甘油激酶的纯化与性质的研究

由嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus SIPI1.687)的粗提取液,经液-液双相抽提、DEAE-Toyopearl 650 M 离子交换柱层析及 SIPI-Ⅱ蓝色(?)料配基层析等分离提纯,可得甘油激酶(81U/mg),PAGE 鉴定为单带。用 Sephacryl 400凝胶过滤测得分子量为209,000道尔顿,SDS-PAGE 测定结果表明该酶由四个分子量均为50,000道尔顿的相似亚基组成。酶作用最佳 pH 9.4,pH 5.8～11.2时稳定;最佳温度为50℃,有较好的热稳定性。以甘油为底物时米氏常数为6.25×10~(-5)M。     

鲐鱼消化道中蛋白酶的分离纯化及其活性研究

采用硫酸铵沉淀,DEAE-Sephadex A-50柱层析和Sephadex G-75凝胶过滤等方法,对鲐鱼消化道蛋白酶进行了分离纯化。实验证明,该酶既能水解酪蛋白,又能水解N-苯甲酞-L精氨酸乙酯（BAEE）。该酶水解酪蛋白的最适温度为50℃,最适pH为9.2×103mol·L-2Ca2+和Mg2+对该酶有激活作用,Hg2+,Co2+,Cu2+对该酶活性有抑制作用。2×10mol·L-1半胱氨酸、巯基乙醇、还原型谷胱甘肽对该酶活性无影响,碘乙酸和PCMB对该酶活性亦无影响,而2×10-3mol·L1EDTA则能明显地抑制其活性。     

鲜人参药材水提取物的高效凝胶过滤色谱指纹图谱研究

目的：针对不同产地、不同生长年限的人参，建立人参药材水提取物的高效凝胶过滤色谱指纹图谱，为人参的质量评价提供依据。方法：以中性缓冲液抽提获得人参水提物，以相对分子质量标准蛋白为标准品，以人参主要蛋白（GMP）为对照，OHpak SB-803HQ（8mm×300mm）凝胶排阻液相色谱柱（排阻极限10万），流动相：10mmol·L^-1 Tris·HCl（含10mmol·L^-1 NaCl，pH7．4），流速：1．0mL·min^-1，柱温：25℃，应用紫外检测器检测，检测波长为280nm。谱图通过相似度评价系统软件进行分析。结果：人参药材水提物的高效凝胶过滤色谱有6个特征峰，人参药材的相似度在0．9～1．0之间，稳定性、重复性和精密度良好。结论：该色谱图可作为人参药材水提取物的高效凝胶过滤色谱指纹图谱，用于鲜参药材水提取物的质量评价。     

混合滥用药物的气相色谱质谱分析

目的 :建立混合滥用药物快速、灵敏检测方法。方法 :采用气相色谱 质谱法 (GC MS)对 11种毒品、药品进行定性定量分析。结果 :苯丙胺类及吗啡在 5 0× 10 - 4- 2 0× 10 - 2 g·ml- 1 范围内线性关系良好 ,检出限分别为 1 0×10 - 4g·ml- 1 和 2 0× 10 - 4g·ml- 1 ;氯胺酮、哌替啶、地西泮、咖啡因、可卡因、马来酸氯苯吡及乙酰替乙氧苯胺线性范围为 5 0× 10 - 6 - 5 0× 10 - 4g·ml- 1 ,检出限为 1 0× 10 - 6 g·ml- 1 和 2 0× 10 - 6 g·ml- 1 。结论 :本方法可用于混合滥用药物组分的快速、准确定性定量分析。     

大环内酯类抗生素麦迪霉素的电化学特性

在K₂HPO₄,NH₄Cl+NH₃和NaOH的10%(v/v)乙醇水溶液中,除0.01mol·L^-1以上NaOH液作为支持电解质外,麦迪霉素的伏安波皆为两个峰。峰A相当于它的甲醛基还原波,峰B为催化吸附氢波。溶液pH对两峰有强烈的影响。实验表明伏安波有吸附特性,且不可逆。两峰的ip与麦迪霉素的浓度成正比,线性范围分别为3×10^-6～3×10^-5mol·L^-1和1×10^-7～4×10^-5mol·L^-1,检测限为:1×10-6mol·L^-1和5×10^-8mol·L^-1。可应用于麦迪霉素的定量测定。研究了两峰的特性和电极机理,测定了有关的物理常数。     

龙葵碱对HepG_2人肝癌细胞NAT酶动力学常数的影响

目的探讨龙葵碱对HepG2细胞NAT酶米氏常数Km及最大反应速率Vmax的影响。方法MTT法测定龙葵碱对消化系统SGC-7901人胃癌、HepG2人肝癌、Ls-174人大肠癌3种肿瘤细胞株的细胞毒作用,采用高效液相色谱(HPLC)法,以2-AF为底物,以2-AF的浓度为底物浓度,在以HepG2完整细胞及细胞质内2-AF被NAT酶乙酰化为2-AAF的速度为NAT酶的反应速率,采用双倒数作图法,以底物2-AF浓度的倒数1/S对NAT反应速率的倒数1/V作直线,得出回归方程,计算Km和Vmax。结果MTT法测定表明龙葵碱对HepG2人肝癌细胞比较敏感,酶动力学研究表明,以2-AF为底物,对于HepG2完整细胞,阴性对照组的Km和Vmax分别为(2.37×10-3±8.37×10-5)mmol.L-1、(9.16×10-4±7.54×10-5)nmol.106cells-1,龙葵碱组的Km和Vmax分别为(2.22×10-3±9.05×10-5)mmol.L-1和(5.14×10-4±3.72×10-5)nmol.106cells-1。对于HepG2细胞质,阴性对照组的Km和Vmax分别为(8.95×10-3±2.61×10-4)mmol.L-1、(2.55×10-6±1.92×10-8)μmol.min-1g-1Pro,龙葵碱组的Km和Vmax分别为(9.48×10-3±3.63×10-4)mmol.L-1和(2.43×10-6±1.32×10-8)μmol.min-1g-1Pro,统计学表明对于HepG2完整细胞和细胞质,阴性对照组和龙葵碱组的Km没有差异,而Vmax差异有显著性(完整细胞P<0.01,细胞质P<0.05)。结论龙葵碱是HepG2人肝癌细胞NAT酶2-AF底物的非竞争性抑制剂。     

舒达宁的吸附伏安特性和含量测定方法的建立

目的探讨舒达宁的吸附伏安特性。方法在邻苯二甲酸氢钾(KHP)(pH4.20)底液中,舒达宁在汞电极上有一线性扫描还原峰,峰电位Epc=-1.21V(vs.Ag/AgCl),该峰具有明显的吸附性。结果吸附粒子为舒达宁中性分子,测得舒达宁在汞电极上的饱和吸附量为1.16×10-10mol·cm-2,每个舒达宁分子所占电极面积为1.43nm2,舒达宁在悬汞电极上的吸附符合Frumkin等温式。测得吸附系数β=1.22×106,吸引因子γ=1.02,电子转移数n为2,不可逆吸附的电子转移系数α为0.86,表面电极反应速率常数ks=0.32·s-1。结论建立了吸附伏安法测定舒达宁的最佳条件,检出限为1.0×10-9mol·L-1。该方法可用于舒达宁片剂的测定。     

重组人干扰素α2a分离纯化中试工艺研究

目的探索无单克隆抗体亲和层析的重组人干扰素α2a分离纯化工艺。方法用 7mmol·L-1盐酸胍抽提干扰素 ,然后用金属螯合层析、离子交换层析、反相柱层析和凝胶过滤将提取的干扰素纯化。结果目标蛋白纯化了 195 1倍 ,蛋白比活性达 2 4 0× 10 8IU·mg-1,回收率达 30 1%。SDS PAGE检定呈一条带 ,其分子质量约为 19kD ,纯度大于 97%。结论本工艺降低了生产成本 ,易于扩大生产规模 ,适合产业化要求。     

角质形成细胞模型中白介素8和单核趋化蛋白1的表达及西替利嗪对诱导的干预作用

目的　探讨人角质形成细胞株HaCaT细胞中组胺H1 受体(H1R)表达及西替利嗪(CET)对组胺诱导炎症因子的干预作用。方法　用RT-PCR和免疫组化技术检测HaCaT细胞H1RmRNA和蛋白表达,用组胺处理细胞为模型组,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测组胺诱导白介素8 (IL-8)和单核趋化蛋白1(MCP-1)的蛋白分泌及CET对诱导的干预作用。结果　HaCaT细胞有H1RmRNA和蛋白表达;组胺(1×10-6 ~1×10-4 mol·L-1 )可显著诱导细胞IL-8蛋白分泌(P<0. 05, vs对照组), 组胺(1×10-5 mol·L-1 )可显著诱导MCP-1分泌(P<0. 05, vs对照组),加入(1×10-6, 1×10-5mol·L-1 )CET共同培养24h,可抑制诱导作用(P<0. 05, vs模型组)。结论　西替利嗪可能通过抑制角质形成细胞趋化因子的表达而发挥抗皮肤过敏炎症作用。     

乳源免疫调节肽具有促进体内外淋巴细胞转化的作用

目的研究乳源免疫调节肽(PGPIPN)对机体外周淋巴细胞转化的影响及其机制。方法试验分体内和体外两系列实验。体内实验,取40日龄SD大鼠42只和60只18~22g昆明小鼠作为实验动物(大鼠和小鼠均♀♂各半)。用生理盐水预饲1wk后,大鼠和小鼠均随机分为3组(大鼠每组14只,小鼠每组20只,每组♀♂相等并分笼饲养)即对照组、PGPIPN2·5×10-3g·L-1剂量组和PGPIPN2·5×10-2g·L-1剂量组,它们被分别灌喂生理盐水、2·5×10-3和2·5×10-2g·L-1乳源免疫调节肽,隔天灌喂1次,大鼠每次3ml,持续30d,小鼠每次1ml,持续14d。饲养结束后,检测对照组和两剂量组间淋巴细胞转化的差别。体外实验,用上述对照组动物血液,将酪蛋白1h、2h酶解液、2·5×10-3、2·5×10-2g·L-1乳源免疫调节肽分别加入淋巴细胞培养液,以酪蛋白和生理盐水为对照,测定乳源免疫调节肽对淋巴细胞转化的直接影响。结果体内实验,饲喂乳源免疫调节肽能明显提高淋巴细胞转化的刺激指数,其中大鼠的PG-PIPN2·5×10-2g·L-1剂量组以及小鼠的PGPIPN2·5×10-3、2·5×10-2g·L-1剂量组均高于各自的对照组(P<0·05)。体外实验,不论大鼠和小鼠,酪蛋白、酪蛋白1h酶解液、酪蛋白2h酶解液、2·5×10-3g·L-1、2·5×10-2g·L-1乳源免疫调节肽均能提高淋巴细胞转化的刺激指数,幅度按上述排列逐渐增大,其中2·5×10-2g·L-1乳源免疫调节肽组高于各自的对照组(P<0·05),大鼠的2·5×10-2g·L-1免疫调节肽组也高于酪蛋白组(P<0·05),但酪蛋白组与对照组相比,差异较小。体内外实验均存在剂量依赖关系。结论免疫调节肽在体内外均能促进外周淋巴细胞的转化,而且有剂量依赖关系。     

维生素C发酵中L—山梨糖脱氢酶的研究

从氧化葡糖杆菌SCB329菌体中分离纯化得到L-山梨糖脱氢酶后,用Western印迹法验证了L-山梨糖脱氢酶只存在于产酸“小菌”。SDS-PAGE电泳测得分子量约为60000。动力学性质研究表明它为一个典型的MichaelisMenten氏酶,对L-山梨糖作用的Km值为52.7×10     

尖吻蝮蛇毒中一种新抗凝血因子的纯化及特性研究

应用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱,从尖吻蝮蛇毒中分离出一个新的抗凝血因子.经Superdex 75 HR 10/30预装柱检测,纯度达99.9%.SDS-PAGE检测为单一条带,相对分子量52.2k.该因子有显著的抗凝血活性,延长白陶土部分激血活酶时间的临界浓度为0.2mg/ml,无纤溶活性、磷脂酶A2活性和出血活性.     

比较鳗鱼降钙素与17β-雌二醇对体外培养成骨细胞增殖与分化的影响

目的比较鳗鱼降钙素(CT)与17β-雌二醇对大鼠体外培养成骨细胞增殖和分化的影响。方法用酶消化法分离培养新生SD大鼠成骨细胞(OB),取第2继代,在培养液中分别加入不同浓度的CT和17β-雌二醇(E2);用MTT法观察OB的增殖能力(A值)及分化功能(ALP)。结果CT组较对照组从1×10-12mol·L-1起A值增加,且呈剂量依赖关系,当浓度≥1×10-9mol·L-1时,差异才有显著意义(P<0.05);E2组较对照组在1×10-9～1×10-7mol·L-1,A值均增加(P<0.001),以1×10-8mol·L-1作用最明显。CT组较对照组从1×10-12mol·L-1起ALP活性均增加,也呈剂量依赖关系,当浓度≥1×10-10mol·L-1差异有显著性意义(P<0.05);E2组较对照组在1×10-9～1×10-7mol·L-1,ALP活性均增加(P<0.05),以1×10-8mol·L-1作用最强。结论鳗鱼降钙素与17-β雌二醇均可促进大鼠体外培养OB增殖和分化。     

去纤酶无直接溶栓作用

在以贫含血小板血浆为媒介的体外溶栓模型上,尿激酶(5×10~5～5×10~6IU·L~(-1))作用30min使人造混合血栓的重量呈剂量依赖性的降低。剂量为2×10~6IU·L~(-1)时,作用达峰值。相反,去纤酶(6.25～25IU·L~(-1))使血栓重量呈剂量相关性的增加。用大剂量凝血酶(1×10~5IU·L~(-1))消耗媒介中的纤维蛋白原后,去纤酶不再增加血栓重量,与生理盐水相比,亦未见有明显的降低血栓重量的作用。本结果提示去纤酶无直接溶栓作用。     

重组人内皮抑素的质控方法研究

目的通过研究并建立重组人内皮抑素质量控制方法。方法用内皮细胞迁移法测定内皮抑素的生物学活性;胰酶消化法测定肽图;分别用非还原型SDS-PAGE和RP-HPLC法测定样品的纯度;其余项目按《中国生物制品规程》2000年版进行测定。结果建立了内皮抑素的活性测定方法,应用该方法测定３批内皮抑素比活性分别为1.45×106, 1.57×106和2.73×106 u·mg^-1蛋白,肽图测定结果显示3批样品批间一致,SDS-PAGE纯度和RP-HPLC纯度均大于99%,其余各项指标均符合规定。结论建立的方法可有效地控制内皮抑素制品的质量。     

单链聚乙二醇化重组人干扰素ω的制备及其性质

采用直链PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯 (mPEG-SS) 选择性修饰重组人干扰素ω (rhIFNω), 离子交换 色谱和凝胶过滤色谱组合分离纯化单链PEG修饰产物 (PEG-rhIFNω), 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 测定单链PEG-rhIFNω的相对分子量, 并利用RP-HPLC和SDS-PAGE对修饰产物进行分析。在优化的工艺条件下, 分离纯化收集液的单链PEG-rhIFNω, 平均含量达182 μg·mL⁻¹, 分离纯化收率超过22%, 纯度大于98%, SDS-PAGE法测得表观分子质量为60 810, MALDI-TOF MS法测得相对分子质量为43 790; 单链PEG-rhIFNω具有典型PEG修饰蛋白的特性, 抗病毒活性保留率为15.0%, 抗原性降低了64倍, 酸稳定性、抗 胰酶水解能力、血清稳定性和热稳定性均显著提高。单链PEG-rhIFNω的药学性质获得显著改善, 有望开发为 安全、长效的新型干扰素。     

荧光猝灭法研究二氢槲皮素和二氢杨梅素与牛血清白蛋白的相互作用

目的 研究二氢槲皮素和二氢杨梅素与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。方法 运用荧光光谱法结合Stern-Volmer方程和Line Weaver-Burk双倒数函数计算出BSA与二氢槲皮素和二氢杨梅素相互作用的猝灭常数和结合常数,通过反应前后热力学参数如焓变ΔH和熵变ΔS的大小对作用力类别进行判断。结果 测得二氢槲皮素与BSA在不同温度下的结合常数293 K为2.27×10⁴ L·mol-1,298 K为2.06×10⁴ L·mol-1,303 K为1.89×10⁴ L·mol-1,二氢杨梅素与BSA在不同温度下的结合常数293 K为2.43×10⁴ L·mol-1,298 K为2.39×10⁴ L·mol-1,303 K为2.13×10⁴ L·mol-1。确定其使牛血清白蛋白荧光猝灭的过程为静态猝灭过程,通过热力学参数确定其结合力主要为疏水作用。结论 应用荧光猝灭法了解二氢槲皮素和二氢杨梅素与牛血清白蛋白之间有较强的结合反应,结合力以疏水作用力为主。     

热分析法对固体药物对乙酰氨基酚分解动力学的研究

采用差热分析(DTA)与差动扫描分析(DSC)两种热分析方法研究了固体药物对乙酰氮基酚的分解动力学,测定了此药物的热分解反应级数与分解活化能及频率因子。两种方法测得热分解反应级数均为1/3级,DTA法测得热分解活化能E为117.4kj·mol~(-1),频率因子A为6.69×10~7s~(-1)。DSC法测得热分解活化能E为118.38kj·mol~(-1),频率因子A为1.45×10~8S~(-1)。两种方法所得结果基本一致,且动力学方程线性相关性好,相关系数均在0.998以上。     

青蒿素与过氧化物酶作用的荧光研究

目的:研究青蒿素与过氧化物酶间的作用关系,建立青蒿素荧光检测方法。方法:以吡罗红B为指示剂,用荧光降低法研究青蒿素与辣根过氧化物酶的相互作用。结果:青蒿素与辣根过氧化物酶之间的催化反应米氏常数Km为2.72×10-5mol/L,最大反应速度vmax为1.74×10-4mol/(L·s),催化常数Kcat为24.27s-1。反应作用位点分别是青蒿素内过氧基团与酶中心离子Fe。该反应可用于对黄花蒿药材中青蒿素含量的测定,测定工作曲线为c=0.1684?F-0.8143(cartemisinin单位为1.0×10-7mol/L),相关系数r=0.9965,3σ检出限为3.58×10-8mol/L。结论:青蒿素与辣根过氧化物酶之间的作用具有酶与底物反应的特征,该特征反应可用于对黄花蒿药材中青蒿素含量的测定。     

高纯度木瓜蛋白酶的分离纯化和性质研究

目的建立木瓜蛋白酶的分离纯化工艺路径。方法采用初步采集处理,20%,40%硫酸铵分级沉淀、SP-sephadex C50柱色谱、羟基磷灰石柱色谱,从番木瓜乳汁中分离纯化木瓜蛋白酶。结果获得比活为1 184 U/mg的纯酶,活力回收率为55.79%,纯化的酶经SDS-PAGE呈单一条带,高效液相色谱呈单一条带,纯度达到99.31%。该酶耐高温,最适pH值为7.2,对酪蛋白的动力学常数(Km)为3.5×10-5mol/L。结论应用此方法成功纯化了高纯度的木瓜蛋白酶。