γδ T细胞诱导与分化的初步研究-Ⅰ

目的:探讨在异戊烯焦磷酸(IPP)作用下,健康人外周血和新生儿脐带血中γδT细胞的增殖和亚型变化,以期获得足够的具有不同特征的γδT细胞用于后续的实验研究。方法:流式细胞术分析经IPP诱导的单个核细胞表面分子的表达状态,评估其γδT细胞的比例、亚型和表型格局。结果:健康人外周血和新生儿脐带血中γδT细胞数量虽占较低比例,但两者的γδT细胞存在显著异质性。健康人外周血γδT细胞主要以Vγ9Vδ2 TCR亚群为主;初始分选的外周血单个核细胞中Vγ9Vδ2T细胞主要为中央记忆型(CD27+CD45RA-)和效应记忆型(CD27-CD45RA-);IPP诱导后,γδT细胞显著扩增,Vγ9Vδ2 T细胞亚群转变为以效应记忆型为主,并高表达HLA-DR和B7分子。而新生儿脐带血来源的γδT细胞却呈现出较为复杂的亚群异质性,其Vγ9Vδ2 T细胞主要为CD27+CD45RA+的幼稚型细胞;经IPP诱导14天后,γδT细胞获得扩增(比例增高)且Vγ9Vδ2 T细胞趋向中央记忆型和效应记忆型分化,但仍以幼稚型为主。结论:健康人外周血和新生儿脐带血中γδT细胞在数量、亚群诸方面存在差异;IPP具有诱导和扩增外周血γδT细胞的生物学作用,而脐带血来源的γδT细胞还需相关细胞因子的协同作用,才能呈现出其分化成熟为可用于理论研究和临床实验的效应记忆型γδT细胞的潜能。关于其具有的免疫调节和效应功能将另文报道。     

一种经济简单的方法扩增Vγ9Vδ2T细胞

目的体外以仲丁胺刺激健康人外周血PBMC中Vγ9Vδ2T细胞的增殖,为γδT细胞的过继免疫治疗建立效应细胞制备平台。方法淋巴细胞分离液分离健康人外周血的PBMC,以10~6/孔接种于24孔板,用含10%胎牛血清、1mmol/L仲丁烷和200U IL-2的1640完全培基连续培养2周。结果有效地扩增出了Vγ9Vδ2T细胞,其组成高达85%以上,所扩增出的Vγ9Vδ2T细胞能有效地杀伤Daudi细胞。结论使用小分子的胺基抗原能有效地扩增出有功能的Vγ9Vδ2T细胞,为γδT细胞的过继免疫治疗建立了效应细胞制备平台。     

免疫联合治疗增强Vγ9Vδ2 T细胞的抗肿瘤活性北大核心CSCD

细胞免疫疗法作为一种新型诊治手段在肿瘤治疗领域越发受到重视。γδT细胞具有良好的抗肿瘤特性,可识别恶性细胞、浸润肿瘤,在肿瘤细胞治疗和联合治疗中具有广阔应用前景。Vγ9Vδ2 T细胞是血液中最丰富的γδT细胞亚群,对卵巢癌、乳腺癌、白血病、肝癌等多种肿瘤细胞表现出良好杀伤能力。Vγ9Vδ2 T细胞虽然仅占外周血淋巴细胞少部分,但可由外周血单个核细胞大量扩增。免疫联合治疗的发展可提高基于Vγ9Vδ2 T细胞的联合治疗肿瘤杀伤效果。化疗药物、细胞因子、单克隆抗体等是诱导、扩增和干预Vγ9Vδ2 T细胞的有效药物。本文对Vγ9Vδ2 T细胞活化、肿瘤免疫杀伤作用和免疫联合治疗等进行综述。     

HIV/AIDS感染者体外诱导的γδT细胞亚群的特点

目的:了解HIV/AIDS感染者外周血中γδT细胞亚群的特点以及体外诱导后γδT细胞的增殖情况和Vδ1、Vδ2亚群的变化,为γδT细胞体外扩增方法的建立打下基础。方法:流式细胞术(FCM)检测25例HIV/AIDS感染者(HIV组)和31例健康对照者(HC组)外周血中的γδT细胞、Vδ1亚群、Vδ2亚群的频率和绝对值;选择两组中各10例外周血单个核细胞(PBMC),用anti-γδTCR单克隆抗体(mAb)和IL-2在体外诱导培养14 d,在0 d、7 d、14 d分别进行细胞计数和FCM检测,分析比较γδT细胞亚群的比例和培养情况。结果:HIV组外周血中γδT细胞、Vδ2亚群百分比和绝对值都显著低于HC组,而Vδ1亚群百分比和绝对值显著高于HC组;体外诱导培养14 d时,HC组总细胞数量增加3倍,HIV组总细胞数量稍有增加;HC组的γδT细胞比例可达到80%以上,其中Vδ2亚群可以增加到65%左右,而HIV组的γδT细胞比例达35%左右,Vδ2亚群比例仅增加到17%左右。结论:HIV/AIDS感染者外周血中γδT细胞比例显著降低,Vδ1/Vδ2比值倒置;用anti-γδTCR mAb和IL-2在体外诱导HIV/AIDS感染者的Vδ2亚群扩增效果不佳,不能逆转Vδ1/Vδ2倒置现象。应进一步寻找更加有效的诱导培养方法。     

人外周血中γδT细胞亚群、表型和细胞因子产生的研究

目的进一步比较人外周血中γδT细胞及Vδ1^+、Vδ2^+、Vδ1^-Vδ2^-细胞频率、表型及功能方面异同,进一步了解γδT细胞在免疫应答中的作用。方法分离人外周血单个核细胞(PBMCs),流式细胞术检测TCRγδ、Vδ1、Vδ2、CD4、CD8、CD45RO、CD62L、Granzyme A。PMA+Ionomycin刺激前后检测细胞因子IFN-γ、IL-17A及转录因子T-bet、Ro Rγt水平。磁珠富集、流式分选和ELISA检测纯化细胞IFN-γ产生。结果根据γδT细胞受体(TCRγδ)δ链,将γδT细胞分为Vδ1^+,Vδ2^+,Vδ1^-Vδ2^-3群,TCRγδ高低表达与Vδ1、Vδ2表达相关。Vδ1^+、Vδ2^+细胞约有20%~40%细胞表达CD8,低表达CD4,而Vδ1^-Vδ2^-细胞约有60%表达CD8和20%表达CD4。约6%的Vδ1^+和30%的Vδ1^-Vδ2^-细胞表达CD45RO,而约有80%的Vδ2^+细胞表达CD45RO。刺激后,γδT细胞3个亚群均表达IFN-γ和IL-17,Vδ2^+细胞表达最高,3个亚群差异有显著性,与纯化细胞结果相符。3个亚群细胞均高表达转录因子T-bet和Ro Rγt,高表达颗粒酶A。结论人外周血中Vδ1^+、Vδ2^+及Vδ1^-Vδ2^-细胞在频率、表型及功能方面均有显著差异,均可产生高水平细胞因子IFN-γ,该结果将为γδT细胞进一步研究打下良好基础。     

异种HSP70及固相抗体法体外扩增人γδT细胞的比较

目的：比较异种HSP70及固相抗体法体外扩增人γδT细胞。方法：分别用固相抗体法、HSP70BCG及小鼠榄香烯复合瘤苗热休克蛋白70-肽复合物(HSP70m-肽复合物)体外扩增人PBMCs的γδT细胞，流式细胞仪检测细胞表型及亚型分布，RT-PCR检测各亚型基因的取用。MTT检测γδT细胞的细胞毒作用。结果：培养14天后，抗体法扩增的PMBCs总数增加30～40倍，御细胞的比率由3.2％提高到86．7％；HSP70BCG组PBMCs总数增加7—8倍，7趼细胞的比率由3．2％提高到71．32％；HSP70m-肽复合物组PBMCs总数增加4～5倍，γδT细胞的比率由3.2％提高到27.26％。抗体及HSP70BCG扩增的γδT细胞以表达Vγ9/Vδ2亚型为主，且Vδ1、Vδ2、Vδ3三种基因均得到取用，对Daudi具较高的杀伤活性。结论：抗体及HSP70BCG均能扩增出高纯度的γδT细胞，且具有完整的受体库，扩增的γδT细胞具细胞毒活性。     

自身免疫病患者外周血γδT细胞系的功能研究

目的　研究自身免疫病人外周血TCRγδ细胞系在微生物及寄生虫抗原刺激下细胞因子的分泌情况。方法　以TCRγδ单克隆抗体固相法体外选择性扩增获得7例胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)及3例类风湿性关节炎(RA)病人外周血TCRγδ细胞系,平均纯度可达(847±59)%。在体外培养条件下,以植物血凝素(PHA)、结核分枝杆菌(M.tb)、阴道毛滴虫(TV)、人类6型疱疹病毒(HHV6)刺激24h及48h后,测定细胞因子分泌情况。结果　HHV6刺激组IL2的分泌量显著高于其它各实验组;M.tb及HHV6的刺激可导致IFNγ的高产量。TNFα的产生未见有显著性差异。结论　γδT细胞可能通过细胞因子的产生来影响自身免疫病的发生与发展。     

SLE患者外周血Vγ9链T细胞受体CDR3特征

为探讨Vγ9链T细胞受体(Tcell receptor,TCR)互补决定区3(complementarity determining region3,CDR3)是否参与自身免疫性疾病中γδT细胞的抗原识别过程,利用基因扫描技术和随机序列测定法对系统性红斑狼疮(systemic lupus er-ythematosus,SLE)患者和健康人外周血Vγ9TCR CDR3区的结构特征进行分析。结果显示,Vγ9CDR3序列的变化主要集中在J区等位基因的取用不同:健康人以表达JγP为主(82.86%),而SLE患者Jγ1/Jγ2(40.82%)和JγP(59.18%)表达率相近。两组人群相比,Jγ1/Jγ2和JγP表达率的差异均具有显著性。结果表明,SLE患者外周血Vγ9链T细胞受体具有与健康人不同的CDR3组成特点,提示其可能参与SLE病理过程中γδT细胞的抗原识别。本研究为寻找SLE中γδT细胞识别的自身抗原以及阐明γδT细胞在SLE中的独特作用奠定了基础。     

一种简单快速的γδT细胞扩增方法

建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法。用 5～ 10ml外周血通过CD3细胞的富集、γδ单抗的诱导以及肿瘤细胞刺激的培养体系进行γδT细胞的体外扩增。结果显示 ,γδT细胞能在短时间内快速大量扩增到 10 9～ 10 10 的数量级 ;诱导 4周的CD8、γδ阳性的细胞百分率分别为 42 6 9%和 5 8 6 7% ,明显高于诱导前的 2 3 97%和 6 6 2 % ;γδT细胞对NK敏感的K5 6 2细胞和NK抵抗的Daudi细胞均有较高的杀伤活性 ;γδT细胞对经抗HSP单抗封闭后的Daudi细胞的杀伤率明显下降。该培养体系是一种用血量少、特异、经济、快速的人外周血γδT细胞体外扩增方法。     

γδT细胞对系统性红斑狼疮患者外周血单核细胞活化和凋亡的影响

目的：探讨γδT细胞在系统性红斑狼疮疾病中的免疫保护作用。方法：检测17例正常人群和44例系统性红斑狼疮患者外周血γδT细胞及亚群的表达情况。以TCRγδ单克隆抗体固相法体外选择性扩增获得17例活动期系统性红斑狼疮患者和10例正常人群外周血TCRγδ细胞系。测定γδT细胞毒活性。用正常人群γδT细胞系与异体活动期SLE患者外周血单核细胞（PMBC）以1：5、1：10比例共同培养48小时，活动期SLE患者PMBC作对照孔，观察γδT细胞系对活动期SLE患者PMBC活化和凋亡、细胞因子分泌的影响。结果：SLE患者的γδT细胞及亚群数量明显减少（P〈0．05）。IL-2可显著增强γδT细胞的细胞毒作用。正常人γδT细胞系与异体SLE活动期患者PMBC细胞共同培养，共同培养二组SLE患者PMBC的CD69表达和凋亡率均较对照组明显下降（P〈0．01）。共同培养二组培养上清IL-10水平较对照组明显升高，具有明显差异（P〈0．05）。结论：SLE患者γδT细胞数及亚群较正常人群明显下降，γδT细胞对SLE外周血淋巴细胞的凋亡和活化具有抑制性作用，并使IL-10分泌水平升高，表明γδT细胞在SLE发病中具有保护性的免疫调节作用。     

HSP70刺激人Vγ9Vδ2 T细胞CCL5/RANTES的分泌

目的探讨热休克蛋白70(HSP70)体外诱导人外周血单个核细胞(PBMCs)后CC型趋化因子CCL5/RANTES在Vγ9Vδ2 T细胞表达。方法人PBMCs在体外用重组HSP70诱导活化,在第1、4、7、10、14天分别收集细胞,流式细胞术胞内细胞因子分析技术检测表达CCL5/RANTES的Vγ9Vδ2 T细胞百分率,并设结核杆菌低相对分子质量抗原(Mtb-Ag)刺激组作为对照。结果HSP70诱导组分泌CCL5/RANTES的Vγ9Vδ2 T细胞百分率在第1、4、7、10、14天分别为5.9±1.7、16.2±2.5、22.8±3.7、32.4±3.6与57.8±7.2;Mtb-Ag诱导组分别为3.7±2.5、10.5±1.8、11.1±2.3、26.3±3.9与47±4.7;HSP诱导Vγ9Vδ2T分泌CCL5/RANTES的能力比Mtb-Ag强。结论HSP70特异性诱导Vγ9Vδ2 T细胞增殖并分泌CCL5/RANTES,表明二者协同作用,共同参与免疫应答并可能介导某些炎症反应。     

可激活人γδT细胞的结核杆菌耐热多肽抗原的初步纯化与活性鉴定

目的：对结核杆菌耐热多肽抗原（Mtb-Ag)的蛋白组成进行定性分析。并观察Mtb-Ag及其纯化组分刺激人外周血γδT细胞和αβT细胞增殖反应的量效关系。方法：用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）定性分析Mtb-Ag 的蛋白组成，并用不同剂量的Mtb-Ag及其纯化组分体外刺激健康人外周血PBMC，培养9d后经流式细胞仪检测细胞表型。结果：Mtb-Ag经FPLC Mono Q离子交换柱分析存在20种蛋白成分，Mtb-Ag在合适刺激剂量时对人γδT细胞发挥优势扩增，当剂量过大则对αβT细胞发挥优势扩增，其分离纯化的含大分子蛋白的蛋白峰Ⅰ随着刺激剂量增加而对αβT细胞的扩增表现显著增强趋势；而其分离的含低分子多肽的蛋白峰Ⅱ随着刺激量增加则对γδT细胞扩增表现显著增强趋势，并且其活性明显高于蛋白峰I，同时其对αβT细胞的扩增效应并不明显，并显著低于Mtb-Ag和蛋白峰I。结论：Mtb-Ag刺激γδT细胞扩增时应选择合适的刺激剂量，其所含的低分子多肽抗原能特异性激活γδT细胞，而其所含的大分子蛋白抗原则特异性激活αβT细胞。     

PKCθ激活γδT细胞转录因子NF-κB的作用

目的:探讨经T细胞受体(TCR)途径激活人γδT细胞时,新型蛋白激酶PKCθ在促进转录因子NF-κB活化中的作用.方法:常规分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),用结核杆菌耐热性多肽抗原(MtbAg)诱导扩增,获得Vγ9Vδ2 T细胞富集的细胞群(MtbAT).PKCθ抑制剂(Rottlerin)预处理MtbAT,抗CD3单克隆抗体(mAb)刺激后收集细胞,通过电泳迁移率变动分析(EMSA)检测转录因子NF-κB活性变化;经流式细胞术(FCM)检测T细胞活化分子CD69的表达情况.结果:γδT细胞经抗CD3 mAb刺激,NF-κB活性增强;Rottlerin预处理使抗CD3 mAb诱导的NF-κB活化程度显著减弱,并抑制T细胞活化分子CD69的表达.结论:PKC0在人γδT细胞经TCR途径激活NF-κB过程中具有重要作用.     

丙戊酸钠在γδT细胞对肺癌A549细胞免疫中的作用

目的:研究丙戊酸钠(Sodium Valproate,VPA)作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂对肺癌A549细胞MICA蛋白的影响,并探讨丙戊酸钠在人外周血γδT细胞对肺癌A549细胞免疫中的作用.方法:用Ficoll密度梯度离心法分离健康人外周血单核细胞(PBMC),用流式细胞仪分选纯化γδT细胞,用IL-2及唑来磷酸刺激γδT细胞扩增.用不同浓度的丙戊酸钠处理肺癌A549细胞,培养24小时后用PCR及Western blot检测MICA的变化.将分离纯化的γδT细胞与处于对数期生长的肺癌A549细胞混合培养,并加入VPA、MICA抗体处理,24小时后用LDH法检测γδT细胞的细胞毒性.结果:加入VPA后,PCR及Western blot结果显示肺癌A549细胞MICA蛋白在转录及表达上均增强；分离纯化的γδT细胞经体外扩增后,对肺癌A549细胞有较强的细胞毒性作用；加入VPA后γδT细胞对肺癌A549细胞的细胞毒性作用较未加入组增强(P＜0.05).结论:体外扩增的γδT细胞对肺癌A549细胞产生较强的细胞毒性杀伤作用；组蛋白脱乙酰酶抑制剂-丙戊酸钠可上调A549细胞MICA的表达,并增强γδT细胞对肺癌A549细胞的杀伤作用.     

选择性扩增外周血和支气管肺泡灌洗液中γδT细胞的研究

目的 :探讨选择性扩增外周血和支气管肺泡灌洗液 (BALF)中γδT细胞的方法 ,以获得高纯度的γδT细胞亚群。方法 :应用梯度离心法分离大鼠 (n =10 )外周血和BALF中的单个核细胞 ,经贴壁除去单核 /巨噬细胞后 ,用补体攻击αβT细胞 ,再用抗TCRγδ单克隆抗体 (mAb)通过固相法加IL 2刺激选择性培养扩增γδT细胞 (简称“攻击洗淘法”) ;通过细胞生长曲线观察细胞增殖变化 ,采用免疫组化法和流式细胞仪检测鉴定γδT细胞纯度。结果 :PBMC和BALF中的γδT细胞在抗TCRγδmAb和IL 2存在下 ,无须再用抗原刺激 ,能维持较长时间增殖 ;经“攻击洗淘法”纯化后扩增的γδT细胞纯度达到 81%～99%。结论 :“攻击洗淘法”能高度纯化扩增外周血和BALF中的γδT细胞     

Ⅰ型IFN体外增强人γδT细胞对骨肉瘤的杀伤作用

目的:探讨Ⅰ型干扰素(IFN)对人来源γδT细胞杀伤骨肉瘤作用的影响。方法:取健康人和骨肉瘤患者外周血来源的单个核细胞,分别使用唑来膦酸(Zol)、Zol和Ⅰ型IFN体外刺激扩增,流式细胞技术检测γδT细胞的纯度,计算扩增倍数。以Zol刺激体外扩增的γδT细胞为对照组,Zol联合Ⅰ型IFN刺激体外扩增的γδT细胞为实验组,LDH法检测不同方法扩增的γδT细胞的细胞毒活性,ELISA法检测γδT细胞分泌的IFN-γ。结果:Zol、Zol联合Ⅰ型IFN均可高度选择性扩增健康人和骨肉瘤患者外周血单核细胞中的γδT细胞,扩增后γδT细胞具有杀伤骨肉瘤细胞的能力。Ⅰ型IFN预处理γδT细胞后可显著增强γδT细胞的杀伤活性。结论:Ⅰ型IFN能够促进人γδT细胞的抗骨肉瘤作用。     

T-ALL患者外周血TCRγ/δ T细胞的分布和增殖特点

目的:了解T细胞急性淋巴白血病(T-cell acute lymphocytic leukemia,T-ALL)患者外周血TCR Vγ和Vδ亚家族T细胞的分布和克隆情况。方法:利用RT-PCR扩增9例T-ALL患者和10例正常人外周血单个核细胞中3个TCR Vγ和8个Vδ亚家族基因的互补决定区3(CDR3),了解TCR亚家族Vγ和Vδ亚家族细胞的分布;阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,从而了解其克隆性。结果:9例T-ALL患者3个Vγ亚家族的表达率都明显低于正常人Vγ亚家族的表达率(P<0.05);Vδ亚家族中只有Vδ1和Vδ3的表达率低于正常人(P<0.05)。3例T-ALL患者出现克隆性增殖的γ/δT淋巴细胞。结论:T-ALL患者外周血TCR Vγ和部分Vδ亚家族谱系出现限制性表达和克隆性增殖。同时存在克隆性增殖γδ T细胞提示可能为γδ 白血病性T细胞克隆。     

体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞抗H1N1流感病毒效应的研究

目的探讨帕米磷酸钠(PAM)体外扩增培养的人外周血Vγ9Vδ2 T细胞对感染流感病毒H1N1的人肺上皮细胞A549的细胞毒效应。方法 PAM和IL-2联合刺激培养健康成人外周血单个核细胞(PBMC)10~14 d,免疫磁珠分选法纯化得到Vγ9Vδ2 T细胞,再将Vγ9Vδ2 T细胞与感染流感病毒的A549细胞按不同的效靶比(E∶T)接触共育或按E∶T=20∶1非接触共育6 h。流式细胞分析术检测A549的存活率及Vγ9Vδ2 T细胞穿孔素(perforin)的表达情况,收集培养上清检测流感病毒的滴度,提取培养上清及A549细胞的总RNA,实时荧光定量检测流感病毒基质蛋白M1基因的表达情况。结果 PAM在体外能有效活化并扩增Vγ9Vδ2 T细胞。Vγ9Vδ2 T细胞对感染流感病毒的A549细胞具有较强的杀伤作用,且随E∶T的升高而增大,在E∶T=20∶1时,Vγ9Vδ2 T细胞能杀伤60%的感染了流感病毒的A549细胞。接触共育组的A549细胞杀伤率明显高于非接触共育组(P0.05)。Vγ9Vδ2 T细胞经流感病毒感染后Perforin的表达明显上调。接触共育组的病毒复制也明显受到抑制(P0.05)。结论 PAM刺激扩增的Vγ9Vδ2 T细胞能有效杀伤感染流感病毒的人肺上皮细胞A549,其效应机制依赖于两者细胞间的接触。     

一株健康人γδT细胞克隆的建立及鉴定

目的 建立健康人γδT细胞克隆并进行鉴定。方法 以60Co照射的同种异体PBMC作为饲养细胞,以有限稀释法对经过阳性分选的γδT细胞进行克隆化。用流式细胞术及分子生物学检测鉴定所获克隆,以MTT掺入法对所获克隆进行增殖实验检测。结果 获得一株γδT细胞单克隆,为Vγ9Vδ2亚型,CD4分子和CD8分子表达均为阴性。进一步的研究发现表位肽EP6不仅能够特异性结合γδT细胞单克隆,而且能够促进其增殖。结论 成功建立了健康人外周血γδT细胞克隆,为深入研究γδT细胞抗原识别机制、亚群及功能奠定了坚实的基础。     

HIV-1早期感染者γδT细胞对储藏库细胞的细胞毒作用

目的探讨HIV-1早期感染者γδT细胞是否具有清除HIV-1储藏库的能力。方法入组HIV-1早期感染者16例,分离外周血单核细胞,体外采用唑来膦酸(5μmol/L)加IL-2(1 000 IU/m L)扩增γδT细胞。乳酸脱氢酶(LDH)法检测γδT细胞对储藏库细胞(J-Lat Full Length Clone10.6)的细胞毒作用;流式细胞计量术检测扩增前后γδT细胞的表型和储藏库细胞中GFP的荧光强度。结果唑来膦酸加IL-2在体外刺激γδT细胞快速且大量扩增(P0.001)。γδT细胞对储藏库细胞具有较强的细胞毒作用,储藏库细胞中GFP的平均荧光强度显著减弱(P0.05)。扩增后γδT细胞表现出细胞毒性NK细胞样表型,HIV-1感染者CD56+Vδ2T细胞的比例较健康对照显著增加(P0.05)。结论γδT细胞具有清除HIV-1储藏库的能力,基于γδT细胞的自体或异体过继免疫治疗有望成为清除储藏库,治愈HIV-1感染的一种新策略。