PI3K/Akt/eNOS信号通路在葛根素抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞组织因子表达中的作用

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信号通路在葛根素(puerarin)抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管内皮细胞组织因子(tissue factor,TF)表达中的作用。方法:实时荧光定量PCR检测TF的mRNA表达,Western blot检测TF和Akt的蛋白表达,硝酸盐还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。结果:与对照组相比,ox-LDL孵育内皮细胞后,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化水平降低,细胞内NO产生减少;而葛根素预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF mRNA和蛋白表达下降,Akt蛋白磷酸化升高,细胞内NO产生增多;PI3K抑制剂LY294002和葛根素共同预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化降低,细胞内NO产生减少;eNOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和葛根素共同预孵育内皮细胞,也明显阻断葛根素对ox-LDL诱导的内皮细胞TF mRNA和蛋白表达、细胞Akt蛋白磷酸化和细胞内NO产生的作用。结论:葛根素可通过上调PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞TF mRNA和蛋白表达。     

PCA通过NF-κB和AP-1信号通路影响HUVECs表达TF

目的:探讨核因子κB(NF-κB)和活化蛋白1(AP-1)信号通路在尖吻蝮蛇毒蛋白C激活剂(PCA)抑制脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)组织因子(TF)表达中的作用。方法:MTT法检测HUVECs活力,免疫组化法检测肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)蛋白在细胞中的分布,Western blot法检测细胞内NF-κB p65、TF、c-Fos和c-Jun蛋白的表达,qPCR法测定TF mRNA在HUVECs的表达,ELISA法检测细胞培养上清中TF的含量。结果:与对照组比较,LPS组的细胞活力明显下降(P0.01),胞质内出现明显的黄染颗粒,胞质染色加深,TRAF6平均吸光度值升高(P0.01),NF-κB p65、c-Jun和c-Fos的蛋白表达均明显增加(P0.01),TF mRNA和蛋白表达亦明显增加(P0.01);PCA+LPS组的细胞活力较LPS组升高(P0.05),细胞形态正常,胞质黄染颗粒不明显,TRAF6平均吸光度明显小于LPS组(P0.01),NF-κB p65、c-Fos和c-Jun 3种蛋白表达则明显降低(P0.01),TF mRNA及蛋白亦表达减少(P0.01)。结论:PCA可明显减轻LPS引起的HUVECs损伤,其机制可能是通过降低TRAF6、NF-κB及AP-1核因子的活化进而减少组织因子的释放来实现的。     

脂多糖诱导血管内皮细胞凝血途径相关因子基因表达变化

目的：观察脂多糖(LPS)对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织因子(TF)、组织因子抑制物(TFPI)和凝血酶调节蛋白(TM)的影响。方法：应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养，用生长良好的第2、3代细胞进行实验。同时应用CCK-8测定细胞在不同浓度的LPS(1-100 mg/L)处理前后细胞活性；应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内TM、TF和TFPI mRNA水平。结果：浓度为10 mg/L的LPS对细胞活力与对照组相比没有显著差异。浓度为10 mg/L的LPS作用使HUVECs显著上调TF mRNA表达，6-24 h可以使细胞TFPI mRNA表达下调,以后渐恢复正常表达，72 h达到正常对照组水平，同时下调TM mRNA表达。结论：LPS(10 mg/L)对HUVECs的活性不造成直接的影响，可显著上调HUVECs的TF mRNA转录，抑制TFPI mRNA 的转录，而不改变TM mRNA的转录，这可能与LPS在感染过程中诱导血栓形成,血液凝固和DIC发生相关。     

胸腹水组织因子及组织因子途径抑制物的检测及其意义

目的研究三组疾病胸腹水组织因子(Tissue factor,TF)及组织因子途径抑制物(Tissue factor pathway inhibitor,TFPI)的表达及其鉴别诊断意义。方法TF和TFPI采用ELISA法测定抗原表达。结果胸腹水TF水平和TFPI水平,恶性肿瘤组(570.04±627.53)ng/L,(28.60±15.57)μg/L和结核病组(283.82±143.16)ng/L,(31.16±12.26)μg/L明显高于肝硬化组(60.83±66.87)ng/L,(7.84±5.45)μg/L,P<0.01。TF/TFPI比值则为恶性肿瘤组(32.17±44.19)明显高于结核病组(13.55±13.15)和肝硬化组(11.22±9.05,P<0.05)。在恶性肿瘤组中,胸腹水癌细胞阳性组的TF表达(1106.92±1244.28)ng/L高于阴性组(331.08±295.84)ng/L,P<0.05。而阳性组的TFPI水平(27.35±17.75)μg/L与阴性组(30.34±13.20)μg/L无明显差异(P>0.05)。TF/TFPI比值则为阳性组(59.59±65.10)明显高于阴性组(11.54±8.37,P<0.01)。结论检测胸腹水TF和TFPI并分析TF/TFPI比值可以作为临床实验室有鉴别诊断意义的辅助指标,同时还可了解疾病的某些病理机制,尤其是肿瘤的某些生物学行为。     

粥样硬化斑块中组织因子和组织因子途径抑制物的表达

目的 观察股动脉粥样硬化斑块中组织因子TF和组织因子途径抑制物TFPI的表达、分布.方法 采用免疫组化、双染组化方法检测股动脉粥样硬化斑块中TF和TFPI的表达和分布,RT-PCR检测TF mRNA和TFPI mRNA的表达.脐动脉作为对照.结果 脐动脉外膜表达少量TF和TFPI蛋白及其mRNA,而动脉粥样硬化斑块血管增生内膜大量表达TF和TFPI蛋白及其mRNA.结论 增生内膜中所有细胞类型及细胞间质都表达TF和TFPI.     

肾上腺髓质素对oxLDL诱导的HUVECs组织因子及其抑制物表达的干预作用

目的：探讨肾上腺髓质素（AM）对氧化低密度脂蛋白（oxLDL）影响脐静脉内皮细胞（HUVECs）组织因子（TF）及其抑制物（TFPI）表达的干预作用，并探讨可能的信号转导途径。 方法： 进行人HUVECs原代培养，分别采用发色底物法和RT-PCR技术检测TF及TFPI蛋白活性及mRNA水平的变化，并给予8-溴-环腺苷酸（cAMP拮抗剂）、PD098059（MAPKK抑制剂）及H7（PKC抑制剂）观察AM影响TFPI表达的信号途径。 结果： AM呈剂量依赖性地抑制oxLDL诱导的HUVECs TF蛋白活性和mRNA表达的升高；AM可增加HUVECs TFPI的表达，并能减轻oxLDL所致的TFPI蛋白活性和mRNA水平的降低；AM通过cAMP和MAPK途径影响TFPI的变化。 结论： AM可以减低oxLDL对HUVECs TF和TFPI表达的影响，进而改善动脉粥样硬化的凝血状态，延缓其进程。     

TRAF6在抗β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达组织因子时的活化

目的:探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)在抗β2 GPI/β2 GPI复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用.方法:采用一定剂量抗β2 GPI/β2 GPI复合物刺激THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA及总蛋白,实时定量PCR检测细胞TF mRNA水平,发色底物法检测细胞TF活性;RT-qPCR及Western blot分别检测细胞TRAF6mRNA和蛋白表达情况;进一步采用蛋白酶体抑制剂MG-132,观察是否能够干预抗β2 GPI/β2 GPI复合物对细胞的刺激效应.结果:抗β2 GPI/β2 GPI复合物(100 mg/L)能够刺激THP-1细胞表达TF mRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05);使细胞TRAF6 mRNA和蛋白表达均增加,并显示时间相关性,分别在刺激15 min和30 min时表达至高峰;MG-132(5μmol/L)明显抑制抗β2 GPI/β2 GPI复合物(100 mg/L)对THP-1细胞TRAF6 mRNA和蛋白的刺激效应及TF的诱导表达.结论:抗β2 GPI/β2 GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,TRAF6被激活并发挥重要作用.     

姜黄素抑制ox-LDL诱导HUVECs凋亡

目的研究姜黄素对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的保护作用及其可能机制。方法体外培养HUVECs,实验分为:对照组、ox-LDL组、ox-LDL加内质网应激(ERS)抑制剂PBA组、姜黄素组、ox-LDL加姜黄素组和ox-LDL加姜黄素加PI3K抑制剂LY294002组。CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡;激光共聚焦显微镜观察活化转录因子6(ATF6)转位;Western bolt检测ERS相关蛋白:糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)和肌醇激酶-1(IRE-1)以及相关通路蛋白:LOX-1、AKT和p-AKT的表达。结果与对照组相比,ox-LDL可增加细胞凋亡,提高ERS相关蛋白的表达(P0.01),促使ATF6向核内转位,以及提高LOX-1(P0.01)和降低p-AKT的表达(P0.01);与ox-LDL组相比,PBA可抑制ox-LDL诱导的细胞凋亡(P0.01),姜黄素可抑制ox-LDL诱导的ERS相关蛋白和LOX-1的表达(P0.01),ATF6的核转位,内皮细胞的凋亡(P0.01),同时它还可提高ox-LDL引起的p-AKT表达下调(P0.01);LY294002可部分削弱姜黄素抑制ox-LDL诱导ERS相关蛋白表达的作用(P0.05)。结论姜黄素可降低ox-LDL诱导HUVECs的凋亡,其可能机制是通过抑制LOX-1的表达和激活AKT通路减轻细胞ERS来实现的。     

LOX-1介导ox-LDL诱导的血管内皮细胞MCP-1的表达

目的：观察血凝素氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）对氧化LDL（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞(human unbilical vein endothelial cells, HUVECs)表达单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）基因及蛋白的影响。 方法： 用RT-PCR和Western blot的方法观察ox-LDL对培养的HUVECs表达LOX-1和MCP-1基因及蛋白的影响，然后用LOX-1的受体阻滞剂爱兰苔胶（carrageenan） 和聚肌苷酸［polyinosinic acid，poly(I)］与HUVECs预先作用后，再观察内皮细胞表达LOX-1和MCP-1基因和蛋白的变化。 结果： 用不同浓度的ox-LDL（0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 、50 mg/L、100 mg/L）与HUVECs培养24 h后，LOX-1和MCP-1的mRNA和蛋白的表达明显增加，呈浓度依赖性；用Carrageenan 和polyinosinic acid与HUVECs预先作用2 h后，再加入50 mg/L的ox-LDL培养24 h，与未加Carrageenan和polyinosinic acid相比，HUVECsLOX-1和MCP-1的mRNA和蛋白的表达明显减少。 结论： ox-LDL可以调节培养的HUVECsLOX-1和MCP-1基因和蛋白的表达，LOX-1作为ox-LDL的特异性受体，可能介导了ox-LDL诱导血管内皮细胞分泌MCP-1，从而在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要的作用。     

蜂胶醇提物通过抑制C/EBP同源蛋白表达减轻氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡

目的:研究蜂胶醇提物(ethanol extract of propolis,EEP)对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用,并探讨可能的分子机制。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),给予EEP(7.5、15和30 mg/L)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA;4 mmol/L)预处理1 h,再加入ox-LDL(100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin,TM;4 mg/L)继续培养24 h。分别采用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞活力和凋亡情况;试剂盒测定培养液乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)和细胞内caspase-3活性。分别采用Western blot和real-time PCR技术检测内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡途径关键蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)和Bcl-2的表达变化。结果:与ERS抑制剂PBA相似,EEP呈剂量依赖性地减轻ox-LDL所诱导的HUVECs损伤,表现为细胞活力增加(P0.01或P0.05),LDH漏出、凋亡率和caspase-3活性降低(P0.05或P0.01),且可抑制ERS诱导剂TM所致的HUVECs活力下降(P0.05),以及LDH漏出、细胞凋亡率和caspase-3活性增加(P0.05或P0.01);与PBA相似,EEP可抑制ox-LDL所诱导的CHOP上调和Bcl-2下调(P0.05或P0.01);另外,与TM组比较,EEP预处理组CHOP蛋白和mRNA表达上调也受到明显抑制(P0.05或P0.01)。结论:EEP可减轻oxLDL所诱导的HUVECs凋亡,其机制可能与抑制CHOP介导的ERS凋亡途径有关。     

重组可溶性人CD40L诱导人脐静脉内皮细胞损伤

目的:探讨重组可溶性人CD40L(rsh CD40L)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的损伤作用及其在动脉粥样硬化中的作用。方法:应用rsh CD40L刺激人脐静脉内皮细胞12 h;MTS法观察HUVECs的生存活性,ELISA法测内皮细胞E-选择素(E-selectin)、细胞间黏附分子(ICAM)-1、组织因子(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)表达的变化,比色法测脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果:与正常组比较,不同浓度的rsh CD40L(0.5、1、2、3 mg/L)对内皮细胞的生存活性无明显影响;0.5 mg/L rsh CD40L即可增加内皮细胞E-selectin、s ICAM-1、TF、TFPI的分泌,差异有统计学意义(P0.01),同时增加内皮细胞MDA的含量、降低SOD活性(P0.05)。结论:0.5~3 mg/L rsh CD40L对内皮细胞生存活性无明显影响,但已经引起内皮细胞功能障碍,增加内皮细胞炎症和外源性凝血反应,诱导内皮细胞脂质过氧化物损,使其抗氧化能力下降。     

弱氧化修饰低密度脂蛋白诱导ECV304组织因子基因表达及银杏内酯B的抑制作用

为研究弱氧化修饰低密度脂蛋白（mmLDL)对ECV304组织因子（TF）蛋白含量和mRNA水平的影响、对胞浆游离钙离子[Ca^2 ]i的影响，以及银杏内酯B等的干预作用。采用ELISA法检测细胞内TF蛋白含量，用RT－PCR法检测细胞内TF mRNA水平，用激光共聚焦显微镜观察[Ca^2 ]i的变化。结果显示，40mg/L mmLDL作用ECV304 4h，能使TF蛋白含量及mRNA水平显著增加，并迅速升高[Ca^2 ]i。抗氧化剂银杏内酯B及PKC抑制剂Staurosporine可拮抗mmLDL的上述诱导反应。以上结果提示，mmLDL可诱导ECV304 TF表达，Ca^2 与PKC参与mmLDL诱导ECV304 TF基因表达过程，并且银杏内酯B可抑制mmLDL的此种效应。     

阿托伐他汀抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞表达胸腺基质淋巴细胞生成素TSLP的表达

目的:观察阿托伐他汀对ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的影响。方法:将HUVECs分为3组,对照组加50 mg/L的ox-LDL培养12小时;实验组分为2组,分别加50 mg/L的ox-LDL和不同浓度的阿托伐他汀培养12小时,于6小时和12小时进行检测,用ELISA法检测细胞培养上清液中TSLP的浓度,用RT-PCR检测TSLP mRNA的表达,采用免疫荧光检测细胞胞浆中TSLP表达。结果:ELISA和IF结果显示,实验组上清液和细胞浆内的TSLP的表达明显低于对照组,并随浓度的增大及时间的延长,TSLP降低得更明显。结论:阿托伐他汀可抑制ox-LDL诱导的HUVECs表达TSLP,这可能是阿托伐他汀抗动脉粥样硬化炎症反应的机制之一。     

氧化低密度脂蛋白内皮受体在氧化低密度脂蛋白致内皮细胞损伤中的作用

目的:探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX1)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致内皮细胞损伤中的作用。方法:采用倒置相差显微镜观察细胞形态的改变;发色底物法检测内皮细胞培养液中的组织纤溶酶原激活物(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的活性;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测LOX1mRNA表达水平。结果:单纯加入ox-LDL,内皮细胞出现胞体收缩,细胞膜破坏等明显的损伤性改变,培养液中PAI-1活性较对照组高3倍(P<0.05),LOX1mRNA水平表达增高;而当培养液中同时加有LOX1抑制剂polyinosinicacid时,内皮细胞形态损伤不明显,培养液中PAI-1活性低约2.6倍(P<0.05),同时LOX1mRNA水平降低。结论:LOX1介导了ox-LDL对内皮细胞的损伤,可能在血管损伤性疾病的发生中起重要作用。