IL-2基因转导CD3AK细胞免疫学功能的研究

目的观察白细胞介素-2(IL-2)基因转导后CD3AK细胞免疫学功能的变化。方法应用逆转录病毒载体将IL2基因转导入CD3AK细胞。检测转导细胞中特异性NeoR基因、培养上清IL2的表达水平及转导CD3AK细胞的体外增殖活性、细胞毒活性和细胞表型。结果从转导细胞mRNA中扩增出长度为347bp的特异性NeoR基因片段,转导细胞培养上清的IL2表达水平显著增高,体外增殖活性和细胞毒活性均强于未转导组细胞,CD4+/CD2+值升高。结论PLIL2SN逆转录病毒转导CD3AK细胞后,IL-2基因得到表达并增强CD3AK细胞的免疫学功能。     

IL-2基因转导CD3AK细胞免疫学功能的研究

目的 :观察白细胞介素 2 (IL 2 )基因转导后CD3AK细胞免疫学功能的变化。方法 :应用逆转录病毒载体将IL 2基因转导入CD3AK细胞。检测转导细胞中特异性NeoR 基因、培养上清IL 2的表达水平及转导CD3AK细胞的体外增殖活性、细胞毒活性和细胞表型。结果 :从转导细胞mRNA中扩增出长度为 347bp的特异性NeoR 基因片段 ,转导细胞培养上清的IL 2表达水平显著增高 ,体外增殖活性和细胞毒活性均强于未转导组细胞 ,CD4 /CD8 值升高。结论 :PLIL 2SN逆转录病毒转导CD3AK细胞后 ,IL 2基因得到表达并增强CD3AK细胞的免疫学功能     

逆转录病毒载体PLIL-2SN转导人CD3AK细胞方法的建立

目的 :探讨CD3AK细胞在基因治疗中的应用 ,并对逆转录病毒载体转导CD3AK细胞IL 2基因的方法进行研究。方法 :利用逆转录病毒载体PLIL 2SN向人CD3AK细胞中导入IL 2基因。结果 :从转导细胞中RT PCR扩增出 347bpNeoR 基因特异性片段 ,并测出培养上清液中IL 2浓度为 3 .2 76 μg·L-1。结论 :转导的IL 2基因得到表达 ,转导成功。这有助于进一步研究转导后淋巴细胞的功能 ,以开展基因免疫治疗的研究     

Foxp3基因转染对人CD4+CD25-T细胞表型和功能的影响

目的探讨体外Foxp3基因表达对CD4^＋ CD25^-T细胞功能的影响。方法将编码人Foxp3基因全长的逆转录病毒表达载体,转染人外周血CD4^＋CD25^-T细胞。以流式细胞仪方法检测转染后CD4^＋CD25^-T细胞表面CD25、CDl27分子及CTLA4分子的表达变化,以流式细胞仪及RT—PCR检测Foxp3基因在转染细胞中的表达。体外刺激、观察转染后的Foxp3细胞的增殖反应,以及重组细胞对CD4^＋CD25^-T细胞增殖反应和细胞因子分泌的作用。结果转染后Foxp3基因在CD4^＋CD25^-T细胞中呈高水平表达。转染细胞表面CD25、CTLA4分子均呈高水平表达,而CDl27分子表达水平下降,且IL-2并不能诱导其增殖。转染细胞与CD4^＋CD25^-T细胞共同培养可有效抑制CD4^＋CD25^-T细胞的增殖反应及细胞因子IL-4、IL-5和IFN-γ的分泌。结论Foxp3基因转染可有效诱导CD25及CTLA4分子表达,并使转染细胞具有调节性T细胞的功能。     

双特异性抗体介导的CD3AK体外杀伤实验研究

目的:研究在双特异性抗体的介导下CD3AK细胞(CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞)对人小细胞肺癌细胞株LTEP-sml细胞毒作用。方法:用51Cr-Na2CrO4释放试验检测单抗(2D6、UCHT1)和双特异性抗体(WST-HT)与CD3AK共同对人小细胞肺癌细胞株的杀伤活性。结果:双特异性抗体外能明显增强CD3AK细胞对人小细胞肺癌的杀伤活性。结论:与单纯CD3AK相比加入双特异性抗体后的CD3AK细胞的细胞毒活性显著增强。     

抗CD3mAb和IL-2共激活T杀伤细胞的免疫生物学活性研究

目的 探讨抗CD3单克隆抗体(CD3mAb)和rIL-2共同激活诱生的具有高效溶细胞活性的杀瘤效应细胞T-AK(T-activated killer)细胞的免疫生物特征。方法 观察从正常人外周血单个核细胞中诱生制备的T-AK细胞的形态学、免疫表型、细胞毒活性及其构成成分。结果 T-AK细胞具有活化淋巴母细胞的形态学特点;90％以上细胞表达T淋巴细胞表型(CD3^ ,CD8^ ),20％～50％细胞表达NK细胞表型(CD16^ ,CD56^ ),并表达IL-2受体(IL-2R)、CD38和MHCⅡ类抗原(HLA-DR^ )等激活淋巴细胞的表面标志;T-AK细胞对K562细胞、Raji细胞等具有高度杀伤活性,其活性主要由CD3mAb激活的CD3 AK活性(～50％)、IL-2诱生的LAK活性(～30％)、NK活性(～10％)和可溶性抑制因子的抑制活性(～10％)等4部分构成。结论 T-AK细胞为异质细胞群体,其主体为活化T淋巴细胞和NK细胞,具有CD3AK细胞和LAK细胞的共同活性。     

负载自体肿瘤抗原的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞在乳腺癌的临床研究

目的：探讨负载自身肿瘤裂解物的树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养后，对CIK体外肿瘤细胞杀伤活性的影响，进一步观察负载自身肿瘤裂解物的DC联合CIK治疗乳腺癌患者的临床免疫学疗效、毒副反应。方法：选择20例乳腺癌患者，分离外周血单个核细胞，其中贴壁细胞经GM—CSF和IL-4诱导产生DC，并负载自体肿瘤细胞裂解物；悬浮细胞经IFN-γ、IL-2、抗CD3单抗、IL-1α体外诱导产生CIK细胞。将负载抗原的DC与CIK共培养，观察CIK在体外对自身肿瘤细胞和乳腺癌细胞株SKBR-3的杀伤活性。此外，20例患者在切除原发病灶后，接受Ag—DC＋CIK细胞的过继免疫治疗，观察临床免疫疗效。结果：①CIK细胞培养后可见CD3^＋、CD8^＋和CD3^＋CD56^＋细胞较培养前显著增加；②将负载自身肿瘤抗原的DC与CIK共培养后，CIK的体外特异性和非特异性杀瘤活性明显提高；③细胞治疗后患者外周淋巴细胞Ag—NORs的IS值明显增高；CD3^＋、CD8^＋、CD56^＋升高；PBMC对自身肿瘤细胞的杀伤活性增强（P〈0．05）；④除一过性发热、畏寒外未见其它不良反应。结论：负载自体肿瘤细胞裂解物的DC疫苗联合CIK细胞在体外能明显增强对乳腺癌细胞的杀伤作用，亦能增强乳腺癌患者的细胞免疫功能，取得较理想的临床免疫疗效。     

MtbAK细胞与CD3AK、LAK细胞全外增殖和杀瘤活性比较

目的：比较结核杆菌抗原激活的杀伤细胞（MtbAK）、CD3AK及LAK细胞的体外增殖能力和杀瘤活性。方法：分别和结核杆菌抗原（Mtb-Ag）、CD3 mAb和rIL-2刺激人外周血单个核细胞（PBMC）,在含rIL-2的RPMI1640培养液中诱导扩增MtbAK、CD3AK和LAK细胞,用计数法动态观察细胞扩增情况,在流式细胞仪上分析MtbAK中的γδT细胞比例,以MTT法检测三种扩增细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性。结果：与CD3AK和LAK细胞相比,MtbAK细胞具有更强的增殖能力和较高的细胞毒活性。结论：MtbAK细胞在体外更易于扩增,具有较高的杀瘤活性,有可能应用于肿瘤患者的临床过继免疫治疗。     

细胞因子诱导的杀伤细胞的生物学特性及抗肿瘤作用研究

目的 探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）的生物学特性及抗肿瘤作用。方法 用淋巴细胞分离液分离健康献血者血中单个核细胞,用IFN-γ、IL-1β、IL-2、CD3单抗诱导CIK细胞。以CD3AK细胞作为对照。流式细胞仪检测细胞表型;乳酸脱氢酶（LDH）释放法分析细胞毒活性。结果 CIK细胞和CD3AK相比,在前期细胞增殖能力无明显差异,但至第10～21天时CIK细胞的增殖能力显著高于CD3AK细胞（P〈0．05）。诱导14d时,CD3^＋细胞和CD3^＋CD56^＋阳性细胞显著增多（分别约占84．75％和33．45％）。不同效靶比例的CIK细胞对K562细胞、BeL-7402细胞和Hela3细胞的溶瘤率均显著高于CD3AK细胞（P〈0．01）,在40：1的效靶比时,其杀瘤活性最强。但CIK细胞对不同肿瘤细胞的杀伤率比较无显著性差异（P〉0．05）。结论 CIK细胞是CD3^＋CD56^＋双阳性细胞群,其增殖能力及杀瘤活性明显优于CD3AK细胞。CIK细胞可作为一种新的广谱、高效的免疫效应细胞应用于临床。     

应用流式细胞术分析CIK细胞胞内Th1/Th2细胞因子

目的：建立细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)体外扩增的方法,并从单细胞水平分析CIK细胞的胞内Th1／Th2类因子产生的情况,进一步明确CIK细胞的免疫学特性及其参与的免疫效应机制。方法：取健康人外周血单个核细胞(PBMC),按一定的时间顺序分别加入IFN-γ、IL-2和CD3单抗,体外扩增CIK细胞,再应用流式细胞术,经刺激、阻断、固定、穿透和标记等过程测定CIK细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4水平。结果：外周血单个核细胞加细胞因子培养两周后CD3^ CD56^ 增加,培养至第21天、28天未见明显下降;诱导后CD3^ CD8^ 细胞量与CD3^ CD4^ 量相比明显增多;单细胞胞内细胞因子测定显示扩增后的CIK细胞Th1／Th2因子状态明显向Th1偏移。结论：采用多种因子组合刺激外周血单个核细胞,可大量诱导出CD3^ CD56^ 双阳性细胞,具高度增殖性,是一类新型的免疫过继疗法细胞;其偏移的Th1／Th2因子状态可作为解释其极强的细胞毒作用的理论依据。     

CD_3AK的制备及杀瘤作用观察

目的：观察CD_3AK抗CD3单克隆抗体）的活化及对肿瘤细胞的杀伤活性。方法：以不同的肿瘤细胞为靶细胞,以人外周血淋巴细胞为效应细胞,在体外用不同浓度的抗CD3单克隆抗体和／或IL-2进行激活,用MTT法观察细胞毒杀伤作用。结果：CD3AK的扩增率较LAK高一个数量级,且对不同的肿瘤细胞均有杀伤作用。其18h杀伤均大于4h。结论：由于CD3AK较LAK对IL-2的需要量少,扩增率高,而比LAK更有临床应用发展前景。     

以逆转录病毒为载体的IL—2基因转染K562细胞的研究

目的：研究以逆转录病毒为载体将IL-2基因转入K562细胞及表达情况。方法：应用脂质体介导的基因转移法，将质粒PGEN/IL-2导入包装细胞PA317，将K562细胞与PA317/IL-2细胞共培养，检测IL-2cDNA整合，mRNA转录情况，以IL-2依赖性CTLL-2细胞测定培养细胞上清中IL——2产量，比较转染前后细胞的体外生长情况和致瘤性。结果；IL-2cDNA成功整合入K562细胞基因组中并稳定表达，K562/IL-2细胞培养24h上清中IL——2活性为100U/ml，体内外观察均见细胞生长减慢。结论：以脂质体介导的以双顺反子逆转录病毒为载体的基因转移方法。可成功地将人IL-2基因转入人白血病细胞株K562，并持续分泌高活性的IL-2，为下一步将IL-2基因转入CML造血细胞的研究打下基础。     

sFv-TNF-α基因修饰的PBMCs对人肝癌细胞系HHCC的体外杀伤活性研究

目的　观察分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因 (sFv TNF α)的重组逆转录病毒转导的PBMCs对体外培养人肝癌细胞 (HHCC)的杀伤作用。方法　用感染性重组病毒产生细胞C2 2 (PA3 17 PST)产生的病毒上清转导人PBMCs ,采用PCR、RT PCR方法对转导的PBMCs进行DNA和mRNA水平的分析。转导的PBMCs(PBMCs PST)与HHCC共培养 ,MTT法检测PBMCs PST表达产物对肝癌细胞的体外杀伤活性。结果　PCR、RT PCR结果显示PBMCs PST中扩增出外源目的基因对应的电泳条带。MTT法检测结果 ,分泌型抗肝癌单链双功能抗体对体外培养肝癌细胞HHCC的杀伤率为 ( 3 1.4± 4.1) %。结论　分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因可以在PBMCs中整合并稳定表达 ,其分泌的表达产物对HHCC具有一定的体外杀伤作用。     

肿瘤放免治疗后免疫功能变化及其与预后关系

目的：通过检测26例胃肠道恶性肿瘤患者接受放射免疫治疗（放免治疗）前、后LAK细胞活性及其白细胞介素-2受体（IL-2R）表达和T淋巴细胞亚群改变,以及研究这些变化与疗效的关系。以求揭示放免治疗对机体免疫功能的影响及放免治疗的抗肿瘤机理。方法：LAK活性检测采用MTT法;白细胞介素-2受体（IL-2R）表达应用免疫荧光法检测;用流式细胞仪检查T淋巴细胞亚群改变。结果：放免治疗后2周患者外周血CD3^ 、CD4^ 细胞增多,CD4^ /CD8^ 比值增高,LAK细胞活性增强,IL-2R受体阳性LAK细胞数明显增多,CD8^ 细胞无明显改变;治疗后显效组外周血CD3^ 、CD4^ 细胞、CD4^ /CD8^ 比值、LAK细胞活性及IL-2R受体阳性LAK细胞数明显高于非显效组,而治疗前无明显差异。结论：放免治疗可增强机体免疫功能,放免治疗可通过增强机体免疫功能来达到抗肿瘤效果。     

MtbAK细胞与CD3AK、LAK细胞体外增殖和杀瘤活性比较

目的:比较结核杆菌抗原激活的杀伤细胞(Mtb AK)、CD3AK及LAK细胞的体外增殖能力和杀瘤活性.方法:分别用结核杆菌抗原(Mtb-Ag)、CD3 mAb和rIL-2刺激人外周血单个核细胞(PBMC),在含rIL-2的RPMI 1640培养液中诱导扩增MtbAk、CD3AK和LAK细胞,用计数法动态观察细胞扩增情况,在流式细胞仪上分析MtbAK中的γδ T细胞比例,以MTT法检测三种扩增细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性.结果:与CD3AK和LAK细胞相比,MtbAK细胞具有更强的增殖能力和较高的细胞毒活性.结论:MtbAK细胞在体外更易于扩增,具有较高的杀瘤活性,有可能应用于肿瘤患者的临床过继免疫治疗.     

骨肉瘤特异杀伤性T淋巴细胞的体外扩增

目的 研究骨肉瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外扩增培养的方法，并进行细胞毒检测。方法 抽取骨肉瘤患自身的外周血，分离淋巴细胞，用IL-2体外短期刺激方法提高对骨肉瘤细胞的免疫性，再按一定比例体外与多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞及巨噬细胞混合培养（MTLC）可获得骨肉瘤的特异性CTL细胞，进行鉴定并观察其杀伤特性。结果 混合培养4d后，即可扩增出大量淋巴细胞，流式细胞仪证实主要是CD8^ 细胞，这些具有杀伤活性的CTL细胞体外对自身肿瘤细胞有很强的细胞毒作用。结论 在IL-2作用下，应用巨噬细胞、自体肿瘤细胞及淋巴细胞体外混合培养，是体外扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞的较好方法，CTL作为新的特异性免疫治疗方法有望提高骨肉瘤的免疫治疗效果。     

多巴胺D1样受体在介导调节CD4^＋T淋巴细胞功能中的作用

目的：从分子水平揭示CD4^＋ T淋巴细胞表达D1受体和D5受体mRNA的现象,探讨这些受体在调节CD4^＋ T淋巴细胞功能中的作用.方法：采用免疫磁珠分离和纯化小鼠淋巴结CD4^＋ T淋巴细胞.用抗CD3/CD28抗体刺激活化CD4^＋ T淋巴细胞,并用D1样受体激动剂SKF38393、拮抗剂SCH23390分别作用于CD4^＋ T淋巴细胞,然后采用real-time PCR法检测CD4^＋ T淋巴细胞上D1受体和D5受体mRNA的表达,Th1细胞特异性转录因子（T-box expressed in T cells,T-bet）和细胞因子干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）的表达,Th2细胞特异性转录因子GATA binding protein 3（GATA 3）和细胞因子白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）的表达,Th17细胞特异性转录因子（retinoid acid-related orphan receptor gammat,RoR γt）和细胞因子IL-17、IL-22的表达.结果：D1样受体激动剂SKF38393（10^-8和10^-7 mol/L）作用于CD4^＋ T淋巴细胞后,CD4^＋ T淋巴细胞表达D1样受体mRNA增高,IFN-γ的表达降低,GATA 3、IL-4的表达增高,但T-bet、RoR γt、IL-17和IL-22的表达没有变化,SCH23390（10^-7 mol/L）能阻断SKF38393的这些作用.结论：CD4^＋ T淋巴细胞能表达多巴胺D1样受体,CD4^＋ T淋巴细胞上D1样受体的激活可促进CD4^＋ T淋巴细胞向Th2细胞分化、抑制Th1细胞功能及增强Th2细胞功能.     

CD3AK细胞治疗晚期恶性肿瘤疗效观察

目的：探讨抗CD3单克隆抗激活的杀伤细胞（CD3AK细胞）对晚期恶性肿瘤的疗效和对患者免疫功能的影响。方法：采用CD3AK细胞对58例晚期恶性肿瘤患者进行治疗,并对患者治疗前后的T细胞亚群和血清可溶性白介素2受体（sIL-2R)水平进行测定。结果：①治疗有效率（CD＋PR＋MR）为39．65％;②免疫功能变化：治疗后T细胞亚群中CD8^ 下降（P＜0．05）,CD3^ 、CD4^ 、CD4^ /CD8^ .比值均升高（P＜0．01）,sIL-2R水平显著下降（P＜0．01）。结论：CD3AK细胞能有效地治疗晚期恶性肿瘤。     

WT1多肽特异性T细胞受体基因转导正常T细胞的抗肺癌效应

目的通过基因转导技术获得WT1多肽特异性TCR基因转导的正常外周CD8+ T细胞,检测其对肺癌细胞的杀伤活性,探
讨TCR基因转导用于过继性细胞治疗肺癌的可行性及安全性。方法通过克隆HLA-A*2402限制性WT1特异性细胞毒性T细
胞（CTL）之TCR基因,经构建逆转录病毒载体后转导WT1-TCR基因至正常外周CD8+ T细胞;所获得的CD8+ T细胞对靶细胞
的杀伤效应经标准51Cr 释放试验测定。结果WT1-TCR 基因转导后的正常外周CD8+ T 细胞显示出对WT1 多肽负载的
HLA-A*2402+LCL细胞的特异性杀伤作用,同时TCR基因改造后的CD8+ T细胞可特异性杀伤HLA-A*2402及WT1表达阳性
的肺癌细胞株而不对HLA-A*2402表达阳性的正常细胞产生杀伤作用。结论这些数据论证了WT1-TCR基因转导正常外周T
细胞具有与亲代CTL一致的特异性杀伤特性,提示该方法用于过继性细胞免疫疗法治疗肺癌具有可行性。