创伤弧菌溶细胞素体外诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及其在细胞中的定位

目的 了解创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnifru,cytolysin,WC)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡作用及其机制.方法 采用PCR扩增创伤弧菌GTC333株VVC编码基因vvhA,T-A克隆后测序并构建vvhA基因原核表达系统E.coli BL21DE3pET-42a-vvhA.采用Ni-NTA亲和层析法提纯目的 重组蛋白rVVC,SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统确定rVVC表达量及提取物纯度.采用溶血试验检测rVVC溶解兔红细胞的活性.2,4-二硝基苯肼比色法和四苯硼钠比色法分别测定rVVC作用的HUVEC培养物上清中乳酸脱氢酶(LDH)和K+含量.采用流式细胞术检测rVVC诱导HUVEC凋亡的作用.将FITC标记rVVC,采用激光共聚焦技术对HUVEC中的FITC标记rVVC进行定位.结果 与GenBank中相关序列比较,所克隆的vvhA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.09%和98.26%.1μg/ml的rVVC即可溶解兔红细胞(P<0.01).10 μg/ml的rVVC可引起HUVEC培养物上清中K+含量明显增高(P<0.01),但LDH含量无明显改变(P>0.05).1～100μg/ml的rVVC作用2 h可使HUVEC凋亡.在FITC标记rVVC作用HUVEC 5～240 min内,rVVC逐渐从细胞膜表面向膜内侧和胞浆内移行,作用30 min时多数rVVC进入细胞.结论 rVVC具有溶细胞素活性.VVC可进入HUVEC,诱导细胞凋亡是其损伤HUVEC的主要机制.     

创伤弧菌溶细胞素融合蛋白对人Caco-2细胞IL-8基因表达和IL-8分泌的影响

目的 研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)对人肠上皮细胞(human intestinalepithelial cell,Caco-2)IL-8基因表达的影响.方法 IPTG诱导、表达、纯化、复性及Western blot鉴定rVvhA表达和纯化情况;CCK-8法检测rVvhA对Caco-2的细胞毒性作用;RT-PCR检测rVvhA诱导Caco-2细胞IL-8基因的表达情况;ELISA检测Caco-2细胞培养上清IL-8的分泌情况.结果 Ni~(2+)-NTA亲和层析柱对rVvhA进行纯化后纯度可达95%以上;CCK-8结果显示rVvhA活性蛋白显著降低了Caco-2细胞的存活率,有效浓度为1.5 HU/ml(P<0.05);RT-PCR结果显示,0.6 HU/ml rVvhA30 minllp可诱导Caco-2细胞IL-8 mRNA基因表达上调;ELISA结果显示,Caco-2细胞经rVvhA作用后,培养液上清中IL-8多肽的表达时相在4 h.RT-PCR与ELISA结果皆显示,IL-8基因的转录及IL-8表达皆具有时间-剂量依赖性.结论 rVvhA在转录水平上能诱导人Caco-2细胞IL-8 mRNA表达,促进IL-8的合成,在创伤弧菌引起的过度炎症反应和败血症的发生、发展中可能具有重要意义.     

钙离子对重组创伤弧菌溶细胞素诱导THP-1细胞损伤的影响机制

目的 研究重组创伤弧菌溶细胞素( rVvhA)诱导人单核细胞白血病细胞(THP-1)的凋亡机制及其Ca2+的变化.方法 采用CCK-8法、激光共聚焦显微镜结合Fluo 3/AM法、流式细胞术结合AnnexinV -PI标记等检测rVvhA对THP-1细胞的影响,并观察胞内Ca2+浓度变化.结 果rVvhA可诱导THP-1细胞发生凋亡并引起细胞内Ca2+浓度升高,细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM处理组胞内钙离子升高幅度远高于细胞外钙离子螯合剂EGTA处理组.结论 rVvhA具有诱导THP-1细胞凋亡的生物学活性,并能引起细胞内Ca2+浓度升高,升高的Ca2+主要源于胞外钙离子内流.     

创伤弧菌溶细胞素融合蛋白细胞毒活性相关分子机制研究

目的 研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVVC)诱导人ECV304细胞(人脐静脉内皮细胞)凋亡过程中Caspase-3,-8,-9活性变化.方法 应用MTT法、Hochest33342/PI荧光双染、流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳分析rVVC对人ECV304细胞诱导凋亡的影响;比色法测定rVVC诱导人ECV304凋亡过程中Caspase-3,-8,-9活性变化.结果 MTT结果显示rVVC具有降低人ECV304细胞的存活率活性;浓度为2.0溶血单位(HU)/ml的rVVC作用人ECV304 12 h后,其诱导凋亡的活性高于对照组和浓度为0.5 HU/ml的 rVVC处理组,具有剂量依赖性;浓度为2.0 HU/ml rVVC处理组加40 μmol/L Caspase全酶抑制剂(Z-VAD-FMK)后凋亡率较2.0 HU/ml rVVC处理组有一定程度降低.浓度为2.0 HU/ml rVVC处理人ECV304细胞0.5 h后Caspase-3活性开始增高,于3 h达高峰,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),Caspase-8,-9活性无明显变化.结论 rVVC对人ECV304具有凋亡诱导的生物学活性,Caspase-3可能与活性rVVC诱导的人ECV304凋亡有关.     

创伤弧菌溶细胞素融合蛋白对小鼠单核巨噬细胞产NO及其合酶的影响

目的 研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)对小鼠单核-巨噬细胞(J774A.1)产生一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法 应用MTT法检测rVvhA对J774A.1增殖的抑制作用;Griess法检测NO含量;RT-PCR和免疫荧光法检测iNOS mRNA和蛋白表达水平.结果 0.8 HU/ml及以上浓度rVvhA可显著抑制J774A.1的增殖;在IFN-γ的辅助作用下,0.4 HU/ml的rVvhA即可诱导J774A.1产生大量NO,显著增加细胞内活性以及iNOS mRNA和蛋白表达水平.结论 rVvhA可诱导巨噬细胞产生NO和iNOS表达,在创伤弧菌的致病机制中具有重要意义.     

线粒体损伤在创伤弧菌诱导树突状细胞凋亡中的作用

 目的：探讨线粒体损伤在创伤弧菌（Vibrio vulnificus,Vv）诱导树突状细胞（dendritic cell,DC）凋亡过程中的作用及其可能机制。方法：建立Vv 1.1758与DC2.4细胞混合培养模型。采用扫描电镜和透射电镜观察创伤弧菌侵入细胞方式和细胞线粒体病变情况。荧光探针DCFH-DA和Fluo-8/AM分别检测侵入细胞内活性氧（ROS）和Ca2+离子水平。流式细胞术检测细胞线粒体膜电位和细胞凋亡情况。采用Western blotting检测NF-κB p65和TNF-α蛋白的表达。结果：Vv 1.1758可诱导DC2.4细胞凋亡。Vv 1.1758以菌体一端与细胞表面结合的方式侵入细胞,侵入细胞的线粒体有明显病变,细胞内ROS和Ca2+水平升高,线粒体膜电位降低。共培育1 h,NF-κB p65蛋白即开始升高,5 h达高峰,6 h稍有下降;TNF-α蛋白则在共培育2 h开始增高,6 h达高峰。结论：线粒体损伤在Vv诱导DC凋亡中发挥作用,其作用机制可能与细胞内ROS和Ca2+水平升高、线粒体膜电位降低有关,NF-κB p65和TNF-α可能是细胞凋亡过程中的重要信号分子。     

人可溶性B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:钓取人B细胞刺激因子基因,构建其表达的大肠杆菌工程菌,并体外表达、纯化可溶性B细胞刺激因子方法:从人外周血单个核细胞(PBMC)中提取总RNA并逆转录得到cDNA,用PCR扩增目的基因,连接到原核生物表达载体pET-30a上。制备质粒后,酶切、进行菌落PCR及DN测序对其进行鉴定。然后转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达对纯化的目的蛋白进行肽质量指纹分析、鉴定,并进一步做体外B细胞刺激试验。结果:RT-PCR钓取出可溶性B细胞刺激因子基因片段。DNA测序结果与报道序列完全一致。在IPTG诱导下,目的基因在工程菌中表达。利用镍金属螯合琼脂糖凝胶亲和层析柱分离。纯化目的蛋白的肽质量指纹图经Mascot搜索与B细胞刺激因子吻合。纯化的蛋白在体外可刺激B细胞增殖。结论:成功地克隆可溶性B细胞刺激因子基因,表达的纯化目的蛋白是具有生物学活性的B细胞刺激因子。     

创伤弧菌感染树突状细胞的定位及对细胞骨架影响的实验研究

目的 探讨创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)感染小鼠树突状细胞株的侵袭过程、定位及其对细胞器的损伤与影响.方法建立Vv1.1758株侵入DC2.4细胞模型,电子显微镜观察不同时间段细菌定位、细胞形态及细胞器的变化过程;荧光显微镜观察细胞骨架—微丝、微管重排情况.结果 Vv1.1758株以双位点胞饮方式...     

创伤后应激障碍的因子结构:对地震灾区青少年PCL数据的分析

目的:通过分析创伤后应激障碍检查表(PCL)的潜在因子结构,来探讨创伤后应激障碍的症状分类特征.方法:采用创伤后应激障碍检查表(The PTSD Checklist,PCL)测试了560名受汶川地震影响的初中生,并通过验证性因素分析比较了7个竞争模型.结果:由King等提出的再体验、回避、情感麻木和警觉一阶4因子相关模型拟合数据最好.结论:创伤后应激障碍检查表(PCL)是一个一阶4因子相关结构:中国人对创伤后应激的情感体验有着与西方人相似的结构,提示PTSD的4因子结构具有跨文化的普适性.     

截短型人骨保护素在CHO-DHFR-细胞中的表达及活性测定

目的:构建截短型人骨保护素(hTOPG)哺乳动物表达载体pcDNA3.1/DHFR-hTOPG, 实现其在CHO-DHFR-细胞中的高效表达, 获取生物活性较高的重组蛋白.方法:利用基因重组技术构建重组表达载体pcDNA3.1/DHFR-TOPG, 按LipofectamineTM 2000试剂盒说明书转染CHO-DHFR-细胞, 以含50 mL/L透析血清的IMDM培养基培养, 氨甲喋呤(MTX)加压筛选高表达细胞株, ELISA法和RT-PCR法测定重组蛋白和基因的表达, 并采用破骨细胞样细胞(OLC)诱导分化抑制实验测定重组蛋白的体外活性.结果:重组蛋白的表达量最高可达6 mg/L·72 h , 且能够明显抑制OLC生成(P<0.05).结论:截短型人OPG在CHO-DHFR-细胞中成功高效表达, 并具有良好的生物学活性, 为进一步的实验研究和临床应用提供了基础.     

OPG与MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人骨保护素（OPG）成熟肽段编码区基因，并在大肠杆菌中表达。方法 采用RT－PCR法，扩增人OPG成熟肽段编码区cDNA，并克隆入原核表达载体pMAL-c2x中，转化BL21（DE3）PlysS大肠杆菌感受态细胞，经0.1mmol/L IPTG诱导后，收集菌体蛋白，进行SDS－PAGE及Western blot鉴定。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，以构建的原核表达载体pMAL-OPG转化菌株后，可表达人OPG和麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白，相对分子质量（M）为85000。表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的13％。Western blot表明，融合蛋白能与抗人OPG多克隆抗体特异性结合。结论 获得人OPG成熟肽全长cDNA，并在大肠杆菌中以OPC－MBP融合蛋白的形式表达。     

葡萄球菌蛋白A"ZZ"与EGFP的融合表达及活性测定

目的 将EGFP基因与葡萄球菌蛋白A（SPA）基因的龙结构域重组，尝试以融合标记的方式构建一种新型免疫亲和试剂。方法 利用基因工程技术将EGFP基因重组至pEZZ18质粒，构建原核分泌表达载体pEZZ-EGFP，通过竞争ELISA和荧光光谱测定其在大肠杆菌中表达产物ProZZEGFP的生物学活性。结果 pEZZ-EGFP在E．coli HB101中正确表达，所表达融合蛋白具有与哺乳动物IgG抗体结合的生物学活性和EGFP的荧光活性。结论 ProZZ—EGFP融合蛋白有忽结构域（SPA）和EGFP二者生物学特性，在免疫荧光测定中可作为一种通用亲和试剂。     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。     

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL-10。方法 限制性内切酶Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切目的基因IL-10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL-10／pET32a,测序正确后转化E.coli BL21（DE3）,不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDS-PAGE和Westem blot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC／9细胞增殖法分别测定 IL-10的含量及生物学活性。结果 构建的表达重组载体IL-10／pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL-10-Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westem blot鉴定存在有目的蛋白IL-10,MC／9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论 成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL-10-Trx,有助于下游纯化和制备hIL-10基因工程药物。     

人乳头瘤病毒16型L1/E7融合蛋白在原核细胞中的表达及免疫效果观察

目的构建能表达L1E7融合蛋白的原核表达菌株,纯化蛋白,并观察其免疫效果。方法用PCR方法分别扩增出C末端部分缺失的HPV16L1基因和HPV16E7编码基因N端部分序列。将上述基因连接,构建融合基因L1ΔCE7N并将其插到原核表达载体pGEX-2T中进行融合蛋白表达纯化,然后观察其免疫效果。结果L1ΔCE7N融合基因测序结果表明,序列与设计相符,读码框架正确。将其插入原核表达质粒在大肠埃希菌中获得高效表达;经Wester-Blot鉴定在相对分子质量约85×103处有特异性表达带,与预期相符。用亲和层析和分子筛可纯化L1ΔCE7N融合蛋白,将其免疫C57BL/6小鼠,结果表明融合蛋白能诱发高滴度L1、E7抗体,并能保护小鼠免受TC-1肿瘤细胞的攻击。结论本实验在原核系统中高效表达并纯化了L1ΔCE7N融合蛋白,该蛋白可作为预防和治疗HPV16感染以及相关肿瘤的候选疫苗株。为研制HPV16预防治疗性疫苗探索一条经济、易普及的途径。     

组蛋白脱乙酰化酶GST-HDAC1融合蛋白载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建GST-HDAC1融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法以质粒pcDNA3.1- HDAC1为模板进行PCR,通过EcoR1单酶切位点将HDAC1插入p GEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-HDAC1,并转化点coli DH5 α,通过利用载体上的BamH1酶切位...     

跨膜型超抗原SEA融合蛋白的表达及其对小鼠黑色素瘤的免疫治疗作用

目的 制备跨膜型超抗原融合蛋白，研究该蛋白制备的肿瘤疫苗的抗肿瘤作用。方法 用已构建的重组跨膜型超抗原的表达载体pET-28a-TM-SEA转化E．coli BL21(DE3)pLys宿主菌，在IPTG诱导下产生目的蛋白；用Ni-NTA His Bind Resin纯化带有His-Tag的目的蛋白。采用免疫组化法、免疫荧光法和流式细胞术检测其对细胞膜的锚定作用。建立C57BL／6小鼠的黑色素瘤模型，观察跨膜型超抗原SEA融合蛋白制备的肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。结果 跨膜型超抗原融合蛋白能够锚定在肿瘤细胞膜上。融合蛋白制备的肿瘤疫苗能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长其生存期。结论 跨膜型超抗原融合蛋白制备的肿瘤疫苗具有较强的抗肿瘤作用，有可能作为一种有效的新型疫苗用于肿瘤的治疗和预防。     

Expression of human globular adiponectin-glucagon-like peptide-1 analog fusion protein and its assay of glucose-lowering effect in vivo

In this study, human globular adiponectin-glucagon-like peptide-1 analog (gAd-GLP-1-A) fusion protein was expressed and its glucose-lowering effect was measured in vivo. We constructed a prokaryotic expression vector PET28a-gAd-GLP-1-A and transformed the vector into Escherichia coli BL21 (DE3). A recombinant fusion protein of about 25KD was expressed from BL21 (DE3) cells after isopropylthio-β-D-galactoside induction. This protein was N-terminal His-tagged gAd-GLP-1-A fusion protein. Most of the protein was expressed in inclusion body. The fusion protein in inclusion body was purified by using High-Affinity Nickel Iminodiacetic Acid Resin and refolded in urea gradient refolding buffer. The refolded protein was incubated with enterokinase to remove the N-terminal His-tag. The fusion protein without His-tag is gAd-GLP-1-A fusion protein, which exhibited significant glucose-lowering effect in diabetic mice.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA-Stx2B融合蛋白的克隆、表达及生物学活性研究

目的 重组表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA与Stx2B融合蛋白,并对其生物学活性进行初步研究.方法 采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因及stx2B基因,两基因通过连接子(linker)相连,T/A法克隆,克隆至pET-28a(+)表达载体上,转化宿主细胞E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,免疫印迹分析免疫反应性.用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,检测其免疫原性,然后对免疫小鼠进行O157活菌攻毒试验和O157超声上清致死保护试验.结果 构建的espA-stx2B融合基因片段的测序结果 与理论预测值完全一致.融合蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约40%.免疫印迹显示融合蛋白能分别与EspA和Stx2B抗体发生抗原抗体反应.免疫小鼠其特异性抗体阳转率达100%,EspA和Stx2B抗体的几何平均滴度(GMT)分别增长了124.30倍和58.49倍.免疫小鼠O157活菌攻毒保护试验免疫后排菌时间和排菌量与对照组相比并没有明显改变,O157菌超声上清致死保护试验免疫组存活率为10/15,对照组全部死亡.结论 在E. coli中高效表达了EspA-Stx2B融合蛋白,此融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,融合蛋白免疫小鼠并不能降低细菌在小鼠胃肠道的黏附与定植,但却起到明显的免疫保护作用,保护率为66.7%(10/15).