川芎转录组SSR分析与EST-SSR标记的开发

该研究通过组装川芎根转录组数据获得24 422个unigene,随后对得到的unigene进行了SSR检测,共检测到4 073个SSR位点。对检测到的EST-SSR进行特征分析,结果显示单核苷酸重复最多,占41.0%。SSR所在序列功能注释结果显示在Nr中有2 201条序列能够被注释,同时SSR所在序列还被注释到49个GO分类和242个KEGG代谢通路中。利用SSR检测结果进行了EST-SSR标记开发,合成其中235对引物进行验证,74对扩增效果较好。利用74对EST-SSR引物对34个川芎资源进行遗传多样性分析,结果显示收集的川芎资源多样性较好,UPGMA聚类显示川芎资源分为两大类,聚类结果表现出一定的地域性,PCo A分析与UPGMA聚类结果类似。该研究首次对川芎进行EST-SSR分析和标记开发,对推动川芎资源遗传多样性研究、品种纯度检测、基因定位和分子育种等具有重要意义。     

三种水蛭的薄层色谱与电泳法鉴别

中国的水蛭近百种,与医药有关的有十几种。《中国药典》(1990年版)收载了三种:(1)蚂蟥(宽体金线蛭,Whitmania pigra Whitman):(2)水蛭(日本医蛭,Hirudo nipponica Whitman);(3)柳叶蚂蟥(尖细金线蛭,Whitmaninia acranulata Whitman)。其中宽体金线蛭和尖细金线蛭是非吸血水蛭,日本医蛭是吸血小蛭。关于它们的理化鉴别方法,文献上未见报道。本文研究了日本医蛭和菲牛蛭Poecilobdella javanica及宽体金线蛭的薄层层析(TLC)、电泳(SDS-PAGE)鉴别方法。     

七种水蛭抗血小板聚集与抗凝血研究

七种水蛭体外抗血小板聚集与抗凝血实验研究结果表明，日本医蛭、菲牛蛭、湖北牛蛭在两方均有明显的作用。尖细金线蛭与宽体金线蛭的水煎提取物具有较强的抗血小板聚集作用，尖细金线蛭与光润金线蛭抗凝血作用较好，而宽体金线蛭、尖细金线蛭和光润金线蛭的超声提取物则表现促血小板聚集的作用。     

四种不同品种水蛭生物活性的研究与比较

目的:应用3种酶活性抑制方法测定四种不同品种水蛭的生物活性,为评价水蛭药材质量提供科学依据。方法:分别采用抗凝血酶、抗胰蛋白酶和抗糜蛋白酶3种检测方法,测定了宽体金线蛭、日本医蛭、欧洲医蛭、菲牛蛭样品的生物活性。结果:4种水蛭中,吸血水蛭具有更好的抗凝血酶活性;4种水蛭均具有较好的抗胰蛋白酶和抗糜蛋白酶生物活性。结论:3种酶活性抑制方法可作为水蛭类药材质量控制的依据。     

生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性测定的研究

 目的 将生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性的测定,探讨反映水蛭生物活性的质量控制方法。方法 采用肝素钠作为对照品,选择活化部分凝血酶时间值作为抗凝活性评价依据,对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭的抗凝活性进行测定,测定结果分别用标准曲线法和生物检定统计法计算。结果 4种水蛭活性部分凝血酶时间法的量效关系曲线与肝素的量效关系曲线类似,突跃范围呈平行关系,上述特点符合生物检定的要求,以肝素钠作为标准品,采用生物检定技术活性部分凝血酶时间法测定水蛭等的抗凝活性是可行的。结论 活化部分凝血酶时间值可以全面反映水蛭的抗凝血作用,测定结果对临床使用更具指导意义。生物检定技术应用于中药质量评价,是对现有中药质量标准控制方法良好的补充。     

微山湖地区宽体金线蛭的群体考察与产茧后药材质量评价

目的:建立科学的宽体金线蛭种蛭筛选原则,并对产茧后药材进行质量评价。方法:从微山湖地区采集野生宽体金线蛭1193条,对体质量和生殖环带发育等群体特征进行考察。将种蛭分为10、15、20 g 3个试验组,建立卵茧成熟度观察方法以判断适宜的挖茧时机,通过产茧数、茧体积、出苗数等指标考察体质量对宽体金线蛭繁殖性能的影响。依照2015年版《中华人民共和国药典》对产茧后水蛭药材的性状和抗凝血酶活性进行质量评价。结果:微山湖地区宽体金线蛭野生种群的体质量普遍较小,15 g及以上的种蛭仅占样本群体的19.53%;宽体金线蛭的繁殖性能随种蛭体质量的增加而显著提高,20 g试验组的产茧数(5.9个)和出苗数(37.3条)分别是10 g试验组的1.59倍和1.45倍。产茧后种蛭的死亡率和体质量损失率可高达37%和59%,药材厚度仅为产茧前的49%～72%,腥味散失严重、脆度下降,但产茧前后抗凝血酶活性变化不大,均为3～5 U·g~(-1)。结论:微山湖地区野生宽体金线蛭的种群有退化趋势,建议使用15 g及以上的种蛭进行繁殖生产。产茧后药材的商品规格和等级较低,不适宜作为饮片直接用于临床。     

基于蛋白免疫印迹的水蛭抗凝活性成分研究

目的：建立Native-PAGE结合Western blot检测水蛭活性多肽与凝血酶相互作用产物的方法,探究水蛭有效抗凝成分。方法：本研究分别提取宽体金线蛭、日本医蛭两种水蛭虫体总蛋白及日本医蛭唾液蛋白,用凝血酶滴定法测定其抗凝血酶活性,Western blot检测凝血酶-活性多肽复合体。结果：研究发现两种水蛭Native-PAGE-WB均检测到凝血酶-活性多肽复合体,且SDS-PAGE-WB检测到复合体变性后产生凝血酶条带。结论：建立的Native-PAGE-WB法可有效检出水蛭活性多肽和凝血酶相互作用产物,且发现同水蛭素类似,宽体金线蛭活性抗凝多肽与凝血酶在体外也能形成稳定的蛋白复合体。     

多花黄精转录组SSR位点分析及分子标记开发

目的基于转录组测序数据鉴别和分析多花黄精EST-SSR位点,开发可用于多花黄精种质资源评价与利用的SSR标记。方法利用MISA工具从多花黄精转录组126 544条Unigenes中鉴定SSR位点并进行分析;利用Primer 3.0设计SSR引物,随机选择50对SSR引物进行有效性验证。结果从9 982条Unigenes中鉴定出12 317个包含2～6个核苷酸重复类型的SSR位点,SSR的分布频率为9.73%,发生频率为1/5.91 kb;SSR位点中的主导类型是二核苷酸重复,占总SSR的53.14%,其次是三核苷酸重复,占33.31%。SSR引物的有效性筛选显示,50个SSR引物对中有29个(58%)可从多花黄精中扩增出预期大小的SSR条带。SSR荧光标记的毛细管电泳检测显示在多花黄精的7个SSR位点共鉴定出了9种基因型,进一步验证了SSR引物的有效性。结论多花黄精转录组SSR位点出现频率高,重复类型丰富,多态性较高,这将为多花黄精遗传多样性分析和遗传图谱构建提供大量有价值的候选标记,也可为黄精属内种间物种的分子鉴别、多花黄精优良品种的分子辅助育种提供技术手段。     

水蛭抗凝抗血栓活性及其与品种、提取方法的关系

水蛭为环节动物门蛭纲动物,《中国药典》收载了水蛭科动物蚂蟥（宽体金线蛭,Whitmania pigra Whitman）、水蛭（日本医蛭,Hirudo nipponica Whitman）、柳叶蚂蟥（尖细金线蛭,Whitmania acranulata Whitman）三个品种。水蛭有破血、逐血、通经的功效,用于瘕瘕痞块,血瘀闭经,跌扑损伤。水蛭具有抗纤溶、抑制血小板活化、抗血栓、改善血液流变性、降晤和抗动脉粥样硬化等药理作用。本文着重综述水蛭的抗凝抗血栓活性,分析水蛭抗凝血活性与品种、提取方法的相关性。     

蒙古黄芪转录组SSR标记开发及遗传多样性研究

为开发蒙古黄芪新的SSR标记及为黄芪分子标记辅助育种提供有力工具,该研究利用MISA软件对蒙古黄芪转录组测序序列长度在1 kb以上的18 040条unigene进行SSR位点信息搜索、分析,利用Primer 3设计SSR特异引物并随机选择110对引物进行验证。结果显示在蒙古黄芪转录组共搜索到5 640个SSR,分布于4 462条unigene,SSR位点出现频率为31.26%,平均每6 514 bp含1个SSR位点。SSR位点中单核苷酸重复是主要类型,占总SSR的36.72%,其次是三核苷酸重复和二核苷酸重复,分别占32.57%,27.73%。在SSR位点所包含的75种重复单元中,A/T(2 026)出现频率最高,AG/CT(1 179),AAG/CTT(477)次之。随机选择合成的110对引物中有97对(88.18%)可以扩增出条带,选择条带清晰稳定的19对引物,利用UPGMA作图,将20个样品分为2类。可见蒙古黄芪转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富,大量的SSR为其遗传多样性分析、分子鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等研究提供了丰富的候选分子标记。     

中药水蛭品种考证及资源可持续利用发展探讨

该文通过系统地本草文献梳理与研究指出,传统中医使用的水蛭是生于水中,个头较小且能吸食人及牛马血的水蛭.具有这些特性的水蛭的品种有日本医蛭Hirudo nipponia Whitman、丽医蛭H.pulchra Song、南京牛蛭Poecilobdella nanjingensis sp.Nov.、菲牛蛭P.manillensis (Lesson)以及湖北牛蛭P.hubeiensis Yang 5个品种,与2010年版《中国药典》水蛭项下所规定的动物品种来源不完全一致.建议《中国药典》修改并补充水蛭的品种来源,保留原有日本医蛭H.nipponica Whitman,增补菲牛蛭P.manillensis (Lesson),暂时保留宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman、尖细金线蛭W.acranulata Whitman,并进一步加强丽医蛭H.pulchra Song、南京牛蛭P.nanjingensis sp.Nov.以及湖北牛蛭P.hubeiensis Yang的化学成分和药理作用以及资源分布的研究,以待作为药用品种补充.     

蚂蟥和水蛭种间遗传变异和系统 关系的ITS序列分析

目的:为了阐明蚂蟥Whitmania pigra,水蛭Hirudo nipponia种间遗传分化系统关系.方法:运用TTS测序分析我国不同地区蚂蟥W.pigra、水蛭H.nipponia核糖体TTS碱基序列差异,用MEGA4.0软件中的MP法构建的分子进化树.结果:蚂蟥和水蛭平均总TTS序列长度在857.2～861.2 bp,其碱基A,T,G,C的平均分别为25.12%,28.28%,17.34%,29.29%.GC含量明显高于AT含量.通过对蚂蟥、水蛭TTS基因片段遗传特征的研究发现其种内变异很小,在14个群体中有45个位点发生转换.MP系统树将14个种群蚂蟥和水蛭分为两大类群.结论:蚂蟥和水蛭的变异类型可能为种内变异为主.同时发现,基于DNA序列的蚂蟥及水蛭的系统分类结果与分类学的分类结果不完全一致,可能是由TTS序列在进化过程中发生了少量位点的变异,如碱基之间的转换、颠换和缺失等造成的.     

水蛭的本草考证及其鉴别要点研究

水蛭是一种常用的珍贵动物类中药,具有很高的药用价值。近年来,随着需求增加,价格攀升,市场上出现了水蛭的混淆品。通过收集活体水蛭样本,对照动物分类学专著、本草著作及鉴别研究报道,发现并确认市场上流通的2种水蛭混淆品为湖北牛蛭Poecilobdella hubeiensian Yang和棒纹牛蛭P. javanica （Wahlberg）,以期为鉴别研究和临床安全用药提供参考。     

水蛭饮片规格质量的调查及实验研究

调查及实验证明,水蛭以蚂蟥为主流药用品种。切丝入药溶出效果最优。对水蛭3种炮制品的质量从浸出物限量、薄层层析、蛋白电泳、体外抗凝效价方面进行了定量、定性研究。     

卷丹及主要食用百合EST-SSR鉴别体系的构建

目的开发卷丹Lilium lancifolium、兰州百合L. davidii var. willmottia、岷江百合L. regale、香水百合L. casa和龙牙百合L. brownie var. viridulum的EST-SSR分子鉴别体系,分析EST-SSR分子标记技术对百合近缘种的开发效率和鉴别能力。方法利用MISA.pl程序对NCBI公布的百合属EST基因序列进行SSR位点的识别,通过Primer3程序模块批量生成EST-SSR引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初筛,用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证初筛引物,标记并分析不同种质的特征泳带,构建鉴别体系。结果共设计了199对SSR引物,经过26对引物的筛选,获得了2对高效鉴别引物,其中引物JZ391构建的分子鉴别体系,可有效鉴别混掺的商品百合,具有一定的实用价值。结论基于研究材料具有极端的遗传特征,本实验鉴定标记开发非常高效,研究结果证实了物种的遗传基础是影响其EST-SSR分子标记开发效率的重要因素,同时,该案例可为其他类似百合遗传基础的中药材进行EST-SSR标记开发,提供参考尺度。     

不同养殖密度和换水频率对蚂蟥生长和内在品质影响的研究

采用生物量测定、3,5-二硝基水杨酸比色法、对-棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法、福林-酚法等方法研究不同养殖密度和换水频率对蚂蟥生长、消化酶活性、生化指标和内在品质的影响。结果表明:蚂蟥的最终质量,特定生长率(SGR),增重率(WGR),淀粉酶,脂肪酶,蛋白酶活力,SOD,CAT,ALP酶活性与密度呈反比,与换水频率呈正比(P0.05);换水频率与水中氨氮、亚硝酸盐和硫化氢呈负相关,与溶氧量呈正相关;养殖密度和换水频率对蚂蟥水分、总灰分、酸不溶性灰分、p H和抗凝血酶活性影响不显著。因此,每亩50万条为较适宜的养殖密度,每72 h 1次为较适宜的换水频率。     

桂郁金EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

目的:分析桂郁金EST中SSR位点分布规律,开发桂郁金EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于桂郁金品种遗传多样性的可行性。方法:从NCBI公共数据库下载姜黄属EST序列(expressed sequence tag,EST)12 678条,利用MISA软件对其进行SSR位点查找,选出符合条件的序列,采用Primer 5.0软件设计EST-SSR引物,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳研究这些EST-SSR引物PCR扩增的特点,进一步验证开发结果的合理性与有效性。结果:下载得到的12 678条EST序列中,共有926条序列包含SSR位点,占整个EST数据库的7.30%,其中SSR位点所占比例最大的是二核苷酸重复序列,三核苷酸和四核苷酸次之,分别为623(50.90%)个,388(31.70%)个和125(10.21%)个。根据筛选得到的微卫星序列共设计了165个EST-SSR引物对,选择其中92分以上的24个合成。PCR检测表明,21个引物对(87.50%)可以扩增出稳定清晰的带型;在6份不同种质桂郁金中检测到13对EST-SSR引物有多态性,占设计引物的54.17%。利用13对验证的EST-SSR引物对20个桂郁金品种进行了亲缘关系分析。结论:桂郁金EST-SSR标记开发的效率较高,是桂郁金SSR标记开发的重要措施,对于桂郁金品种鉴定和遗传多样性分析以及育种等方面具有重要的意义。