔降血管内皮细胞株,在1～12 h缺氧应激时限内,其增殖指数无明显变化.结论 CASK剔降内皮细胞株与对照EA.hy926细胞比较,对短暂缺氧应激的增殖反应性减弱.     

miR-186海绵载体的构建及其在EA.hy926细胞株中的表达

目的：构建微小RNA-186（miR-186）基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法：化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度;FV040-control慢病毒作为对照组,FV040-miR-186-sponge作为实验组,分别感染EA.hy926细胞,筛选稳转细胞株;采用荧光定量PCR （qPCR）法检测空白对照组、FV040-control对照组及FV040-miR-186-sponge实验组中EA.hy926细胞miR-186的相对表达水平。结果：测序结果显示克隆的目的基因序列与设计的miR-186海绵体序列完全一致。在感染的EA.hy926细胞中观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达。FV040-control包装的慢病毒滴度为2×10⁸ TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge组慢病毒滴度为6×10⁸ TU·mL^-1;成功建立了稳定表达miR-186-sponge的EA.hy926细胞株,感染效率达95%;qPCR检测,与空白对照组和FV040-control组比较,FV040-miR-186-sponge组EA.hy926细胞中miR-186相对表达水平降低（P<0.01）。结论：成功构建了miR-186基因的海绵载体,建立了稳定下调miR-186表达的EA.hy926-miR-186-sponge细胞株。     

DEPP蛋白对血管内皮细胞的存活及基因表达的影响

目的:探讨孕酮诱导的蜕膜蛋白(decidual protein induced by progesterone,DEPP)在血管内皮细胞EA.hy926中的定位?对细胞存活及基因表达的影响?方法:构建表达人DEPP的重组腺病毒,测定病毒滴度并鉴定其表达的DEPP蛋白水平?用构建好的腺病毒感染EA.hy926内皮细胞,通过免疫荧光和Western blot确定DEPP蛋白在细胞中的定位?观察DEPP过表达对EA.hy926细胞存活的影响,用MTT法测定细胞的存活率,通过流式细胞仪检测EA.hy926细胞的坏死和凋亡情况?利用蛋白质芯片检测DEPP过表达时内皮细胞中血管发生相关基因表达水平的变化?结果:本研究成功构建了表达人DEPP蛋白的重组腺病毒?通过免疫荧光检测,发现DEPP蛋白呈全细胞分布?与过表达GFP的对照细胞相比,过表达DEPP时EA.hy926细胞明显皱缩?变圆,MTT检测显示细胞的存活率明显下降,流式细胞仪检测显示EA.hy926细胞感染腺病毒后细胞的坏死水平与对照组相比升高?蛋白质芯片检测发现,DEPP过表达导致内皮细胞中多种血管发生相关蛋白的水平发生明显改变?结论:DEPP蛋白的表达升高对血管内皮细胞有损伤作用,可能参与血管发生的调控过程?     

RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞系的建立

目的：构建RHBDF2基因过表达慢病毒载体,建立稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞,为RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞的建立提供依据。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成引物,PCR扩增RHBDF2基因后通过Gateway克隆技术将目的基因克隆至入门载体,再亚克隆至慢病毒载体pLV[Exp]-EGFP,构建重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2;将慢病毒表达载体质粒pLV[Exp]-EGFP和重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2分别与慢病毒辅助包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度;将感染pLV[Exp]-EGFP-control的EA.hy926细胞作为对照组,感染pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2的EA.hy926细胞作为实验组,利用嘌呤霉素筛选出稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞;荧光定量PCR （qPCR）和Western blotting法检测对照组和实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切电泳和测序检测,实验组过表达慢病毒载体的基因序列与设计合成的序列完全一致;对照组包装的慢病毒滴度为1×10⁸ TU·mL^-1,实验组慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1;荧光显微镜下慢病毒成功感染EA.hy926细胞,感染率达95%以上;qPCR检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA表达水平较对照组明显升高（P<0.01）;Western blotting法检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2蛋白表达水平较对照组明显升高（P<0.05）。结论：成功构建RHBDF2过表达慢病毒载体,利用pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒建立了稳定上调RHBDF2表达的EA.hy926细胞系。     

稳定表达人GM-CSF和IL-4 EA.hy926细胞株建立及对DC诱导作用

目的获得分别能稳定表达人白细胞介素4(IL-4)和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的内皮细胞株,并用于树突状细胞(DC)的体外诱导培养。方法构建重组的慢病毒表达载体,在293T细胞中进行慢病毒的包装,用获得的高滴度的慢病毒感染内皮细胞EA.hy926细胞株,建立能够高效、稳定表达IL-4和GM-CSF的EA.hy926细胞株。结果 EA.hy926细胞株感染效率达90%以上,长期传代仍能保持较高阳性率。RT-PCR在mRNA水平上检测目的基因有表达;ELISA和Western方法证实感染后细胞IL-4、GM-CSF在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的80倍和143倍。感染后细胞的生长状态良好,能够长期在体外进行传代培养,可以用于DC诱导实验。结论构建的细胞系可以稳定表达细胞因子IL-4和GM-CSF。     

促血管生成素-1对人胃癌细胞黏附和转移作用的研究

目的:探讨促血管生成素-1(Ang-1)对人胃癌细胞中整合素β1(integrin β1)和CD44V6的作用,研究其对肿瘤细胞黏附和转移的影响及可能的作用机制. 方法:利用腺病毒为载体,将已构建成功的、含Ang-1基因的重组腺病毒(Ad-Ang-1)瞬时转染人胃癌细胞株BGC-823,转染含绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-GFP)作为阴性对照,未转染的正常细胞作为空白对照,用细胞黏附法检测转染前后细胞与细胞外基质黏附率的改变,再分别用半定量RT-PCR和Western blot方法对3组细胞中整合素β1和CD44V6的mRNA和蛋白表达水平进行分析. 结果:细胞黏附实验显示,转染Ad-Ang-1后,细胞与细胞外基质之间的黏附率明显增强(P<0.01);RT-PCR、Western blot结果显示整合素β1、CD44V6 mRNA和蛋白的表达在Ad-Ang-1组明显高于空白对照组及Ad-GFP组. 结论:转染Ang-1能明显提高人胃癌细胞BGC-823中整合素β1、CD44V6 mRNA、蛋白的表达,从而促进肿瘤细胞的黏附和转移.     

人β2糖蛋白1的重组表达及对抗磷脂抗体综合征患者血清诱导内皮细胞产生ICAM-1的影响

目的：探讨重组人β₂糖蛋白1(hrβ₂-GP1)对抗磷脂抗体综合征(APS)患者血清诱导内皮细胞系产生细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的影响。 方法：应用pQE30表达载体表达hrβ₂-GP1,Western blotting对重组蛋白进行鉴定;应 用hrβ₂-GP1处理前后的APS患者血清分别与内皮细胞株EA.hy926共孵育,细胞ELISA和 RT-PCR方法分析处理前后EA.hy926表达ICAM-1的变化。 结果：成功构建pQE30-hβ₂-GP1,并对表达产物进行了纯化和鉴定,所获得的蛋白与预期的大小一致,并具有人β₂-GP1的抗原性;rhβ₂-GP1处理后的APS患者血清与处理前比 较,与其孵育的内皮细胞系EA.hy926表达ICAM-1在蛋白和mRNA水平均明显降低,这种抑制作用随着rhβ₂-GP1的浓度增加而逐渐增强。 结论：抗β₂糖蛋白1抗体(anti-β₂GP1)促进内皮细胞系EA.hy926表达ICAM-1, hrβ₂-GP1可中和此作用。     

对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后Survivin基因变化的研究

目的通过对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后观察Survivin基因的变化。方法设计两条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。RT-PCR,Western-blot检测转染后mRNA及蛋白表达。结果转染shRNA重组质粒可有效抑制HT-29细胞Survivin的表达,Survivin mRNA和蛋白表达下调,表明Survivin基因沉默效果较高;两个转染组之间相比pshRNA1组Survivin基因的表达量低于pshRNA2组。结论人结肠癌细胞株中的Survivin基因表达率可通过shRNA重组质粒转染而发生变化;siRNA1和siRNA2序列中Survivin基因表达量存在统计学意义,提示我们在今后有关Survivin基因靶向治疗研究中是否需要考虑到序列的选择以提高作用效果。     

靶向小鼠整合素β_1的shRNA表达载体构建及鉴定

目的构建小鼠整合素β1的shRNA表达载体,用RNA干扰下调整合素β1基因在小鼠支气管平滑肌细胞中的表达。方法设计并合成靶向小鼠整合素β1基因的shRNA表达载体,转染入哮喘小鼠的支气管平滑肌细胞,检测shRNA表达载体对靶基因的抑制效果。结果 shRNA表达载体能稳定转染小鼠支气管平滑肌细胞,转染后的整合素β1mRNA及蛋白质水平均显著下调。结论成功构建了靶向小鼠整合素β1高效、持久的shRNA表达载体,转染细胞后可下调整合素β1表达,为进一步研究整合素β1在哮喘气道重塑中的作用及其基因治疗奠定了基础。     

RNA干扰VEGF-C基因下调COX-2、Bcl-2表达对乳腺癌细胞凋亡的影响

 目的 利用人血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）小RNA干扰（siRNA）表达载体——重组质粒pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA,研究VEGF-C基因下调抑制COX-2、Bcl-2表达及对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435的体外作用。方法 pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA表达质粒和阴性对照质粒稳定转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-435、RT-PCR和Western blot检测转染前后VEGF-C、COX-2基因和VEGF-C、COX-2、Bc1-2蛋白的表达;MTT法和流式细胞仪检测VEGF-C RNA干扰对细胞的作用。结果 pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA转染乳腺癌细胞MDA-MB-435、VEGF-C基因和蛋白水平表达量明显降低,COX2和Bcl-2表达下调,细胞体外活性下降,72 h后凋亡率达60%。结论 针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体抑制VEGF-C表达的同时下调COX-2和Bcl-2的表达,促进乳腺癌细胞MDA-MB-435的凋亡。     

MTA1靶向RNA干扰对人肝癌HepG2细胞生物学行为影响的研究

目的 观察转移相关基因1(MTA1)特异性siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 体外构建2个MTA1特异性siRNA表达载体(pRNAi-1、pRNAi-2),实验分为脂质体对照、空质粒转染对照及MTA1 siRNA重组质粒转染组,转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量RT-PCR检测MTA1 mRNA表达情况,检验其对细胞的RNA干扰效果;采用MTT法分析其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测其对细胞周期的影响.结果 测序表明MTA1干扰序列完全正确;pRNAi-1与pRNAi-2表达质粒有效抑制肝癌细胞株HepG2细胞中MTA1的表达,MTT 法检测结果显示转染重组质粒组细胞体外生长的抑制率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01);流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01).结论 成功构建了MTA1干扰真核表达载体,重组MTA1特异性siRNA质粒可抑制肝癌细胞中MTA1的表达,并抑制肝癌细胞生长,促进其凋亡.     

siRNA对VEGFR2的表达抑制及对HL60细胞和人内皮细胞的影响

 【目的】为探索治疗白血病的新思路研究了小干扰RNA（siRNA）对肿瘤细胞株HL60和人血管内皮细胞（EC）株EA·hy926血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因表达的抑制作用。【方法】制备并筛选VEGFR2基因的最有效siRNA，并据此设计shRNA寡核苷酸链，构建pENTR^TM／U6干扰表达载体。瞬时转染细胞．采用MTF法、RT-PCR法及Western blot测定VEGFR2表达抑制情况。【结果】VEGFR2 siRNAa、b、c抑制HL60细胞效率分别为77．5％、45．0％、80．9％，以siRNAc最高，利用其shRNA和pENTR^TM／U6构建的入门克隆转染HL60，抑制细胞效率达99．1％；此入门克隆对VEGF＆基因mRNA和蛋白的表达抑制在HL60和EA·hy926细胞均显著。【结论】在体外shRNA表达载体可有效抑制HL60细胞VEGFR2自分泌和旁分泌，有效抑制白血病细胞生长。     

HHV-8 K13基因编码蛋白在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞系中的表达及其对细胞增殖影响的初探

目的:研究人类疱疹病毒8型(HHV-8)K13(v-FLIP)基因编码蛋白分别在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞中的表达及其对上述两种细胞增殖能力的影响.方法:将PEF-K13-Flag-IRES/Pure重组质粒瞬时转染人血管内皮细胞系EA.HY926细胞和前列腺癌细胞系PC-3细胞,采用Western blot方法检测...