活化C蛋白样酶的筛选与特性研究Ⅰ.从蛇毒中筛选

活化C蛋白（activated protein C，APC）是人体内重要的生理抗凝剂，对凝血系统、炎症的发生和发展、细胞凋亡等生理反应进行调控。大量动物试验和临床研究表明APC对严重脓毒症、弥散性血管内凝血、婴儿紫斑和脊髓损伤等疾病有显著疗效。Lilly公司开发的重组人APC（商品名Xigris）于2001年由FDA批准上市，是首个治疗成年人严重脓毒症的生物药物。Xigris为新的治疗脓毒症药物的开发，特别为寻找同APC功能相似的天然药物提供了启示。     

活化C蛋白

活化C蛋白是由C蛋白在凝血酶-血栓调节蛋白复合物的作用下转化而来,是一个重要的生理抗凝剂。它通过灭活凝血因子Ⅴa和Ⅷa而对凝血系统进行调控,同时它还有抗炎、调控细胞凋亡和内皮细胞存活的功能。最近,用于治疗严重败血症的重组人活化C蛋白制品已成功开发,同时对其它相关产品的研制和开发也在进行之中。     

严重脓毒症治疗药物重组人活化蛋白C

重组人活化蛋白C(recombinanthumanactivatedproteinC ,又名drotrecoginalfa,商品名Xigris)是美国FDA在 2 0 0 1年 11月批准的第一个用于治疗成人严重脓毒症的新一类药物 ,具有抗血栓、抗炎和促纤维蛋白溶解作用。该药由礼莱公司研制开发 ,上市剂型为注射用冻干粉针 ,规格为 5和 2 0mg/ml。在抗击“非典”的特殊时期 ,我国紧急进口本品用于危重病人的救治。蛋白C通路受损在脓毒症的发病机理中起着重要作用 ,给予重组人活化蛋白C可以恢复异常的抗凝血机制 ,抑制凝血酶生成和微血管血栓形成 ,同时调节全身的致炎应答 ,保护器官功能。药理…     

活化C蛋白

活化C蛋白是由C蛋白在凝血酶－血栓调节蛋白复合物的作用下转化而来，是一个重要的生理抗凝剂。它通过灭活凝血因子Va和Ⅷa而对凝血系统进行调控，同时它还有抗炎、调控细胞凋亡和内皮细胞存活的功能。最近，用于治疗严重败血症的重组人活化C蛋白制品已成功开发，同时对其它相关产品的研制和开发也在进行之中。     

重组人活化蛋白C治疗儿童脓毒症休克的临床观察

目的观察重组人活化蛋白C（rhAPC）对儿童脓毒症休克的疗效及安全性。方法选择我院儿科及重症监护病房2011年1月-2014年3月间收治的60例脓毒症休克患儿,随机分为对照组（n=30）和rhAPC组（n=30）。对照组患儿给予对症治疗,rhAPC组患儿在此基础上静脉注射rhAPC 24μg/（kg·h）,连续给药4 d。2组患儿于治疗前及治疗后检测血浆纤维蛋白原和D-二聚体水平及炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α、动脉血氧饱和度（SaO2）和中心静脉压（CVP）。结果 rhAPC组患儿治疗后血浆纤维蛋白原和D-二聚体水平及炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α均显著低于对照组,而SaO2和CVP高于对照组,其差异均有统计学意义（P〈0.05）。rhAPC组1例患儿发生出血性膀胱炎。结论 rhAPC能有效抑制脓毒症休克患儿的炎症反应,降低血液高凝状态。     

活血中药对大鼠脓毒症早期循环及活化蛋白C的影响

目的观察血必净注射液对大鼠全身性感染（Sepsis）早期循环及活化蛋白C的影响。方法盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型。清洁级雄性sD大鼠75只按随机数字表法分为假手术组、手术组和血必净组,每组25只,各组按处死时间分为术后2、4、6、8、12h组,每组5只。所有实验动物应用10％水合氯醛4ml／kg腹腔注射进行麻醉,并维持镇静,同时监测平均动脉压,并持续补液。假手术组和手术组术后即开始静脉补充生理盐水,血必净组术后1h内给予血必净注射液,之后补充生理盐水。实验动物在规定的时间点取血后处死。血浆血活化蛋白c（APC）含量用大鼠酶联免疫吸附法检测。结果假手术组平均动脉压有轻微下降,但在正常范围内。手术组和血必净组平均动脉压均下降,并逐渐进入休克状态,第11小时和12小时平均动脉压与假手术组相比差异有统计学意义[第11小时：（58．7±7．0）rainHgVS（91．0±8．2）mm与（58．7±8．3）mmHgVS（91．0±8．2）mmHg;第12小时：（48．8±12．9）mmHgVS（83．4±5．5）mmHg与（55．4±4．0）mmHg vs（83．4±5．5）mmHg;P〈0．01或P〈0．05]。但血必净组进入休克时间晚于手术组,且MAP略高于手术组（P〉0．05）。假手术组APC含量没有降低。而手术组的血APC含量在术后2h之后逐渐下降,各时间点均显著低于假手术组（P〈0．01）。血必净组的血APC含量在术后早期逐渐升高,并在术后4h和6h显著高于假手术组和手术组,之后迅速下降,术后12h低于假手术组[（1．800±0．499）μg／LVS（3.418±0．440）μg／L,P〈0．01],但仍高于手术组（P〈0．01）。结论血必净注射液在脓毒症早期对循环功能有一定的改善。在脓毒症早期使用该药对大鼠蛋白c系统有一定的上调作用,可能是其发挥抗炎及改善微循环作用的机制之一。     

利凡诺去白蛋白人血浆再利用的实验研究I.蛋白C和蛋白S的纯化与鉴定

目的综合再利用利凡诺去白蛋白人血浆进行抗凝血成分蛋白C（PC）和蛋白S（PS）的分离纯化。方法采用钡盐吸附、分段盐析、亲和层析和制备性等电聚焦等技术从利凡诺去白蛋白人血浆中分别纯化PC和PS。结果所得PC和PS的相对分子量分别为(61±0.9)、(83±0.8)kD;等电点分别为4.70±0.03、5.20±0.03;分别富含Glu、Leu、Gly和Asp、Glu、Leu;毛细管区带电泳分析高度均一;与文献报道基本一致;得率分别为28.3%和12.6%。结论该纯化路线省时、经济,有助于利凡诺去白蛋白人血浆的综合再利用和抗凝血成分输血制剂的研制和开发。     

老年重症肺炎患者血清中活化蛋白C、髓样分化因子88水平与不良预后的关系

目的 观察活化蛋白C(APC)、髓样分化因子88(MyD88)在老年重症肺炎患者血清中的水平及与不良预后的关系.方法 选取2017年4月至2018年10月接诊的60例老年重症肺炎患者为患病组,并以同期57例健康体检者为健康组.酶联免疫吸附法(ELISA)检测2组血清中APC、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;实时荧光...     

胰酶中多种蛋白水解酶的分离和纯化

报道了一条综合利用胰酶的有效途径。对其中的羧肽酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等六种蛋白酶同时进行了分离和纯化。还对羧肽酶 A 和 B 的固定化条件及稳定性进行了探讨。     

枯草杆菌溶栓酶的分离纯化研究

目的 :以枯草杆菌HL 986发酵液为原料 ,对枯草杆菌溶栓酶的分离纯化技术进行研究。方法 :采用磷酸钙吸附沉淀除去部分色素和杂蛋白 ,经超滤脱盐、CM 5 2离子交换分离、丙酮沉淀和SephadexG 75凝胶过滤处理 ,得到具有溶栓活性的酶。结果 :得到的溶栓酶在SDS PAGE上为单一谱带 ,其分子量约为 2 7kD ,比活为980 0U/mg,活性得率为 6 3.8%。结论 :以较高的得率获得了高纯度的枯草杆菌溶栓酶。     

利凡诺去白蛋白人血浆再利用的实验研究Ⅱ.抗凝血酶Ⅲ和蛋白C抑制物的纯化与鉴定

目的综合再利用利凡诺去白蛋白人血浆进行抗凝血成分抗凝血酶Ⅲ (AT Ⅲ )和蛋白C抑制物 (PCI)的分离纯化。方法以钡盐吸附上清为原料 ,采用铝盐吸附、有机沉淀、离子交换层析、分子筛层析、亲和层析和制备性等电聚焦等技术从利凡诺去白蛋白人血浆中分别纯化AT Ⅲ和PCI。结果从利凡诺去白蛋白人血浆 10L中得到了AT Ⅲ 16 0mg和PCI4.2mg ,得率分别为 12 .7%和 10 .5 % ,其相对分子量分别为 (5 7± 0 .8)和 (5 6± 0 .8)kD ;等电点分别为 4.81± 0 .0 2和 8.0 1± 0 .0 2 ;分别富含Glu、Asp、Leu和Glu、Leu、Asp ;毛细管区带电泳分析高度均一 ;与文献报道基本一致。结论该纯化路线经济、简便 ,有助于利凡诺去白蛋白人血浆的综合再利用和抗凝血成分输血制剂的研制和开发     

软枣猕猴桃超氧化物歧化酶的分离纯化与特性研究

目的从软枣猕猴桃果实中提取纯化超氧化物歧化酶 (SOD) ,并对其特性进行研究。方法先以硫酸铵分级沉淀 ,后经DE 5 2纤维素柱色谱 ,磷酸缓冲液进行梯度洗脱。结果得SOD干粉 0 .918mg ,其分子量约为 30 6 0 0D ,亚基分子量约为 15 2 0 0D ,最大紫外吸收波长为 2 5 4nm。结论软枣猕猴桃果实含丰富的SOD。     

液相色谱分离纯化五步蛇毒凝血酶样酶

目的：改进分离工艺，找到液相色谱分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的最佳方案。方法：五步蛇毒依次经SuperdexG75凝胶过滤、DEAE．SephroseF．F阴离子交换和SuperdexG30凝胶过滤，通过改变洗脱液pH值、流速、Tris浓度、盐浓度及上样量来考察对分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的影响。结果：Superdex75凝胶过滤色谱分离纯化受洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量的影响；DEAE—SephroseF．FN离子交换色谱受盐浓度的影响：SuperdexG30凝胶过滤色谱受上样量的影响。三步分离纯化后获得一种五步蛇毒凝血酶样酶，分子量约23kD。结论：依次经SuperdexG75、DEAE—SephroseF．F和SuperdexG30凝胶，通过改变洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量等能得到最佳分离条件．最终可获得五步蛇毒凝血酶样酶的纯品。     

青霉素酰化酶的分离和纯化

采用渗透法冲击法提取大肠杆菌E.coli108青霉素酰化酶，得到了高比活的粗酶液，收率为93．3％，经硫酸铵分级沉淀、DEAE－Cellulose－52离子交换柱层析不得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条单带的酶，酶液比活为28．09u/mg，提纯了5．32倍，纯酶总收率为36．5％。     

快速蛋白液相色谱法纯化威廉环毛蚓纤溶酶及其活性研究

摸索威廉环毛蚓纤溶酶的分离纯化工艺和研究蚯蚓纤溶酶(earthw fibrinolytic enzyme，EFE)体内外的抗栓溶栓活性。通过提取，分步盐析，再经AKTAbasic蛋白快速液相色谱进一步纯化，得一组有纤溶活性的同工酶，其中一种比活较大达2000IU／mg。药理试验表明该酶有明显的抗拴溶栓活性。     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其部分酶学性质的研究

以野生环毛蚓(Pheretima)为材料，经匀浆抽提、热变性、硫酸铵分步沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤和DEAE—纤维素离子交换柱层析等纯化步骤，得到纯度较高的蚯蚓纤溶酶(EFE)，具有强烈的溶解血纤维蛋白的作用。同时对酪蛋白和BAEE也具有较强的水解作用，但对ATEE无水解活性。实验表明蚯蚓纤溶酶能被苯甲磺酰氟强烈抑制，说明该酶是丝氨酸蛋白酶、属胰蛋白酶类。金属离子Na^ 、K^ 、Mg^2 对此酶有一定的抑制作用，Hg^2 对EFE有强烈抑制作用，而Ca^2 可提高此酶活力。