脐血造血干/祖细胞研究进展

脐血和骨髓均富含造血干/祖细胞,但二者在造血干/祖细胞的含量上存在差别。脐血中各CD34~+细胞亚群有着独特的免疫表型。脐血造血干/祖细胞能在体外扩增,扩增后的CD34~+细胞能在SCID小鼠体内重建造血。由脐血CD34~+细胞可以生成淋巴细胞和内皮细胞。脐血造血干/祖细胞移植与骨髓造血干/祖细胞移植在患者的生存率、复发率及移植免疫排斥等方面均具有可比性,有着极大的潜在价值。     

人脐血及骨髓淋巴细胞免疫表型的比较及其意义

为比较脐血和骨髓淋巴细胞及祖细胞分化抗原，通过流式细胞术（FCM）双标法对38份脐血及10份骨髓免疫细胞表型进行了分析研究。研究发现：（1）脐血及骨髓淋巴细胞中均测到稚淋巴细胞（CD3^-CD4^ )，且前中含量较多，但脐血细胞毒T细胞含量（CTL，CD3^ CD16^ 56^ )低于骨髓；（2）脐血中NK细胞（CD3^-CD16^ 56^ )比例高于骨髓；（3）脐血有核细胞中CD34^ 细胞的比值接近于骨髓，但脐血CD34^ 细胞中髓系祖细胞（CD34^ CD13^ ,CD34^ HLA-DR^ )及淋巴系祖细胞（CD34^ CD19^ )含量均低于骨髓，结论：（1）脐血免疫细胞具有不成熟性，这估计是脐血移植后GVHD程度轻的主要原因；（2）脐血淋巴细胞中NK细胞含量较高，推测脐血移植后移植物抗白血病效应（GVL）并不会降低；（3）脐血CD34^ 细胞中髓系祖细胞及淋巴系祖细胞比例均低于骨髓，可能是脐血移植后造血及免疫重建速度较慢的原因之一。     

裸鼠腹腔输注体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症病人骨髓CD34+CD59+细胞的研究

应用BALB／c裸鼠为移植模型，将在体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）病人的CD34^＋CD59^＋细胞进行移植。研究其增殖能力和重建造血的情况，为实现PNH患者进行临床自体骨髓移植（ABMT）或自体外周血干细胞移植（APBSCT）奠定基础。本研究利用免疫磁珠双阳性分选法。从PNH患者骨髓中分离出足够数量的CD34^＋CD59^＋细胞进行体外扩增，并将体外扩增的细胞输注给接受亚致死剂量照射的BALB／c裸鼠。结果显示：移植6周后，用流式细胞术和DNA检测方法均检测到裸鼠骨髓、脾脏和外周血中人的CD45^＋细胞，而接受PNH病人CD34^＋CD59^＋细胞移植后的裸鼠，其血常规指标有一定恢复，但并未完全恢复。结论：PNH病人骨髓CD34^＋CD59^＋细胞体外扩增后仍能保持造血祖细胞的生物特性，在照射的裸鼠中能重建造血。     

PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞体外扩增及植入体内重建造血的活性研究

本研究应用BALB／c裸鼠为移植模型探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobin—uria，PNH）患者CD34^＋CD59^＋的增殖和重建造血的能力，为实现PNH患者自体骨髓移植或自体外周血造血干细胞移植提供实验依据。利用免疫磁珠双阳性分选法，从正常人及PNH患者骨髓中分离出两组CD34^＋CD59^＋细胞，分别进行体外扩增，并将体外扩增的正常人和PNH患者骨髓CD34^＋CD59^＋细胞分别输注给接受亚致死剂量照射的BALB／c裸鼠。应用流式细胞技术和DNA检测技术检测受鼠骨髓、脾脏和外周血中人CD45^＋细胞。结果表明：PNH组的CD34^＋CD59^＋细胞在体外生存、扩增能力似弱于正常人对照组。但CD34^＋CD59^＋细胞输注给受鼠后6周，在受鼠骨髓、脾脏和外周血中可检测到人CD45^＋细胞，PNH组受鼠CD45^＋细胞水平与正常人对照组相比，无统计学差异。结论：PNH患者CD34^＋CD59^＋细胞仍具有同正常人CD34^＋CD59^＋细胞相同的生物特性，能体外扩增并能保持正常干／祖细胞的特性。     

体外扩增小鼠造血干/祖细胞及重建造血功能的研究

目的 探讨体内中性粒细胞的快速植入及长期重建造血的能力。方法 分离经氟尿嘧啶处理的雄性BDF1小鼠骨髓单个核细胞，以MoFlo细胞分选系统分离纯化CD34^ /c-kit^ 造血干，祖细胞，体外应用骨髓间充质干细胞共培养和阶段扩增结合的方法分别对分离的单个核细胞和CD34^ /c-kit^ 细胞进行体外扩增，并将扩增的有核细胞移植给经亚致死剂量照射的雌性小鼠。结果 以骨髓间充质干细胞为培养基质细胞，结合分阶段扩增方法，有效提高了各种细胞的扩增倍数，其中单个核细胞扩增的总有核细胞、CD34^ 细胞、GM-CFC和HPP-CFC扩增倍数分别为10．8，4．8，65．9和38．8，CD34^ /c-kit^ 细胞扩增的以上4种细胞扩增倍数分别为76．1，2．9，71．7和51．8；扩增细胞移植后可快速产生体内中性粒细胞的植入，并在2个月后的移植小鼠中仍可检测到移植的造血细胞。结论 与骨髓间充质干细胞的共培养，为造血干，祖细胞的有效扩增提供了良好的环境，分阶段扩增法加快了体外造血干，祖细胞的扩增和成熟，为移植后体内中性粒细胞的快速植入创造了条件。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓造血干/祖细胞体外单个细胞培养

目的 研究阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）患者单个不同表型骨髓造血干／祖细胞体外生长特性。方法 用免疫磁珠富集C34^ 细胞，用流式细胞仪自动分选系统将患者CD34^ CD59^ 和CD34^ CD59^-造血干／祖细胞单个分选入96孔培养板，进行单个细胞培养，观察不同细胞各个生长指标，并与正常对照细胞比较。结果 ①单个细胞培养条件下，患者CD34^ CD59^-细胞在细胞发生分裂（细胞数≥2个）的比率、形成集落（细胞数≥50）的比率及扩增的总数（所有细胞发生分裂的孔的细胞数的总和）都超过了其CD34^ CD59^ 细胞（P＜0．05）。②PNH CD34^ CD59^-细胞单个细胞扩增的数目及细胞扩增的总数代于正常对照（P＜0．05）。③PNH CD34^ CD59^ 细胞在较大集落（细胞数≥500）形成、单个细胞扩增的数目及细胞扩增总数均低于正常对照（P＜0．01）。④患者异常与正常表型细胞单个细胞次级集落的形成能力差异无显著性（P＞0．05），但都明显低于正常对照。（P＜0．001）。结论 在单个细胞培养条件下，患者异常表型的造血干／祖细胞较其正常表型的造血干／祖细胞具有一定的生长优势。但它们与正常骨髓细胞相比，都存在一定的生长缺陷，正常表型细胞的缺陷尤为明显。     

同种异基因脐血移植小鼠模型的建立

探讨胎鼠及新生鼠外周血（FNPB）移植特性。建立同种异基因脐血移植小鼠模型。采用体外集落培养和流式细胞术的方法，检测FNPB与骨髓（BM）造血干/祖细胞含量与特性，给致死量环磷酰胺预处理的BALB/c（H-2^d)小鼠经尾静脉输注C57BL/6（H-2^b)小鼠FNPB，移植后动态观察受鼠存活状况，植入水平，造血与免疫功能恢复及移植物抗宿主病（GVHD）发生情况。结果显示：FNPB中早期红系祖细胞（BFU-E）和CD34^ 细胞含量与BM相近，粒单系祖细胞（CFU-GM）（14天），多向祖细胞（CFU-GEMM）及Sca-1^ CD34^ 细胞亚群明显高于BM，FNPB源造血干细胞占27.94%。结论：FNPB富含造血干/祖细胞，国内首次成功建立同种异基因脐血移植小鼠模型。     

脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化

同源盒基因家族成员HOXIM反映原始造血干／祖细胞（PHSC／PHPC）的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量RT—PCR的方法在mRNA水平上检测HOXIM基因的表达，以观察体外扩增脐血CD34^＋细胞自我更新的水平。结果显示：随着体外培养时间的延长，虽然CD34^＋细胞数增加，但HOXB4表达下降；周后，HOXB4几乎检测不到，与成熟外周血淋巴细胞表达HOXIM的水平相同；CD34^＋细胞与骨髓间充质干细胞（BM—MSC）共培养可以减缓CD34^＋细胞HOXIM表达的下降。结论：脐血CD34^＋细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34^＋与BM—MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34^＋细胞自我更新能力的丧失。     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

人胸腺和脐血造血干/祖细胞联合移植对裸鼠T细胞免疫功能影响

目的:建立人胸腺和脐血造血干/祖细胞联合移植裸鼠动物模型,探讨胸腺对造血干细胞发育分化的机制.方法:实验组为人胸腺与脐血CD34+细胞联合移植.对照组只给予人脐血CD34+细胞移植,通过观察裸鼠移植胸腺CD3、HLA-DR的表达、人源CD3+细胞在小鼠脾脏的表达、裸鼠血液CD3+、CD4+、CD8+和CD4+ CD25+细胞的百分比,以及联合移植裸鼠对移植肿瘤的排斥能力,判断联合移植对裸鼠免疫功能的影响.结果:移植胸腺在裸鼠肾被膜下存活,表达CD3和HLA-DR分子;裸鼠脾脏中检测到人源CD3+T细胞呈点块状分布;裸鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+细胞均增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);联合移植组能抵抗肿瘤细胞的生长,单独脐血造血干/祖细胞移植组不能抑制肿瘤生长.结论:裸鼠移植人胸腺能促进人脐血造血干/祖细胞向T细胞分化、促进免疫功能重建.     

体外扩增人脐带血造血细胞的研究现状

人脐带血中含有的造血干／祖细胞数量等于甚至超过成人骨髓，且含有更原始的造血干／祖细胞。应用各种体外培养方法进行扩增的脐血中，造血干／祖细胞明显增多，其中以低氧培养扩增效果较佳，有望解决人脐血移植中存在的造血干／祖细胞数量不足的问题。     

脐血造血干/祖细胞冷藏效果的比较研究

目的：探讨脐血细胞和1.064g/L ficoll分离的脐血造血干／祖细胞（简称1064脐血造血干／祖细胞）在不同冷藏条件下的效果。方法：21例脐血和12例1064例脐血造血干／祖细胞在4℃保存；16例1064脐血造血干／祖细胞分别冷藏在－80℃和－196℃，观察不同时间造血细胞活性；单个核细胞（MNC）采用自动血细胞分析仪测定，CD34^ 细胞采用流式细胞技术（FCM）测定，体外造血细胞培养技术分析粒－单系祖细胞（CFU－GM）和红系祖细胞（CFU－E)产率，台盼蓝着色法判断造血细胞活率。结果：脐血细胞在4℃保存第1、2d时，MNC、细胞活率、CFU－GM和CFU－E产率均无明显改变，第3d-5d CFU-GM和CFU－E产率明显下降；1064脐血造血干／祖细胞在4℃保存第3d出现CFU－GM和CFU－E的下降，至第5d下降更显著；1064脐血造血干／祖细胞冷藏在－80℃和－196℃，在半年内CFU－GM、CFU－E、CD34^ 细胞及细胞周期无显著变化，在－80℃冷藏一年时，CFU－GM、CFU－E和CD34^ 阳性细胞下降显著，而－196℃储藏一年时，上述指标及细胞周期无明显改变，98％以上的细胞处在G0－G1期。结论：脐血细胞4℃保存时间不宜超过3d；1064脐血造血干／祖细胞于－80℃和－196℃冷藏在半年内效果一致；－196℃长期冷藏脐血造血干／祖细胞是一种最可靠的方法，但－80℃冷藏脐血造血细胞是一种值得会尝试和实用、费用低的有效方法。     

人胎儿血造血干／祖细胞的生物学特性及其移植实验

背景：造血干细胞来源目前包括骨髓干细胞、外周血干细胞和脐带血干细胞，寻找新的干细胞来源以满足临床移植需要一直是人们的希望。从妊娠第5周起，肝脏中发育成完善的血窦系统，此后造血干细胞就可以随血液流动迁移。 目的：观察人胎儿血造血干／祖细胞的生物学特性并对其进行非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠移植。 设计：对照实验。 单位：广西医科大学第一附属医院血液科。对象：①细胞来源：21例胎儿血标本取自胎龄为18-29周[（24．2&;#177;3．2）周1死亡胎儿及2l例足月脐带血标本取自广西医科大学第一附属医院产科2002-10／2003-02。所取的血标本均取得其家属的知情同意。②实验动物：非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠12只，6-7周龄，雌性，无菌饲养于超净工作台中。 方法：采用流式细胞术，检测胎儿血的造血干／祖细胞表面标志，包括CD34,CD38，HLA-DR及CD90，同时与2l例足月儿脐血作比较。并将人胎血单个核细胞移植给6只经亚致死量照射的非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠，5周后观察其植人情况，采用流式细胞术检测小鼠骨髓中人白细胞的含量，以及采用聚合酶链反应检测小鼠骨髓中的人Cart-1基因。 主要观察指标：①胎血和脐血造血干／祖细胞表面标志的表达情况。②将胎血细胞移植给非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠的植入情况。结果：①人胎血中CD34^＋细胞的百分率显著高于足月脐血[（2．2588&;#177;O．7209）％，（1．5729&;#177;0．4783）％，P=0.00041，CD34^＋CD38^-细胞和CD34^＋CD90^＋细胞的百分率也均显著高于足月脐血[（1．2986&;#177;0.4706）％。（0.87l0&;#177;0.4095）％。P=0．0016；（0.9300&;#177;0.4692）％，（0.560&;#177;0.3658）％，P=0.03241。②6例胎血中的4例可顺利重建经亚致死量照射的非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠的造血，移植后5周在小鼠骨髓中仍可检测到人的白细胞和人Cart-l基因。 结论：人胎儿血中有比足月脐血更高含量的造血干／祖细胞，其单个核细胞能植入非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠骨髓，并重建髓、淋巴系全面造血。胎儿血有望成为多能造血干细胞来源。     

siRNA干扰p27基因表达对脐血CD34+细胞体外扩增影响的初步研究

造血干/祖细胞是一类被定义为具有自我更新和潜在重建造血能力的细胞.脐血是造血干/祖细胞的重要来源.通常人们应用高浓度的细胞因子刺激扩增脐血造血干/祖细胞,但导致其多向分化潜能及移植后造血重建能力下降.近来,Cheng等研究造血干/祖细胞的增殖周期特性发现,两种不同的Cip/Kip家族成员p21和p27可分别特异性地负向调控造血干/祖细胞增殖池的大小,p21可阻滞干细胞进入增殖周期,而p27可限制祖细胞的增殖周期.这为体外操纵造血干/祖细胞的增殖提供了良好途径.我们以pSilencer1.0-U6构建p27 siRNA表达载体转染脐血CD34＋细胞,以去除p27对造血祖细胞的增殖抑制作用,以一种不同于既往细胞因子刺激的方式,试图为体外扩增脐血CD34^＋细胞提供一种新的策略.     

人脐血CD34+CD38-细胞免疫表型和染色体核型特征分析

目的 分离脐血干／祖细胞(CD34^ CD38)进行体外长期培养，观察分析其增殖、细胞表面分子标志和染色体核型的特征。方法 用流式细胞仪分选CD34-FITC和CD38-PE标记的CD34^ CD38脐血原始细胞，在含细胞生长因子IL-3、IL-6、GM-CSF、EPO、SCF和胰岛素样生长因子的干细胞培养基中培养6个月，用流式细胞术检测体外培养30d的干／祖细胞表面标记，并用G显带方法分析其染色体核型。结果 在一定培养条件下，经7～12d培养，脐血干／祖细胞(CD34^ CD38)开始增殖。培养6个月后，每孔接种1个细胞，细胞数增殖至250～350个；每孔接种10个细胞，细胞数可增殖至400～500个。每孔接种1个细胞其细胞增殖峰持续时间(8～9代)比接种10个细胞(6～7代)长：经体外长期培养增殖，细胞仍强烈显示十／祖细胞表面分子标记(CD34^ CD38^-)；细胞染色体数目、结构未见异常。结论 脐血干／祖细胞(CD34^ CD38^ )经体外特异性培养增殖，可为大量脐血干／祖细胞移植提供细胞来源。     

人脐血造血干/祖细胞体外扩增的研究新进展

人脐血造血干／祖细胞增殖能力强，在不同的细胞生长因子联合作用下，可以有目的地扩增，使单份脐血造血干／祖细胞数量增加。动物实验证实了体外扩增并未降低造血干／祖细胞在小鼠体内的造血重建能力。因此，脐血造血细胞体外扩增有望解决成人济血移植中存在的造血干／祖细胞数量不足的问题。     

Caspase-3在脐血CD34+细胞中的表达及意义

为探讨脐血CD34＾＋细胞在不同细胞因子支持下体外扩增过程中caspase－3表达及意义，采用RT—PCR，Western blot和流式细胞术对脐血CD34＾＋细胞在体外扩增过程中的细胞增殖、细胞凋亡及caspase—3的表达进行了测定。检测结果显示，casPase—3　mRNA在新鲜分离的脐血CD34＾＋细胞中低水平表达，在细胞因子支持下体外培养3天，扩增的CD34＾＋细胞中caspase—3　mRNA和蛋白质水平表达上调，但在这两种细胞中仅能检测到分子量为32kD的非活性酶原形式的casPase－3，随着体外培养时间的延长，在无早期效应细胞因子SCF或FL存在的条件下，casPase-3被激活，可检测到分子量为20kD的裂解片段，细胞凋亡率增加。结论：虽然造血干／祖细胞的凋亡是个复杂的过程，但在脐血CD34＾＋干／祖细胞体外扩增过程中，caspase—3参与了细胞凋亡事件并发挥着重要的作用，早期效应细胞因子SCF和FL可减少造血干／祖细胞的凋亡，对造血干／祖细胞有保护作用。     

干扰素-γ对脐血造血干/祖细胞细胞周期蛋白D各亚型表达的影响

体外观察干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)对脐血造血干／祖细胞细胞周期蛋白D(cyclinD)不同亚型表达的影响，以探讨IFN-γ造血抑制的机制。用免疫磁珠阳性分选的方法分离脐带血CD34^ 细胞，并进行体外扩增；用甲基纤维素半固体培养方法，观察IFN-γ对脐血造血干／祖细胞CFU-GM形成的影响；用半定量RT-PCR检测IFN-γ对脐血造血干／祖细胞cyclinD不同亚型表达的影响。结果显示IFN-γ可以显著抑制脐血CFU-GM的形成，并可以从mRNA水平抑制cyclinD2和CyclinD3亚型的表达。由此得出结论，IFN-γ可以显著抑制cyclinD的表达，这可能是IFN-γ介导造血抑制的一种机制。     

脐血造血干/祖细胞免疫表型的流式细胞术双标法分析及其意义

目的比较脐血和骨髓中造血干/祖细胞(HSPC)的免疫表型差异.方法使用流式细胞术(FCM)双标法对38份脐血及10份骨髓HSPC进行免疫表型分析.结果①脐血有核细胞中CD34+细胞所占比例与骨髓中相近,约为0.5%;②脐血CD34+细胞中CD34+CD38-[(17.C4±5.37)%]、CD34+HLA-DR-[(32.65±10.71)%]及CD34+H-CAM+(CD44+)[(77.84±7.69)%]亚群含量均高于骨髓[含量分别为(8.26±3.19)%、(14.05±1.67)%和(70.02±6.40)%],CD34+CD13+、CD34+CD19+亚群比例低于骨髓.结论脐血与骨髓CD34+细胞比例相近,但前者较原始的干细胞含量更高,故脐血是极具潜力的HSPC来源;而脐血CD34+细胞中髓系及淋系祖细胞含量低于骨髓,可能是脐血移植后造血及免疫重建缓慢的原因之一.     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景:细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题.目的:实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响.方法:将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠.在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果与结论:移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组(P<0.05).扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达.结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能.