PPARγ激动剂对白血病NB4细胞的诱导凋亡作用及其作用机制

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂罗格列酮（rosiglitazone,RGZ）对白血病NB4细胞的诱导凋亡作用及其作用机制。方法以不同浓度的RGZ作用于体外培养的NB4细胞0、24、48及72h．应用MTF法检测细胞生长抑制率,用Annexin V／PI双染法检测细胞凋亡,并对细胞凋亡前后P53蛋白的表达水平进行检测。结果RGZ可显著抑制细胞的生长及诱导细胞发生凋亡,呈现出明显的量-效与时-效关系。在细胞凋亡的同时,P53蛋白的表达水平明显升高。结论PPARγ激动剂RGZ能显著抑制NB4细胞的生长并诱导细胞发生凋亡,升高促凋亡蛋白P53的表达水平可能是RGZ诱导NB4细胞发生凋亡的重要作用机制之一。     

腺病毒介导的PML(NLS-)过表达对白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响

目的 利用腺病毒介导PML(NLS-)的过表达,探讨PML(NLS-)对NB4白血病细胞增殖凋亡的影响.方法 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经Pac Ⅰ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度;重组腺病毒感染NB4细胞,荧光显微成像和流式细胞术检测感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NB4细胞中PML(NLS-)的转录及表达水平,MTT实验观察细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期及凋亡.结果 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经酶切和测序鉴定正确,经4轮扩增病毒滴度为1 ×1010pfu/mL;重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染NB4细胞效率达75％,PML(NLS-)基因可在NB4细胞中高效表达;NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体感染组(P＜0.05),S期细胞比例明显增高(P＜0.05),G2期细胞比例明显减少(P＜0.05);实验组细胞凋亡率明显低于空病毒感染组(P＜0.05).结论 PML(NLS-)过表达能够促进白血病NB4细胞的体外增殖能力,抑制其凋亡.     

紫草素通过下调c-MYC蛋白的表达抑制白血病NB4细胞的增殖

目的研究紫草素对人白血病NB4细胞增殖的影响及其作用机制。方法 CCK-8法检测NB4细胞增殖。流式细胞术检测细胞周期和凋亡。Western blot检测细胞c-MYC、ERK、p-ERK蛋白表达。用SPSS17.0软件包进行单因素方差分析及t检验。结果 NB4细胞经紫草素处理后,细胞活力受到明显抑制(P0.01);G1期细胞增多(P0.01),G2期和S期细胞减少(P0.01);细胞凋亡率明显增加(P0.01);c-MYC蛋白表达水平明显降低(P0.05),p-ERK水平明显升高(P0.01)。结论紫草素抑制NB4细胞增殖,可能机制是通过下调c-MYC蛋白的表达,EKR信号通路蛋白可能参与了这一过程。     

NLS-RARα通过激活AKT调节白血病NB4细胞的增殖

目的构建携带NLS-RARα的重组慢病毒,感染白血病NB4细胞并观察其对NB4细胞增殖和AKT蛋白的影响。方法以质粒p CMV-HA-NLS-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,将其亚克隆到慢病毒表达载体质粒LV5中,经DNA测序鉴定重组载体,用4质粒系统共转染293T细胞,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组慢病毒的滴度;重组慢病毒感染NB4细胞,经过嘌呤霉素筛选获得稳定转染NLS-RARα的NB4细胞株;CCK-8法检测NLSRARα对NB4细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期和感染效率;Western blot分别检测NLS-RARα、t-AKT和p-AKT的表达。结果 NLS-RARα克隆入LV5的多克隆位点,慢病毒浓缩后滴度为2×108Tu/m L;感染效率为86.54%;NLS-RARα能够明显促进细胞增殖,S期细胞增多,G1和G2期细胞减少;NLS-RARα基因在NB4细胞中稳定的表达,同时p-AKT明显增高,用PI3K抑制剂LY294002处理后p-AKT明显降低。结论 NLS-RARα通过激活AKT促进白血病NB4细胞的增殖。     

乌苯美司下调c-myc表达与其增强全反式维甲酸诱导NB4细胞

目的： 了解氨肽酶抑制剂乌苯美司（bestatin）能否增强全反式维甲酸（ATRA）对NB4细胞的诱导分化作用，及此过程中NB4细胞c-myc mRNA表达水平的改变。 方法： MTT法检测药物抑制细胞生长的作用。流式细胞仪测细胞表面分化抗原CD11b及四氮唑蓝（NBT）还原实验检测NB4细胞的分化。RT-PCR检测细胞c-myc mRNA表达水平。 结果： 50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L乌苯美司与10 nmoL/L ATRA联合处理72 h，均能明显增强NB4细胞的NBT还原能力，与10 nmoL/L ATRA组差异显著（P<0.05，P<0.01）。从48 h到96 h，100 mg/L乌苯美司时间依赖性地增强10 nmoL/L ATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力，与相应时点10 nmoL/L ATRA组差异明显（P<0.01）。100 mg/L乌苯美司与10 nmoL/L ATRA联合应用72 h，NB4细胞CD11b表达率明显高于10 nmoL/L ATRA组（P<0.01）。50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L乌苯美司与10 nmoL/L ATRA联合处理4 h，NB4细胞c-myc mRNA表达水平明显低于单用ATRA组（P<0.05，P<0.01）；药物联合应用各组NB4细胞的c-myc mRNA表达水平与NBT还原能力之间呈负相关（r=-0.917,P<0.05）。 结论： 乌苯美司可能通过下调NB4细胞c-myc mRNA的表达，从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用。     

过表达prohibitin促进NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡

目的构建人prohibitin基因真核过表达载体,探讨上调prohibitin对NB4-R1急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞凋亡的影响。方法 PCR钓取目的基因prohibitin,与pEGFP-N1-3FLAG真核载体定向连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将阳性重组载体pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin转染NB4-R1细胞,以实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测过表达效果,annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测prohibitin过表达对NB4-R1细胞凋亡的影响。结果 PCR筛选及测序比对,证明成功构建了prohibitin基因过表达载体;对NB4-R1细胞转染率可达70%以上;qRT-PCR结果显示转染pEGFP-N1-3FLAG-prohibitin过表达载体组(OE)prohibitin mRNA表达水平较空白对照组(CON)和阴性对照组(NC)分别上调(1.64±0.37)倍和(1.58±0.43)倍(P0.05),Western blot结果显示OE组prohibitin蛋白表达水平较CON组和NC组分别上调(1.91±0.33)倍和(1.99±0.37)倍(P0.05);流式细胞术结果表明CON组、NC组和OE组NB4-R1细胞凋亡率分别为(5.88±0.43)%、(6.63±0.46)%和(28.22±1.33)%,OE组较CON组和NC组细胞凋亡率分别增加了(3.80±0.24)倍和(3.39±0.30)倍(P0.05)。结论过表达prohibitin可诱导NB4-R1细胞凋亡。     

免疫荧光动态监测急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合蛋白变化

背景：实时定量RT-PCR只能间接地反映融合基因表达量的变化,并不能在细胞原位直观反映急性早幼粒细胞白血病患者细胞内PML-RARα融合蛋白在全反式维甲酸治疗前后的相对表达量。 目的：探讨免疫荧光技术检测融合蛋白PML-RARα表达的动态变化在判断急性早幼粒细胞白血病的全反式维甲酸早期治疗的效果。 方法：应用免疫荧光技术检测全反式维甲酸干预的急性早幼粒细胞白血病经典细胞株NB4细胞或来源于急性早幼粒细胞白血病患者的NB4细胞PML-RARα蛋白的表达,以实时定量RT-PCR检测细胞PML-RARα mRNA的表达作为对照,以评价免疫荧光技术的可靠性。 结果与结论：免疫荧光染色显示,无论是体外培养的NB4细胞,还是患者骨髓内的NB4细胞,在全反式维甲酸干预前细胞内均可见大量红色的融合蛋白PML-RARα,大小不均一、形状不规则,全反式维甲酸干预后,NB4细胞内红色的融合蛋白PML-RARα形状逐渐规则,弥散状态变为散在分布,且随着全反式维甲酸干预时间的延长,原有的弥散状态逐渐消失。实时定量RT-PCR测得的PML-RARα mRNA的变化趋势与免疫荧光相一致。说明免疫荧光技术检测PML-RARα能够更为直观地判断全反式维甲酸的治疗效果。 关键词：免疫荧光;实时定量RT-PCR;PML-RARα;急性早幼粒细胞白血病;NB4细胞;U937细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.036     

三氧化二锑诱导急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡的研究

目的 研究锑剂三氧化二锑（Sb2O3)对早幼粒细胞白血病细胞株NB4凋亡的诱导作用，以寻求早幼粒细胞白血病治疗的新方法。方法 采用细胞生长曲线，形态学及硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验，判定NB4细胞的生长，分化及功能。采用细胞周期分析和DNA电泳研究细胞凋亡。结果 Sb2O3能诱导早幼粒白血病细胞凋亡，且具有时间，剂量依赖性。结论 Sb2O3能有效地诱导早幼粒白血病细胞凋亡，提示锑剂诱导细胞半亡的疗法，有望成为临床治疗早幼粒细胞白血病的新方法。     

重组慢病毒LV5-NE的构建及NE促进NB4细胞增殖

目的构建重组慢病毒LV5-NE筛选纯NB4/LV5-NE细胞株,探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4增殖的影响,为研究NE致白血病的可能机制奠定基础。方法以质粒p CMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE,将NE基因连接到穿梭载体p GLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的质粒与包装质粒p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞。测定病毒滴度。实验分为空白组、LV5-NC组和LV5-NE组,病毒感染NB4细胞72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。用Western blot检测NE在NB4细胞中的蛋白表达以及其切割作用;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞术测定NB4细胞周期和凋亡;Western blot检测p Akt和Akt以及Bax和Bcl-2蛋白表达。结果成功构建表达NE的慢病毒LV5-NE,筛选得到纯NB4/LV5-NE细胞株,NE对NB4细胞的增殖有明显促进作用(P0.05)结论 NE在NB4细胞株中稳定表达后中可促进NB4细胞的增殖,其增殖作用可能通过激活PI3K/Akt通路调节。     

miR-181b对肝癌HepG2细胞增殖以及Bcl-2和SP1蛋白表达的影响

目的: 研究miR-181b对人肝癌G2细胞(HepG2)中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和转录因子SP1蛋白及mRNA表达的调节作用,探讨miR-181b对HepG2细胞增殖的影响。方法: 用人工合成的miR-181b相应的双链互补DNA片段,插入miRNASelect^TM pEGP-miR载体中,经测序鉴定后克隆microRNA的高表达质粒;用脂质体将miR-181b高表达质粒转染进HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选获得阳性克隆。用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测该细胞系中Bcl-2和SP1的mRNA和蛋白表达情况。用MTT法检测HepG2细胞增殖的变化情况。结果: Western blotting结果显示miR-181b能够减少Bcl-2和SP1蛋白质的表达,RT-PCR分析显示Bcl-2和SP1 mRNA表达减少。MTT显示转染后细胞的生长速率比未转染的细胞明显减慢。 结论: miR-181b抑制HepG2肝癌细胞增殖, 提示可能与其下调Bcl-2和SP1 的表达有关。     

Esculetin modulates cytotoxicity induced by oxidants in NB4 human leukemia cells

Esculetin is a polyphenolic compound with cytoprotective properties. We previously demonstrated the induction of apoptosis by esculetin in NB4 human leukemia cells, as a model, by a mechanism not well understood. To analyse the antioxidant activity of esculetin on apoptosis, we have studied the influence of co-treatments of esculetin at a concentration of 100 μM with exogenous ROS donors, namely tert-butyl-hydroperoxide and hydrogen peroxide, on NB4 cells. Esculetin (100 μM) exerts a protective effect on cell viability and death necrosis or late apoptosis caused by the oxidant t-BHP whereas it potentiates decrease of cell viability and cell death caused by H₂O₂. In the first case, the O₂^? scavenging activity of esculetin (100 μM) could be implicated. In the last one, cytotoxicity by apoptosis induction seems to be related to the increase in O₂^?, among other possible mechanisms. These results contribute to the study of the antitumor properties of esculetin by regulation of redox balance in leukemia cells.     

S100A4蛋白在卵巢浆液性腺癌中的表达及其临床意义

目的: 分析S100A4蛋白在卵巢浆液性腺癌中的表达及其与临床病理因素和预后的关系,探讨其在卵巢浆液性腺癌侵袭转移过程中的作用及判断卵巢浆液性腺癌患者预后的价值。方法: 用免疫组化方法检测S100A4蛋白在卵巢浆液性腺癌、卵巢浆液性腺瘤及卵巢交界性浆液性腺瘤组织中的表达,分析S100A4蛋白的表达与卵巢浆液性腺癌各临床病理因素及生存预后的关系。结果: S100A4蛋白表达定位在肿瘤细胞的细胞质和细胞核,在卵巢浆液性腺癌、卵巢交界性浆液性腺瘤和卵巢浆液性腺瘤组织中的高表达率分别为78%、30%和27%,S100A4蛋白在卵巢浆液性腺癌组织中的高表达率高于其它两个对照组,差异有统计学意义。S100A4蛋白表达与卵巢浆液性腺癌患者的病理分级、治疗后是否复发有关(均P＜0.05)。单因素分析显示患者无疾病进展时间和总生存时间均与S100A4蛋白表达有关(P＜0.05)。多因素Cox回归分析显示术后残留病灶大小和病理分级是影响卵巢浆液性腺癌预后的独立因素。结论: S100A4蛋白表达上调在卵巢浆液性腺癌的发生过程中可能起一定作用。病理分级高的卵巢浆液性腺癌细胞可能部分通过上调S100A4蛋白表达增强其侵袭转移能力。S100A4蛋白可能成为对卵巢浆液性腺癌患者复发风险预测和预后判断的指标之一。     

Comparative analysis of secretion of S100A4 metastatic marker by immune and tumor cells

S100A4 protein is present in low concentrations (2.1–15.7 ng/10⁶ cells) in lymphocyte and neutrophil culture medium. Addition of stimulants to the cells did not lead to an appreciable increase in the content of this protein. The initial content of S100A4 is significantly higher (92–447 ng/10⁶ cells) in culture media of highly metastatic KSML-100 adenocarcinoma and M3 and B16 melanoma cells. The release of S100A4 by these cells significantly increased after addition of lymphocytes and Tag7/Hsp70 cytotoxic complex. Repeated injection of antibodies to S100A4 to mice with transplanted M3 melanoma inhibited tumor growth. __________ Translated from Byulleten’ Eksperimental’noi Biologii i Meditsiny, Vol. 145, No. 1, pp. 85–87, January, 2008     

喜树碱诱导的HL-60细胞凋亡过程中线粒体的变化

目的:研究喜树碱(CPT)诱导的人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60凋亡过程中线粒体的质量和膜电势的变化。方法:以CPT诱导HL-60细胞凋亡为模型,利用膜联蛋白V(annexinV)-FITC/PI双染流式细胞术,研究HL-60细胞的凋亡和坏死。用DiOC6(3)染色流式细胞术,检测线粒体的膜电势(△ψm)。用NAO染色流式细胞术,检测线粒体的质量。结果:在4×10-6mol/LCPT的诱导下,HL-60细胞(12h)早期的凋亡率为(12.75±4.61)%,对照组为(2.88±2.49)%,二者相比较差异显著(P<0.01);CPT组坏死比率为(3.48±1.67)%,对照组为(0.71±1.10)%(P<0.01)。PI染色的结果显示,HL-60细胞(12h)晚期凋亡细胞的百分率,CPT组为(3.52±1.07)%,对照组为(0.46±1.06)%(P<0.01)。同时观察到,G2/M期细胞出现阻滞,G2/M期细胞的百分率,对照组为(22.46±2.19)%,CPT组为(13.45±1.91)%(P<0.01)。在12h时间点,CPT组线粒体的质量显著低于对照组(P<0.01),低线粒体质量的细胞所占百分率,对照组为(4.53±1.26)%,CPT组为(25.74±2.09)%。同时,CPT组线粒体的膜电势显著下降(P<0.01),CPT组线粒体膜电势降低的比率为(17.71±5.23)%,对照组为(1.64±2.00)%。结论:CPT诱导HL-60细胞凋亡过程中,线粒体的质量和膜电势均有所下降,但其去极化作用增强。     

介质阻挡放电等离子体诱导白血病细胞凋亡及其机制研究

目的 探索介质阻挡放电(DBD)等离子体对肿瘤细胞的杀伤作用并分析其凋亡机制.方法 利用噻唑蓝(MTT)检测低温等离子体在不同作用时间下对正常脾脏白细胞和大鼠急性早幼粒白血病细胞(LT-12)细胞毒性的影响,检测等离子体处理后细胞内活性氧(ROS)含量的变化,利用Annexin V/PI双染法检测不同作用时间剂量下细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR和Western Blot检测相关凋亡基因和蛋白的表达变化.结果 MTT结果表明,等离子体对细胞的杀伤呈作用时间剂量和时间依赖性,随着作用时间从30 s到240 s,处理8h后细胞的存活率从98％降至63％.在相同作用时间下,如240 s,细胞的存活率从2h的78％降至24 h的39％;Annexin V/PI双染法结果显示,等离子体作用可引起细胞凋亡,凋亡率不仅与等离子体作用时间剂量呈正相关,还与作用后的时间相关,等离子体处理后时间越长,其凋亡率越高,如处理12h后,细胞的凋亡率从60 s的48％增至120 s的55.3％;流式细胞仪检测的ROS的产生也显示了时间相关性,等离子体作用后其ROS立即增至1.24倍,至20 h急剧增高至5.39倍;qRT-PCR和Western Blot的实验结果表明,在等离子体处理后8～12 h Caspase家族和Bcl-2家族基因和蛋白表达非常活跃.结论 本研究表明低温等离子体能有效杀伤肿瘤细胞,凋亡是其主要的致死机制,并初步阐述了低温等离子体促进肿瘤细胞凋亡的分子机制.