乌苯美司下调c-myc表达与其增强全反式维甲酸诱导NB4细胞

目的： 了解氨肽酶抑制剂乌苯美司（bestatin）能否增强全反式维甲酸（ATRA）对NB4细胞的诱导分化作用，及此过程中NB4细胞c-myc mRNA表达水平的改变。 方法： MTT法检测药物抑制细胞生长的作用。流式细胞仪测细胞表面分化抗原CD11b及四氮唑蓝（NBT）还原实验检测NB4细胞的分化。RT-PCR检测细胞c-myc mRNA表达水平。 结果： 50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L乌苯美司与10 nmoL/L ATRA联合处理72 h，均能明显增强NB4细胞的NBT还原能力，与10 nmoL/L ATRA组差异显著（P<0.05，P<0.01）。从48 h到96 h，100 mg/L乌苯美司时间依赖性地增强10 nmoL/L ATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力，与相应时点10 nmoL/L ATRA组差异明显（P<0.01）。100 mg/L乌苯美司与10 nmoL/L ATRA联合应用72 h，NB4细胞CD11b表达率明显高于10 nmoL/L ATRA组（P<0.01）。50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L乌苯美司与10 nmoL/L ATRA联合处理4 h，NB4细胞c-myc mRNA表达水平明显低于单用ATRA组（P<0.05，P<0.01）；药物联合应用各组NB4细胞的c-myc mRNA表达水平与NBT还原能力之间呈负相关（r=-0.917,P<0.05）。 结论： 乌苯美司可能通过下调NB4细胞c-myc mRNA的表达，从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用。     

重组慢病毒表达PML核定位信号缺失体抑制急性早幼粒白血病细胞系c-Myc蛋白表达

目的构建携带PML(ΔNLS)基因的重组慢病毒,研究其对NB4细胞中c-Myc蛋白表达的影响。方法以质粒p CMV-HA-PML(ΔNLS)为模板,PCR扩增PML(ΔNLS)基因,克隆入慢病毒载体LV5-EF1a-GFP/puro,与p Helper 1.0和p Helper 2.0共转染293T细胞,包装病毒。收取病毒上清液,纯化后感染NB4细胞,荧光倒置显微镜观察感染效率,RT-PCR法检测PML(ΔNLS)mRNA的转录水平,Western blot检测PML(ΔNLS)、β-catenin、γ-catenin和c-Myc蛋白表达的变化。CCK-8实验观察细胞增殖。结果成功构建PML(ΔNLS)过表达慢病毒,病毒感染NB4细胞,感染效率达82.74%,LV5-PML(ΔNLS)携带的PML(ΔNLS)能够在NB4细胞中稳定表达;感染LV5-PML(ΔNLS)的NB4细胞中β-catnin、γ-catenin和c-Myc蛋白表达下降(P0.05);NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体组(P0.05)。结论成功构建了重组慢病毒PML(ΔNLS),PML(ΔNLS)过表达可促进NB4细胞体外增殖,并抑制c-Myc蛋白表达。     

全反式维甲酸通过降解核定位信号-视黄酸受体α促进人白血病细胞分化

目的研究全反式维甲酸(ATRA)对核定位信号-视黄酸受体α(NLS-RARα)过表达细胞分化的作用。方法用慢病毒在NB4细胞和U937细胞过表达NLS-RARα蛋白,用实时定量PCR检测NLS-RARα、 CD11b、 CCAAT增强子结合蛋白β(CEBPβ)的mRNA水平, Westernblot法检测NLS-RARα、 CD11b、 CEBPβ蛋白水平; ATRA处理后,用Western blot法检测细胞CD11b蛋白水平以及ATRA对NLS-RARα蛋白的降解情况;用改良Wright染色法观察细胞分化形态。结果慢病毒感染的NB4细胞和U937细胞过表达NLS-RARα蛋白,过表达NLS-RARα可下调细胞CD11b、 CEBPβ的表达水平; ATRA可以促进NLS-RARα过表达细胞的分化; ATRA可以降解NLS-RARα且呈时间浓度依赖性。结论 ATRA通过降解NLS-RARα促进白血病细胞的分化。     

紫草素通过下调c-MYC蛋白的表达抑制白血病NB4细胞的增殖

目的研究紫草素对人白血病NB4细胞增殖的影响及其作用机制。方法 CCK-8法检测NB4细胞增殖。流式细胞术检测细胞周期和凋亡。Western blot检测细胞c-MYC、ERK、p-ERK蛋白表达。用SPSS17.0软件包进行单因素方差分析及t检验。结果 NB4细胞经紫草素处理后,细胞活力受到明显抑制(P0.01);G1期细胞增多(P0.01),G2期和S期细胞减少(P0.01);细胞凋亡率明显增加(P0.01);c-MYC蛋白表达水平明显降低(P0.05),p-ERK水平明显升高(P0.01)。结论紫草素抑制NB4细胞增殖,可能机制是通过下调c-MYC蛋白的表达,EKR信号通路蛋白可能参与了这一过程。     

IL-1对维甲酸诱致高白细胞症的影响

使用生物活性检测法检测ATRA治疗前后APL患者血清中IL-1活性的动态变化,并分析IL-1活性与外周血白细胞数变化的相关性。观察经ATRA作用后不同时相NB4细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞上清液中IL-1活性的动态变化,并以RT-PCR法检测NB4细胞中IL-1 mRNA表达的变化。结果表明,患者外周血白细胞数及粒细胞数与血清中IL-1活性的变化相关;ATRA作用后,NB4细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞上清液中IL-1活性均呈时间依赖性增高;ATRA可上调NB4细胞中IL-1的表达。结论:ATRA治疗APL过程中,多种细胞来源的IL-1可能参与了高白细胞症的发生。     

腺病毒介导的PML(NLS-)过表达对白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响

目的 利用腺病毒介导PML(NLS-)的过表达,探讨PML(NLS-)对NB4白血病细胞增殖凋亡的影响.方法 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经Pac Ⅰ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度;重组腺病毒感染NB4细胞,荧光显微成像和流式细胞术检测感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NB4细胞中PML(NLS-)的转录及表达水平,MTT实验观察细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期及凋亡.结果 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经酶切和测序鉴定正确,经4轮扩增病毒滴度为1 ×1010pfu/mL;重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染NB4细胞效率达75％,PML(NLS-)基因可在NB4细胞中高效表达;NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体感染组(P＜0.05),S期细胞比例明显增高(P＜0.05),G2期细胞比例明显减少(P＜0.05);实验组细胞凋亡率明显低于空病毒感染组(P＜0.05).结论 PML(NLS-)过表达能够促进白血病NB4细胞的体外增殖能力,抑制其凋亡.     

周期蛋白E促进结直肠癌SW1116细胞增殖和侵袭

目的 探究周期蛋白E高表达对结直肠癌SW1116细胞增殖和侵袭的影响。方法 将SW116细胞分为周期蛋白E-过表达组、对照组与空载体组，免疫组化法检测各组细胞周期蛋白E的表达；实时定量PCR法检测周期蛋白E mRNA的表达；四甲基偶氮唑盐实验法(MTT)观察细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞周期；Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 与对照组与空载体组相比，周期蛋白E过表达组SW116细胞的周期蛋白E mRNA表达明显升高；在24h和48h时的细胞存活率明显升高；G₀/G₁期细胞比例明显升高，G₂/M期细胞比例明显降低；穿膜细胞数明显增加。结论 周期蛋白E促进结直肠癌SW1116细胞的增殖与侵袭。     

磷酸化缺陷型RARα1受体对人多发性骨髓瘤细胞体外增殖的影响

目的: 研究磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1(RARαS77A)对人多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖的影响。方法: (1)RT-PCR检测U266 细胞RARα受体亚型mRNA的表达;(2)RARαS77A过表达慢病毒载体的构建,慢病毒包装,滴度测定及MM细胞转染;(3)CCK-8检测全反式维甲酸(ATRA,0~100 μmol/L)处理或RARαS77A过表达慢病毒转染后U266 细胞的增殖;(4)Western blotting检测RARαS77A过表达慢病毒转染或ATRA处理后U266 细胞增殖相关蛋白Rb和P53的表达。结果: (1)U266为RARα1(+)、RARα2(-)细胞;(2)ATRA明显抑制U266 细胞增殖,其作用呈时间和剂量依赖性;RARαS77A过表达慢病毒转染48 h 后U266细胞增殖明显被抑制,抑制率为15.16%±3.84%;(3)RARαS77A过表达慢病毒转染及ATRA处理均可上调U266细胞Rb蛋白表达及下调其P53蛋白表达。结论: 磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1与ATRA均可通过上调Rb及下调P53表达抑制RARα1(+)、RARα2(-)的U266细胞增殖,提示降低维甲酸受体RARα1的磷酸化是ATRA抑制MM细胞增殖的一个重要作用途径。     

油酸调节人血管平滑肌细胞TLR4的增殖活性及炎性因子的表达

目的 探讨油酸对人主动脉血管平滑肌细胞TLR4及炎性因子表达的调节作用.方法 MTT法检测细胞增殖活性;实时荧光定量PCR法检测TLR4及炎性因子mRNA的表达;Western blot法检测细胞TLR4蛋白表达,ELISA法检测炎性因子蛋白含量.结果 油酸促进人主动脉血管平滑肌细胞增殖活性,增加油酸浓度,抑制细胞增殖.油酸上调TLR4、IL-6、IL-8和MCP-1 mRNA表达最大幅度为6.5、7.4、7.4和7.1倍.IL-6、IL-8和MCP-1蛋白表达最大上调幅度为2.16、1.93和2.06倍.200 μmol/L组TLR4蛋白表达的吸光度值为(1.70±0.62),与对照组(0.29 ±0.22)比较P＜0.05.LPS组TR4、IL-6、IL-8和MCP-1的表达明显增加(P＜0.05).结论 油酸促进人主动脉血管平滑肌细胞TLR4及炎性因子mRNA及蛋白表达.     

人剪切修复基因XPD肝癌对人HepG2细胞中Rb和MAD2表达的影响*

 目的：探讨人剪切修复基因着色性干皮病D组基因（xeroderma pigmentosum group D, XPD)转染人肝癌HepG2细胞后视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)和有丝分裂阻滞缺陷蛋白 2（mitotic arrest deficient 2, MAD2）表达的变化及对细胞增殖的影响。方法：将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞。实验分为4组,分别为无转染HepG2细胞组（空白对照组）、脂质体转染HepG2细胞组（脂质体组）、空载质粒pEGFP-N2转染细胞组（N2 组）和重组质粒pEGFP-N2-XPD转染细胞组（XPD组）。分别用RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中XPD、Rb及MAD2 mRNA和蛋白的表达量,用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期。结果：与其它3组相比,XPD组XPD mRNA及蛋白表达量明显升高（P<0.05）,Rb mRNA及蛋白表达量明显升高（P<0.05）,而MAD2 mRNA及蛋白表达量显著降低（P<0.05）。XPD组细胞增殖活力显著降低,细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。XPD组细胞停滞在G1期,难以进入S期。结论：XPD可以抑制MAD2的表达和肝癌细胞的增殖,促进Rb的表达。     

Differential cell fates induced by all-trans retinoic acid-treated HL-60 human leukemia cells

HL-60 human leukemia cells, differentiated into a neutrophil lineage by all-trans retinoic acid (ATRA) treatment, express three members of the carcinoembryonic antigen (CEA) gene family, CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1; CD66a), CEACAM3 (CD66d), and CEACAM6 (CD66c). CD66d is a neutrophil lineage-specific marker, and CD66a and CD66c are found on epithelial and other cells. HL-60 cells continuously treated with ATRA underwent apoptosis, and cells transiently treated for 1 day underwent cell-cycle arrest, entered into senescence, and exhibited reduced apoptosis with CD66-positive cells accounting for the majority of live cells. CD66 antigens were also induced in NB4 leukemic cells upon continuous treatment with ATRA. NB4 cells underwent apoptosis with a higher frequency in transient versus continuous-treated cells (38% vs. 19% at Day 5), in contrast to HL-60 cells that underwent cell-cycle arrest and senescence when transiently treated with ATRA. CD66 antigens were not induced in transient, ATRA-treated NB4 cells compared with HL-60 cells. Cell-cycle arrest in HL-60 cells involved reduction in expression levels of p21, cyclins D and E, while Rb1 exhibited reduction in protein levels without changes in mRNA levels over the time course of ATRA treatment. Analysis of several proapoptotic proteins implicated the activation of calpain and cleavage of Bax in the intrinsic apoptotic pathway, similar to published studies about the apoptosis of neutrophils. CD1d expression was also induced by ATRA in HL-60 cells and ligation with anti-CD1d antibody-induced apoptosis. In contrast, CD1d-positive primary monocytes were protected from spontaneous apoptosis by CD1d ligation. These studies demonstrate distinct cell fates for ATRA-treated HL-60 cells that provide new insights into ATRA-induced cell differentiation.     

C6 glioma cells differentiated by retinoic acid overexpress the glutamate transporter excitatory amino acid carrier 1 (EAAC1)

The transport of excitatory amino acids (EAA) in CNS is performed by a family of high affinity, sodium dependent carriers. One of these transporters, excitatory amino acid carrier 1 (EAAC1), is known to be regulated by several mechanisms that modify carrier abundance on the plasma membrane. Much less is known on EAAC1 regulation at the level of gene expression. Here we report that, in C6 rat glioma cells, a line recently described to contain neural stem-like cells, EAAC1 is markedly induced by all trans-retinoic acid (ATRA), a well known differentiating agent. Consistently, ATRA stimulates EAA transport, with the maximal effect observed at concentrations>or=1 microM. After 4 days of treatment with 10 microM ATRA, the transport Vmax is fivefold enhanced, Slc1a1 mRNA is increased by 400% compared with control, EAAC1 carrier is sixfold overexpressed and the C6 culture is greatly enriched of cells with bipolar morphology strongly positive for EAAC1 immunoreactivity. Compared with untreated cells, ATRA-treated C6 cells express less Slc1a3 mRNA, for the transporter GLAST, but significantly higher levels of Slc1a2 mRNA, for the transporter GLT-1, although no expression of either protein is detected with Western blot in both untreated and ATRA-treated cells. Consistently, the inhibition pattern of aspartate transport and its stimulation by phorbol esters are indicative of a transport process due to EAAC1 operation. Under the conditions adopted, ATRA treatment causes the induction of proteolipid protein, an oligodendrocytic marker. These results indicate that, in C6 cells, ATRA stimulates the expression of EAAC1, possibly as a step toward oligodendrocytic differentiation, and constitute the first demonstration of the induction of this transporter by a differentiating agent.     

NLS-RARα Inhibits the Effects of All-trans Retinoic Acid on NB4 Cells by Interacting with P38α MAPK

Nuclear localization signal retinoic acid receptor alpha(NLS-RARα), which forms from the cleavage of promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor alpha(PML-RARα) protein by neutrophil elastase(NE), possesses an important role in the occurrence and development of acute promyelocytic leukemia(APL). However, the potential mechanism underlying the effects of NLS-RARα on APL is still not entirely clear. Here, we investigated the effects of NLS-RARα on APL NB4 cells and its mechanism. We found that all-trans retinoic acid(ATRA) could promote differentiation while inhibit proliferation of APL NB4 cells via upregulating the expression of phosphorylated p38α mitogen-activated protein kinase(p-p38α MAPK). We also found that NLS-RARα could inhibit differentiation while accelerate proliferation of NB4 cells via downregulating the expression of p-p38α protein in the presence of ATRA. Furthermore, immunofluorescence and co-immunoprecipitation assays confirmed NLS-RARα interacted with p38α protein directly. Finally, application of PD169316, an inhibitor of p38α protein, suggested that recruitment p38α-combinded NLS-RARα by ATRA eventually caused activation of p38α protein. In summary, our study demonstrated that ATRA cound promote differentiation while inhibit proliferation of APL NB4 cells via activating p38α protein after recruiting p38α-combinded NLS-RARα, while NLS-RARα could inhibit the effects of ATRA in the process.     

干扰TGF-βⅡ型受体表达对NB4细胞增殖、分化及凋亡的影响

目的:研究干扰TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ)表达对人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞生长、分化及凋亡的影响。方法:应用慢病毒介导RNA干扰技术,下调NB4细胞TβRⅡ基因的表达,获得TβRⅡ-shRNA NB4细胞,CCK-8法检测细胞的活力,流式细胞术检测CD11b表达,并用瑞氏-吉姆萨染色法检测全反式维甲酸对细胞分化的影响; Annexin V-FITC/PI双荧光标记法及AO/EB染色观察三氧化二砷对细胞凋亡的影响。结果:TβRⅡ-shRNA NB4细胞的活力高于NB4细胞。采用不同浓度(0. 01、0. 02、0. 04、0. 08和0. 1μmol/L)的全反式维甲酸进行96 h的孵育后,2组细胞均出现分化现象(CD11b表达增加),并呈剂量依赖性,但TβRⅡ-shRNA NB4细胞的分化率低于NB4细胞。不同浓度(2、4和8μmol/L)的三氧化二砷孵育24 h后,2组细胞均出现凋亡现象(AO/EB染色),呈剂量依赖性,但TβRⅡ-shRNA NB4细胞凋亡率显著低于NB4细胞,其中用8μmol/L三氧化二砷孵育TβRⅡ-shRNA NB4细胞和NB4细胞24 h,凋亡率分别是(49. 15±2. 05)%和(66. 85±2. 41)%(P 0. 01)。结论:下调TβRII可以促进NB4细胞的生长,部分拮抗全反式维甲酸诱导的细胞分化及三氧化二砷诱导的细胞凋亡。     

全反式维甲酸对人胚肺成纤维细胞增殖及α-SMA表达的影响

目的: 研究全反式维甲酸(ATRA)对人胚肺成纤维细胞(HFL-I)增殖与分化的影响。方法: 体外培养HFL-I, MTT法检测不同浓度ATRA(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)作用3 d对HFL-I增殖能力的影响。5 μg/L 转化生长因子β₁(TGF-β₁)刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后,RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA表达,刺激0 d、1 d、3 d、5 d后,Western blotting法检测α-SMA蛋白表达。不同浓度ATRA干预,24 h后RT-PCR方法检测α-SMA mRNA表达,3 d后用Western blotting方法检测α-SMA蛋白表达。结果: (1) MTT法检测显示不同浓度ATRA以浓度依赖性方式抑制HFL-I细胞的增殖(P<0.05)。(2)5 μg/L TGF-β₁诱导后,HFL-I细胞中α-SMA mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05)。(3) ATRA以浓度依赖性方式下调TGF-β₁诱导的α-SMA mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论: ATRA能够抑制HFL-I细胞的增殖和TGF-β₁诱导的分化,该作用可能是通过下调α-SMA mRNA和蛋白的表达实现的。     

洛伐他汀对NB4细胞ras基因p21Ras膜结合作用影响的体外试验

目的:探讨洛伐他汀(LOV)对人白血病NB4细胞的作用及其机制。方法:以MTT比色法首先观察LOV对NB4细胞增殖的影响;利用逆转录-聚合酶链反应半定量测定LOV作用于NB4细胞不同时间H-ras、K-ras、N-ras癌基因mRNA表达水平;同时采用流式细胞术测定NB4细胞p21^Ras总蛋白、膜蛋白的表达。结果:①LOV抑制NB4细胞增殖,IC50为12.59μmol/L。②NB4细胞H、K、N-ras基因表达均为阳性。③LOV处理不同时间的NB4细胞H、K、N-ras基因转录水平无明显变化;p21^Ras总蛋白水平也无变化,而细胞膜表面p21^Ras蛋白水平随时间进行性下降。结论:LOV抑制NB4细胞增殖。LOV靶向HMG-CoA还原酶,抑制p21^Ras蛋白异戊二烯化、阻滞p21^Ras蛋白与细胞膜结合;不影响ras癌基因以及p21^Ras总蛋白的表达。     

胶质瘤细胞维甲酸代谢调控机制及其对细胞增殖的影响

目的: 探讨胶质瘤细胞中的维甲酸合成调控机制,以及维甲酸对人脑胶质瘤细胞SWO-Z2的增殖抑制作用及可能的机制。方法: 运用小分子RNA干扰Krüppel 样转录因子9(KLF9);Real-time PCR和Western blotting检测 KLF9 基因RNAi沉默效率。 KLF9 基因干扰后,运用Western blotting检测醛脱氢酶1家族成员A1(ALDH1A1)蛋白表达的变化。应用CCK-8法从3种类型维甲酸药物(13-顺维甲酸、9-顺维甲酸和全反式维甲酸分别简称13- cis RA、9- cis RA和ATRA)中筛选出对SWO-Z2细胞活性抑制作用最强的药物。Western blotting检测不同浓度ATRA作用SWO-Z2细胞后增殖相关蛋白cyclin D1、Bcl-2、cleaved PARP以及胶质瘤分化标记物GFAP的表达情况。Real-time PCR检测SWO-Z2细胞的维甲酸受体表达情况。结果: 小分子RNA干扰 KLF9 基因后, 成功下调KLF9表达,引起ALDH1A1 mRNA和蛋白表达都下降。3种类型维甲酸中ATRA对SWO-Z2细胞的增殖活性抑制作用最强。ATRA作用SWO-Z2细胞72 h后cleaved PARP蛋白激活,cyclin D1和Bcl-2表达水平下降,而GFAP表达没有改变。SWO-Z2细胞维甲酸受体(RARs)表达降低。结论: KLF9作为 ALDH1A1 基因的上游调控基因,通过正调控 ALDH1A1 基因的表达促进胶质瘤细胞中的维甲酸合成;ATRA处理SWO-Z2细胞后未能促进胶质瘤分化而是明显抑制肿瘤细胞增殖能力,可能是由于胶质瘤细胞内缺乏维甲酸受体所致。