辛二酰苯胺异羟肟酸通过内质网应激凋亡通路诱导HepG2细胞凋亡

目的:探讨辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对人肝癌细胞株HepG2增殖与凋亡的影响及其可能的机制。方法:分别给予不同浓度的SAHA处理HepG2细胞48 h,采用实时无标记细胞分析法检测细胞增殖情况;Western blot法检测组蛋白H3K9和H3K27的乙酰化水平,以及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和p-PERK蛋白水平的变化;流式细胞术检测细胞凋亡。结果:与对照组相比,0.1和1μmol/L SAHA处理48 h对HepG2细胞增殖无明显抑制作用,6和12μmol/L SAHA组HepG2细胞增殖率明显下降(P0.05);Western blot检测发现,与对照组比较,不同浓度的SAHA处理细胞48 h后,ac H3K9和ac H3K27表达水平明显升高,GRP78蛋白表达显著上调,PERK蛋白表达显著下调,而p-PERK的蛋白水平显著增加(P0.05);流式细胞术检测发现,随着SAHA浓度的增高,HepG2细胞的凋亡逐渐增加。结论:SAHA可上调HepG2细胞中组蛋白H3K9和H3K27的乙酰化修饰水平,并通过激活内质网应激相关凋亡通路来诱导HepG2细胞发生凋亡。     

辛二酰苯胺异羟肟酸诱导大鼠原代肝星状细胞凋亡

目的:通过研究辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)凋亡及相关蛋白表达的影响,探讨SAHA诱导HSCs凋亡的作用机制。方法:采用Opti Prep梯度离心法分离大鼠原代HSCs;通过实时细胞分析技术检测SAHA对HSCs增殖的影响;倒置显微镜观察不同浓度SAHA处理HSCs后的形态变化;荧光显微镜及流式细胞术Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率;Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的蛋白表达;免疫共沉淀法检测GRP78蛋白与HDAC6蛋白是否形成复合物。结果:成功分离的HSCs连续培养14 d,HSCs逐渐由静止状态变为激活状态。SAHA可显著抑制HSCs增殖,且呈剂量时间依赖性(P0.05);SAHA对HSCs的促凋亡作用具有时间依赖性(P0.05)。SAHA处理HSCs后,α-SMA、Ⅰ型胶原、HDAC6和TIMP1的蛋白表达水平明显降低(P0.05),GRP78的蛋白表达水平明显升高(P0.05)。与激活型的HSCs相比,SAHA处理后的HSCs中免疫共沉淀下的蛋白复合物中GRP78与总的乙酰化赖氨酸蛋白显著增多,而HDAC6蛋白显著降低,同时证明GRP78与HDAC6形成复合物。结论:SAHA抗肝纤维化的机制可能是,SAHA下调HDAC6蛋白表达水平,上调乙酰化GRP78蛋白表达水平,诱导HSCs内质网应激,促进肝星状细胞凋亡,从而起到抗肝纤维化的作用。     

大鼠原代肝星状细胞活化后组蛋白修饰水平的观察

目的:观察体外培养大鼠肝星状细胞(HSCs)活化过程中组蛋白修饰的改变以及与HSCs活化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的关系,探讨组蛋白修饰在HSCs活化过程中可能的作用。方法:体外分离、鉴定、培养大鼠HSCs,光镜观察HSCs活化过程中的形态变化,细胞免疫荧光染色和Western blotting检测desmin和α-SMA的表达,比较静止型HSCs和激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化、H3K4二甲基化和H3K9二甲基化的变化。结果:(1)细胞形态学观察结果表明HSCs在培养过程中形态由静息状态向高度分化的肌成纤维细胞转化。细胞免疫荧光染色及Western blotting检测结果显示,分离培养24 h的HSCs有desmin表达,但几乎不表达α-SMA;随着培养时间延长,HSCs内α-SMA和desmin表达逐步增加,至15 d时达到最大。(2)根据HSCs细胞形态变化及HSCs活化标志蛋白检测结果,确定培养24 h的HSCs为静止型HSCs,培养15 d的HSCs为激活型HSCs,分别检测其组蛋白修饰变化。结果显示,与静止型HSCs比较,激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化和H3K9二甲基化修饰水平明显降低(P0.01),而H3K4二甲基化修饰水平明显增加(P0.01),且H3K4二甲基化修饰水平变化与α-SMA表达变化一致。结论:在体外培养HSCs活化过程中,组蛋白修饰发生明显异常,提示组蛋白修饰改变有可能参与了HSCs活化以及肝纤维化的发生。     

IOX1对TGF-β诱导的LX2细胞增殖、凋亡及细胞外基质相关蛋白表达的影响

目的:探讨组蛋白去甲基化酶抑制剂IOX1(5-羧基-8-羟基喹啉)提高组蛋白H3第9位赖氨酸二甲基化(H3K9me2)水平对转化生长因子β(TGF-β)诱导的人肝星状细胞株LX2增殖、凋亡及细胞外基质合成和代谢的影响。方法:采用实时无标记细胞分析技术动态观察不同浓度IOX1对TGF-β诱导的LX2细胞增殖的影响。采用流式细胞术观察IOX1对TGF-β诱导的LX2细胞凋亡的影响。Western blot检测细胞中H3K9me2水平,以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col I)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)蛋白的表达。结果:与对照组相比,不同浓度的IOX1均能抑制LX2细胞增殖。流式细胞术结果表明,IOX1能够促进LX2细胞凋亡(P<0. 05)。Western blot结果发现,IOX1能提高LX2中H3K9me2水平,且呈剂量依赖性(P<0. 05);与对照组相比,300μmol/L IOX1能够明显抑制TGF-β诱导的LX2细胞中α-SMA、TIMP-1和Col I蛋白的表达(P<0. 05),MMP-1蛋白...     

X线放射诱导大鼠心肌细胞系H9c2损伤中组蛋白乙酰化水平降低

目的研究辐射暴露对心肌细胞的影响及组蛋白乙酰化的修饰变化,分析其相关性并探讨其机制。方法将大鼠心肌细胞系H9c2分为对照组和放射组,放射组分别用X线给予2、4、6和8 Gy剂量照射。48 h后,通过比色法检测细胞培养上清乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞内丙二醛(MDA)含量及过氧化物歧化酶(SOD)活性;用annexin V-FITC/PI染色及流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase3及组蛋白乙酰化相关蛋白H3K9ac、HDAC3表达。结果与对照组相比,不同剂量照射组细胞上清LDH相对活性增加(P0.05),细胞内MDA相对含量增加(P0.05),细胞内SOD相对活性降低(P0.05);此外放射组细胞凋亡率明显增高(P0.05),并且Bcl-2蛋白表达水平降低(P0.05),caspase-3蛋白表达水平增高(P0.05);同时与对照组相比,放射组组蛋白H3乙酰化水平降低(P0.05),HDAC3表达水平增高(P0.05)。结论辐射暴露导致H9c2细胞损伤并诱导其凋亡,此过程中细胞内组蛋白乙酰化水平降低,而HDAC3可能是调节组蛋白乙酰化水平的主要因子。     

肝纤维化大鼠肝脏中组蛋白修饰水平的变化

目的:观察肝纤维化大鼠肝脏中组蛋白修饰的变化,并探讨其在肝纤维化发生发展过程中可能的作用。方法:雄性Wistar大鼠20只,随机分为正常对照组和肝纤维化组,其中肝纤维化组采用CCl_4皮下注射以制备大鼠肝纤维化模型,正常组注射等量植物油溶液。实验第8周末,股动脉放血处死大鼠,取2组血清,采用生化和放射免疫法测定血清肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST),以及肝纤维化标志物血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的水平;取2组大鼠肝脏,测定肝脏指数;取肝组织常规固定,HE染色和Masson染色观察组织病理改变及胶原纤维沉积情况;Western blot检测2组大鼠肝脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原(ColⅠ)表达情况,以及acH4K12、acH3K9、H3K4me2和H3K9me2修饰水平的变化。结果:与对照组相比,模型组大鼠肝脏指数及ALT、AST、HA、LN、ColⅣ和PCⅢ水平明显增高(P0.05);Western blot检测发现,与对照组比较,肝纤维化组大鼠肝组织的acH4K12修饰水平减少(P0.05),acH3K9和H3K9me2修饰水平及α-SMA和ColⅠ表达明显增加(P0.05),H3K4me2修饰水平的差异无统计学显著性。结论:肝纤维化大鼠肝脏中acH4K12、acH3K9和H3K9me2修饰水平改变可能与某些细胞外基质代谢相关基因转录调控有关,从而参与了大鼠肝纤维化发生。     

HDACi诱导B细胞淋巴瘤表达CD47分子机制研究

研究探讨B细胞淋巴瘤中组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)调控CD47表达及相关分子机制。课题组对小鼠B淋巴瘤细胞系A20进行不同剂量和不同时间长度的广谱HDACi (Vorinostat,SAHA)处理后,流式细胞术检测细胞表面CD47分子表达水平。随后用TRIzol法提取经SAHA处理的小鼠和人源B淋巴瘤细胞系样本中总mRNA,检测CD47转录水平。为进一步研究HDACi调控CD47表达的分子机制,课题组采用染色质免疫共沉淀法检测H3K4ac、H3K9ac和H3K27ac与CD47 DNA启动子区域的结合情况。最后在SAHA和BRD4特异性抑制剂JQ1的联合处理下,通过流式细胞术检测淋巴瘤细胞中CD47表达水平变化。研究发现CD47的蛋白质水平及mRNA水平均与SAHA处理时间和作用剂量呈正相关性。而在CD47启动子区域,H3K4、H3K9和H3K27的乙酰化水平在SAHA处理后都有显著提高。此外,SAHA和JQ1的联合使用能够显著抑制SAHA单独作用时对CD47的上调。以上结果说明SAHA通过增强CD47启动子区域所结合组蛋白的乙酰化水平,促进基因的转录表达,上调了CD47的mRNA和蛋白质水平,而抑制BRD4可以逆转SAHA对CD47的上调作用。     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对肝星状细胞增殖活化的影响

目的 观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化的影响,并探讨其作用机制.方法 体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,设立空白对照组和3-MA低剂量组(2.5 mmol/L)、中剂量组(5 mmol/L)、高剂量组(10 mmol/L).RT-PCR分析不同浓度3-MA对HSC活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响,Western blot法检测不同浓度3-MA对HSC中自噬水平标志蛋白LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白表达水平的影响;MTT法检测3-MA对HSC增殖的影响,流式细胞术分析3-MA对HSC细胞周期的影响.结果 低、中、高剂量3-MA作用于HSC后,HSC-T6细胞自噬水平随3-MA浓度升高逐渐下降,α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05),LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05).与对照组相比,低、中、高剂量时3-MA对HSC增殖的影响均显著下降(P＜0.05),G2期比例与对照组比较均明显增加(P＜0.05).结论 3-MA可下调大鼠HSC-T6细胞LC3Ⅱ的表达,抑制α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA及蛋白的表达,使HSC-T6细胞周期停滞于G2期,抑制HSC增殖活化.     

山姜素诱导组蛋白去乙酰化并调控炎症基因表达的实验研究

目的通过检测山姜素作用下鼠巨噬细胞(RAW246.7)炎症基因启动子部位结合组蛋白乙酰化修饰状态以及炎症因子表达,初步揭示山姜素调节炎症因子表达的表观遗传学作用机制。方法采用不同质量浓度(10~200μg/ml)山姜素培养RAW246.7,培养结束后ELISA法检测养基中IL-6以及肿瘤坏死因子a(TNF-α)质量浓度,染色质免疫共沉淀(Chip-q PCR)法检测上述基因启动子片段结合的去乙酰化/乙酰化组蛋白(H3K9以及H3K14)表达比值,Pearson相关分析比值与炎症因子质量浓度的关联情况。结果山姜素呈剂量依赖性抑制RAW246.7细胞IL-6以及TNF-α表达,同时明显上调RAW246.7胞内IL-6以及TNF-α启动子片段结合的去乙酰化/乙酰化H3K9比值,且上述比值与炎症因子的表达水平呈负相关(P0.05);山姜素作用下炎症基因启动子片断结合的去乙酰化/乙酰化H3K14比值无明显变化。结论山姜素可能通过诱导炎症基因的启动子部位组蛋白H3K9去乙酰化以调节炎症因子的合成,提示表观遗传学修饰很可能是山姜素干预炎症性疾病的重要机制。     

UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进H3K9乙酰化抑制细胞增殖

目的探讨UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中对H3K9乙酰化及细胞增殖的影响。方法体外培养HEK293细胞,构建羟基脲所致的DNA损伤细胞模型;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒,用Western blot评估p CMV-3×Flag-UHRF2转染效率及H3K9乙酰化水平;CCK8法检测HEK293细胞增殖。结果 HEK293细胞经2.5 mmol/L羟基脲处理12 h后,DNA出现了明显的损伤;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒后,UHRF2蛋白表达显著升高(P0.01);DNA损伤应答中H3K9乙酰化显著增加(P0.05);细胞增殖能力明显下降(P0.05)。结论 UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进组蛋白H3K9乙酰化抑制细胞增殖。     

碧萝芷通过下调ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化

目的:探究碧萝芷对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肝星状细胞活化的影响。方法:5μg/L TGF-β1和不同浓度碧萝芷(0、10、25、50 mg/L)分别作用于LX-2细胞,在有或无自噬抑制剂3-MA和ERK抑制剂PD98059的情况下,用MTT法检测细胞活力的变化,Western blot实验检测α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平的变化。结果:与对照组相比,5μg/L TGF-β1组的LX-2细胞活力以及α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin 1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平明显增加(P0.05)。而碧萝芷预处理能逆转上述效应,并呈现一定的剂量依赖性,50 mg/L碧萝芷的抑制效果最为显著(P0.05)。而且,与TGF-β1组相比较,50 mg/L碧萝芷、5 mmol/L 3-MA或者20μmol/L PD98059预处理下,TGF-β1诱导的LX-2细胞活力以及α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均明显下调(P0.05)。结论:碧萝芷通过下调ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化。     

糖尿病大鼠肾组织中miR-21和SnoN表达的变化

目的探讨糖尿病(DM)大鼠肾组织中微小核糖核酸-21(miR-21)和核转录共抑制因子(SnoN)在肾纤维化过程中的表达变化及其可能机制。方法用链脲佐菌素复制DM大鼠模型,并设对照组(NC),每组n=8。10周后处死大鼠,观察肾组织形态变化;免疫组织化学染色、Western blot及RT-q PCR检测miR-21、SnoN、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3、p-Smad3(Ser423/425)、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)和胶原蛋白Ⅲ(collagenⅢ)的表达。结果与对照组相比,DM组肾组织p-Smad3(Ser423/425)、TGF-β1和α-SMA蛋白表达增加(P0.05),SnoN、E-cadherin蛋白表达减少(P0.05),但SnoN mRNA和miR-21表达明显上调(P0.05),并伴有collagenⅠ、collagenⅢ和FN在间质沉积增多。结论 TGF-β1可能上调miR-21表达,抑制SnoN翻译水平的表达,促进DN的纤维化病变。     

P38 MAPK信号通路在漆树酸改善苯肾上腺素诱导的小鼠心肌细胞肥大中的作用

目的:探讨P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase, P38 MAPK)信号通路在漆树酸改善苯肾上腺素(phenylephrine, PE)诱导的小鼠心肌细胞肥大中的作用。方法:原代培养新生小鼠心肌细胞,PE诱导心肌细胞肥大。按随机数字表法将细胞分为空白对照组、溶剂对照组、PE组、PE+漆树酸组、PE+漆树酸+P38抑制剂组和PE+P38抑制剂组。收集干预48 h后的乳鼠心肌细胞进行以下检测:Western blot检测p-P38、第9位赖氨酸乙酰化的组蛋白H3(acetylated histone H3 at lysine 9, H3K9ac)和心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)的蛋白表达水平,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)法验证p-P38与H3K9ac蛋白之间的相互作用,RT-qPCR检测肌细胞增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C, MEF2C)mRNA表达水平,免疫荧光染色观察小鼠心肌细胞表面积。结果:West...     

Monocyte-derived immature dendritic cells negatively regulate hepatic stellate cells in vitro by secreting IL-10

The development of liver fibrosis is associated with inflammatory responses resulting from chronic liver disease. Immature dendritic cells (imDCs) play an important role in modulating the inflammatory environment of the liver. This study investigated the effects of imDCs on the regulation of hepatic stellate cells (HSCs) during liver fibrosis. We isolated and induced imDCs from monocytes of healthy volunteers, activated LX-2 cells with TGF-β to establish in vivo liver fibrosis HSCs model, and then set up a cell co-culture system with transwell membranes. imDC surface markers and apoptosis rates of LX-2 cells were detected by flow cytometry. The concentration of IL-10 secreted by imDC was measured through ELISA. The expression of α-SMA in LX-2 after co-culture was examined by qRT?PCR. Proliferation of LX-2 cells were detected by CCK-8. The western blot was used to illustrate the LX-2 activation-related proteins such as Smad3/7 and TGF-β1. The imDCs co-culture group and the interleukin-10 (IL-10) treatment group had similar results, as they were both able to increase apoptosis, inhibit proliferation, downregulate α-SMA mRNA, and reduce TGF-β1 and Smad3 protein expression in LX-2 cells. Additionally, the Smad7 protein level was increased after treatment with imDC and IL-10. However, the results in the IL-10 antagonist group showed the opposite trend to that of imDCs and IL-10 groups. Thus, these results suggest that imDC secretion of IL-10 negatively regulates activated LX-2 cells, probably via inhibition of the TGF-β1/Smad3 pathway and increased expression of Smad7 protein. This may be a potential therapeutic target for liver fibrosis.     

苯中毒病人TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白化学修饰改变

目的:研究拓扑异构酶Ⅱα(TOPOⅡα)启动子调控因子SP1组蛋白化学修饰在苯中毒病人中的改变。方法:25例临床慢性苯中毒患者骨髓单个核细胞为病例组,25例正常人骨髓单个核细胞为对照组,染色质免疫沉淀技术探讨TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白乙酰化和甲基化水平的变化,RT-PCR法测定Sp1 mRNA的表达水平。结果:与对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4和H3乙酰化水平下降(P0.01),组蛋白H3K9甲基化水平升高(P0.01),组蛋白H3K4甲基化水平无明显改变。与正常对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1的mRNA表达水平降低(P0.05)。结论:慢性苯中毒TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰水平的改变伴随着mRNA水平的变化。TOPOⅡα启动子调控因子Sp1可能通过组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰改变在苯中毒所致的造血毒性中发挥作用。