大鼠缺血缺氧过程脑皮质神经化学物质的变化

 【目的】运用离体高分辨质子磁共振波谱学(1H nuclear magnetic resonance spectroscopy,1H NMRS)方法对全脑缺血后大鼠脑皮质神经代谢和神经化学物质的变化进行检测,探讨其在缺血再灌注损伤的病理生理过程中的作用?【方法】 雄性Wistar大鼠30只,随机分为假手术组(对照组,n=15)及实验组(缺血/再灌注组,n=15);其中,两组动物再分为两个组,即液体高分辨组(n=8)?免疫组化组(n=7);实验组动物接受全脑缺血再灌注的处理?观察全脑缺血/再灌注后大鼠脑皮质内的神经化学或神经代谢物包括肌酸/磷酸肌酸(creatine,Cr)?乳酸(lactic acid, Lac)?N-乙酰-天冬氨酸复合物(N-acetyl-aspartate, NAA)?γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric acid, GABA)?谷氨酸(glutamate, Glu)?谷氨酰胺(glutamine,Gln)?牛磺酸(taurine,Tau)以及肌醇(myo-inositol, myo-Ins )等浓度的变化?同时采用免疫组织化学的方法,对该脑皮质区域内的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的变化进行观察?【结果】 与对照组相比较,所检测的实验组大鼠脑皮质的主要神经化学物质中(mmol/kg)Lac(10.97 ± 1.07)?Gln(5.57 ± 0.34)和Tau(6.11 ± 0.31)总浓度显著升高(P < 0.05),Glu(10.41 ± 0.61)的总浓度显著降低(P < 0.05),而Cr(7.85 ±1.10)?NAA(6.91 ± 0.33)?GABA(2.44 ± 0.09)和myo-Ins(5.03 ± 0.32)的总浓度变化没有显著性(P > 0.05)?同时,免疫组织化学结果显示,实验组与对照组大鼠脑皮质内星形胶质细胞的标志物质GFAP着色光密度与细胞数量之间不存在显著的差异性?【结论】 高分辨的1H NMRS方法,结合相应的组织学和组织病理学方法和技术,适合于对一些诸如脑缺血再灌注损伤的中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病复杂的病理生理机制进行研究,有助于同时对该种类型的疾病的组织病理学和神经化学机制以及组织细胞能量代谢变化的研究。     

新生大鼠缺氧缺血时脑皮质Fas-L的变化

目的: 探讨缺氧缺血脑损伤时脑皮质Fas-L蛋白表达的变化.方法: 建立新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)动物模型并设假手术组作为对照,根据检测需要,在缺氧、缺血后24 h,3 d,7 d应用免疫组织化学SP法测定脑皮质Fas-L蛋白表达情况.结果: 左脑皮质Fas-L蛋白表达阳性率假手术组、实验组24 h依次为8.04±3.50,120.20±6.10 ; 3 d依次为8.20±3.10,87.6±5.90; 7 d依次为8.01±2.80,8.32±2.90.实验组与假手术组比较,在第7天时,差异无显著性(P＞0.05);24 h,3 d时明显增多,差异显著(P＜0.05).结论: 新生大鼠HIBD后24 h,3 d,7 d结扎侧脑皮质,Fas-L蛋白开始表达增高,后降低.     

电针对缺血缺氧新生大鼠脑内神经前体细胞增殖的影响

目的 :探讨电针刺激大椎、百会穴对缺血缺氧脑损伤 (HIBD)新生大鼠脑内神经前体细胞增殖的影响。方法 :7d龄Wistar大鼠 4 2只随机分为假手术对照组、HIBD组、HIBD后电针组 ,后 2组制备半球性HIBD模型。HIBD后电针组在缺血缺氧后第 2d给予电针刺激大椎、百会穴 15min ,1次 /d ,治疗 2个疗程 ,每个疗程 10d ,2个疗程间隔 2d。各组动物均于缺血缺氧后 2 2d处死 ,处死前经腹腔注射Brdu ,采用抗Brdu抗体进行免疫组化染色 ,镜下观察脑内Brdu阳性细胞的分布。结果 :各组Wistar幼鼠脑组织内侧脑室的室管膜下层、齿状回颗粒细胞层下层及胼胝体等有Brdu阳性细胞分布 ;HIBD组Brdu免疫阳性细胞数高于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ,低于HIBD后电针组(P <0 .0 5 )。结论 :缺血缺氧促进新生大鼠脑内神经前体细胞增殖 ;电针刺激大椎、百会穴可加强缺血缺氧后新生大鼠脑内神经前体细胞增殖     

神经干细胞移植对缺氧缺血新生大鼠感觉运动机能的影响

目的研究神经干细胞(NSCs)移植对改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后感觉运动障碍的作用。方法7d龄新生SD大鼠,随机分为假手术组,HIBD组和脑内移植组,后两组HIBD损伤后3d分别在左侧感觉运动皮质区植入BrdU标记的NSCs或培养基作为对照,观察植入4周后大鼠感觉运动功能的变化和移植细胞在脑内的存活和分化情况。结果与HIBD组比较,移植组在T迷宫和四项感觉运动功能测试中,表现出明显的改善。在T迷宫中,自发改变率[(69.23±13.34)%vs(45.00±27.27)%](P<0.05)上升;在握持牵引试验中,握持时间明显延长[(49.15±13.39)svs(27.20±15.18)s](P<0.05);在肢体放置和足错误试验中的不对称性消失,姿势反射也明显改善(P<0.05)。BrdU间接免疫荧光显示移植后4周,在脑内可见存活的NSCs分布于移植点附近;BrdU和NF-200免疫荧光双标显示移植后4周NSCs可部分分化为神经元表达NF-200。结论脑内移植NSCs对HIBD新生大鼠的感觉运动机能和行为的恢复有良好的促进作用。     

神经干细胞移植对缺氧缺血新生大鼠感觉运动机能的影响

目的研究神经干细胞(NSCs)移植对改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后感觉运动障碍的作用.方法 7 d龄新生SD大鼠,随机分为假手术组,HIBD组和脑内移植组,后两组HIBD损伤后3 d分别在左侧感觉运动皮质区植入BrdU标记的NSCs或培养基作为对照,观察植入4周后大鼠感觉运动功能的变化和移植细胞在脑内的存活和分化情况.结果与HIBD组比较,移植组在T迷宫和四项感觉运动功能测试中,表现出明显的改善.在T迷宫中,自发改变率[(69.23±13.34)% vs (45.00±27.27)%](P < 0.05)上升;在握持牵引试验中,握持时间明显延长[(49.15±13.39)s vs (27.20±15.18 )s] ( P <0.05);在肢体放置和足错误试验中的不对称性消失,姿势反射也明显改善 ( P <0.05 ).BrdU间接免疫荧光显示移植后4周,在脑内可见存活的NSCs分布于移植点附近;BrdU和NF-200免疫荧光双标显示移植后4周NSCs可部分分化为神经元表达NF-200. 结论脑内移植NSCs对HIBD新生大鼠的感觉运动机能和行为的恢复有良好的促进作用.     

脑源性神经营养因子对缺氧胚鼠脑皮质神经元的保护作用

目的：观察胚鼠皮质神经元遭受缺氧刺激时脑源性神经营养因子（BDNF）对其的保护作用，并探讨该过程中酪氨酸激酶B信使核糖核酸（TrkBmRNA)表达的变化。方法：对胚鼠皮质神经元进行体外培养，用流式细胞术检测不同抽氧时点实验组（加入BDNF）与对照组（不加入BDNF）的细胞活性差别；同时用原位杂交法检测BDNF受体TrkBmRNA表达的改变。结果：BDNF对缺氧神经元有确切保护作用，加入BDNF可引起TrkBmRNA表达的上调。结论：BDNF可减轻神经元所遭受的缺氧损害，而TrkBmRNA表达上调可能是BDNF发挥其对缺氧神经元保护作用的机理之一。     

脑源性神经营养因子对体外培养大鼠胚脑皮质神经元缺氧的保护作用

目的探讨脑源性神经营养因子（BDNF）对体外培养大鼠胚脑皮质神经元在低氧适应过程的保护作用。方法对胚鼠皮质神经元进行体外培养,观察透射电镜下缺氧诱导大鼠胚脑皮质神经元损伤的超微结构变化;采用MTT比色法检测正常对照组（A组）、不同缺氧时间点皮质神经元缺氧对照组（B组）及缺氧培养前24h和缺氧即刻加入不同剂量外源性BDNF实验组（C组）神经细胞存活率差别;4’、6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸染色法结合凋亡细胞的原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果遭受缺氧损伤的大鼠胚脑皮质神经元超微结构显示缺氧可以诱导神经细胞坏死、凋亡和混合型细胞死亡;以神经元缺氧最为敏感的0～10h为研究时间,C组在缺氧0～6h时细胞活性显著高于缺氧对照组B组（P〈0．05）。凋亡神经细胞百分率低于缺氧对照组B组（P〈0．05）。结论缺氧可诱导体外培养大鼠胚脑皮质神经元死亡,早期加入外源性BDNF可以使神经元对低氧的耐受性增强而发挥其对神经元的保护作用。     

脑源性神经营养因子对缺氧胚鼠脑皮质神经元的保护作用

目的　观察胚鼠皮质神经元遭受缺氧刺激时脑源性神经营养因子 (BDNF)对其的保护作用 ,并探讨该过程中酪氨酸激酶 B信使核糖核酸 (Trk Bm RNA)表达的变化。方法　对胚鼠皮质神经元进行体外培养 ,用流式细胞术检测不同缺氧时点实验组 (加入 BDNF)与对照组 (不加入 BDNF)的细胞活性差别 ;同时用原位杂交法检测 BDNF受体 Trk Bm RNA表达的改变。结果　 BDNF对缺氧神经元有确切保护作用 ,加入 BDNF可引起Trk Bm RNA表达的上调。结论　 BDNF可减轻神经元所遭受的缺氧损害 ,而 Trk Bm RNA表达上调可能是 BDNF发挥其对缺氧神经元保护作用的机理之一。     

人骨髓基质细胞脑移植改善大鼠缺氧缺血性脑损伤

目的观察人骨髓基质细胞(BMSCs)移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的保护作用,探讨BMSCs脑移植治疗HIBD的可行性。方法36只新生大鼠随机分为对照组、HIBD组和移植组(均n=12)。HIBD组和移植组大鼠7日龄时结扎左侧颈总动脉后吸入8%氧气2h制成HIBD模型。对照组仅分离左颈总动脉,不予结扎和缺氧。分离培养人BMSCs,损伤后3d将BMSCs立体定位脑移植到移植组大鼠左侧感觉运动皮层。3～4周龄时,观察大鼠行为学和组织学的改变,并用免疫荧光检测移植细胞的存活情况。结果缺氧缺血后3周,HIBD组海马DG区和皮层单位面积内神经元数目较正常组减少[海马DG区:(39.2±5.6)个vs(51.1±3.9)个,P<0.001;皮层:(12.3±3.0)个vs(17.8±3.0)个,P<0.001]。BMSCs移植后海马DG区和皮层单位面积内神经元数目[海马:(44.9±3.1)个,皮层:(17.5±3.1)个]较HIBD组增加(P<0.01)。与对照组比较,HIBD组在T迷宫、感觉运动功能测试中表现出明显的不足。BMSCs脑移植组各项行为学测试成绩较HIBD组均有明显改善。免疫荧光显示移植后3周,BMSCs在脑内存活。结论BMSCs脑移植可以改善新生鼠HIBD。     

早期干预对宫内缺氧缺血大鼠脑功能及神经生长相关蛋白表达的影响

目的 通过建立宫内缺氧缺血大鼠动物模型，研究早期干预能否促进脑组织内神经生长相关蛋白(GAP-43)表达以影响受损脑功能的修复。方法 依照“延迟剖宫”方法建立缺氧缺血脑损伤(HIBD)大鼠模型．另一侧未结扎血管的子宫内胎鼠作为对照组。根据随机分组原则，分为HIBD干预组、HIBD非干预组、正常干预组、正常非干预组，每组15只。干预组采用早期视触听觉刺激和丰富环境的早期干预方法，于术后24h开始至生后28d。非干预组常规饲养，不予以干预。而后采用跳台测试、脑电图检测大鼠脑功能；尼氏染色观察脑组织病理学变化；免疫组织化学方法测定脑组织GAP-43表达水平。统计学检验采用SPSS 11．0统计软件包进行处理。     

骨髓间充质干细胞神经分化及向缺氧缺血脑组织迁移的研究

目的：利用体外生物诱导方法研究骨髓间充质干细胞（BMSCs）的神经分化能力;利用体外迁移模型观察BM—SCs对缺氧缺血性脑组织的影响。方法：建立新生鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型,随机分成正常脑组织组、HIBD组,取造模后脑组织上清液与BMSCs共培养,细胞免疫荧光技术检测BMSCs的巢蛋白（Nestin）的表达。体外应用Transwell双室培养体系模型观察BMSCs对缺氧缺血性脑组织的趋向效应。结果：BMSCs经新生鼠缺氧缺血性脑组织匀浆上清液诱导24h后部分细胞分化,回缩成圆形或梭形,部分细胞可见两个或多个突起伸出,类似神经元。荧光免疫技术检测显示,HIBD组、正常脑组织组、未诱导组Nestin阳性率分别为（31．76＋3．56）％、（19．46＋2．61）％、（2．57~0．73）％,HIBD脑组织上清液诱导组细胞Nestin阳性率高于正常脑组织上清液诱导组（P〈0．01）。Transwell体外迁移实验中BMSCs对正常脑组织、HIBD脑组织上清液均有趋向性,迁移百分率分别为（20．18±4．86）％、（39．42±2．81）％,对HIBD脑组织上清液趋向性最大（P〈0．01）。结论：脑组织匀浆上清液可诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞分化,HIBD脑组织上清液可明显促进其分化。BMSCs具有向HIBD脑组织迁移能力。     

缺氧条件下新生大鼠皮质神经元凋亡的机制

目的探讨Bcl-2家族促凋亡成员和抗凋亡成员对CoCl2诱导的新生大鼠皮质神经元缺血缺氧模型中神经元存活的影响及其调节机制。方法体外培养原代皮质神经元并建立CoCl2诱导大鼠皮质神经元缺血缺氧模型,用聚合酶链反应和Western免疫印迹技术,检测皮质神经元凋亡时Bcl-2家族促凋亡成员和抗凋亡成员的表达变化。结果促凋亡蛋白Bax在CoCl2模拟缺血缺氧时蛋白上调;而抗凋亡蛋白Bcl-2下降,总体蛋白水平下调(P<0.05)。结论 Bcl-2家族促凋亡成员Bax和抗凋亡成员Bcl-2比例的上升是缺血缺氧过程中神经元凋亡的关键因素。     

缺血/缺氧预适应的神经保护作用研究进展

有氧代谢对脑组织至关重要,神经系统对缺血/缺氧的耐受性差。内源性因素如缺血性卒中、癌症及外源性因素如高原暴露、航空作业、潜水等均会导致机体或器官的缺血/缺氧,从而引起中枢神经系统的功能紊乱以及病理改变。寻找提高脑低氧耐受性的策略对于增强机体适应低氧环境的能力及防治缺血/缺氧性疾病具有重要意义。大量研究表明,预先给予机体一个短时间的较轻程度的缺血/缺氧刺激,能够显著提高机体对随后更严重缺氧的耐受能力,这种现象被称为缺血/缺氧预适应。近年来,缺血/缺氧预适应作为一种诱导神经内源性保护的策略,受到了广泛关注,成为当前生物医学领域中的研究前沿和热点之一。到目前为止,缺血/缺氧预适应已经在多种临床前模型中进行了研究,如缺血性卒中、神经退行性疾病等。缺血/缺氧预适应的保护机制复杂,涉及低氧信号通路激活、抗氧化应激、抗炎、抗凋亡等多种效应。本文就目前报道的缺血/缺氧预适应的主要机制、基础及临床研究进展进行综述,以阐明缺血/缺氧预适应的神经保护作用及应用潜力。     

缺血预处理对大鼠脑钙调神经磷酸酶活性的影响

【目的】观察脑缺血和缺血预处理对大鼠脑钙调神经磷酸酶（CaN）活性的影响,探讨CaN在脑缺血中的作用。【方法】制备大鼠大脑缺血及缺血预处理模型,分步离心提取蛋白,应用紫外分光光度法测定各组CaN在大鼠脑中的活性。【结果】缺血组CaN活性明显低于正常组（P〈0．05）,缺血预处理组CaN活性明显高于缺血组（P〈0．05）。【结论】实验结果表明缺血预处理可保护大鼠脑缺血时CaN的活性。     

3日龄大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织VEGF表达变化探讨

目的:探讨3日龄未成熟大鼠缺氧缺血性脑损伤后脑白质中VEGF的表达变化规律,研究VEGF在早产儿脑损伤发病机理中的作用,为干预治疗打下理论基础。方法:92只体重6.5～10.5g新生3日龄SD大鼠,随机分为实验组(缺氧缺血)50只和对照组(假手术)42只,实验组死亡10只,对照组死亡2只,故进入实验的两组均为40只。实验组大鼠右侧颈总动脉结扎,术后予以低氧(6%O2+94%N2)处理4h,以建立动物模型。对照组仅分离右侧颈总动脉,不予以结扎和缺氧处理。术后12、24、48、72h及7d处死8只大鼠,取脑组织,制备光镜石蜡标本。VEGF的表达采用免疫组化方法。采用全自动图像分析系统分析VEGF阳性单位表达的AU值。结果:对照组和实验组大鼠神经元、内皮细胞、软脑膜细胞、胶质细胞等均可见VEGF表达。表达变化以胼胝体和脑室周围白质部位明显。对照组VEGF的表达较弱,且随时间的增加,表达没有明显变化,组间比较差异无统计学意义(P0.05)。实验组于缺氧缺血12h表达开始增加,缺氧缺血24h表达达到高峰,7d时恢复至正常,组间各时间点比较差异均有统计学意义(P0.05)。实验组VEGF的表达在12、24、48、72h与对照组比较差异有统计学意义(P0.05),7d与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:未成熟大鼠缺氧缺血性脑损伤中,VEGF蛋白的表达于缺氧缺血12h开始增加,于24h达到高峰,7d降至正常,说明VEGF在其发病机制中有一定作用。     

脑溢安对新生大鼠海马神经干细胞缺氧损伤及p38MAPK活性的影响

目的探讨中药脑溢安颗粒(简称脑溢安)对神经干细胞缺氧损伤的影响及其保护作用机制.方法体外培养神经干细胞来自新生3～5 d SD大鼠海马组织,造缺氧损伤模型,用原位末端标记法(TUNEL)进行细胞凋亡检测,应用免疫共沉淀、激酶反应及Western blot技术研究脑溢安对缺氧损伤神经干细胞内p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)活性的影响.结果培养神经干细胞缺氧损伤后发生凋亡,脑溢安能促进缺氧损伤神经干细胞存活及减少神经干细胞凋亡;缺氧损伤后神经干细胞内p38MAPK活性增强,脑溢安血清组p38MAPK活性显著低于模型组和正常血清组(P＜0.01).结论脑溢安能保护缺氧损伤神经干细胞,抑制缺氧损伤激活的p38MAPK信号转导通路可能为其保护作用机制之一.     

人骨髓基质细胞脑移植改善大鼠缺氧缺血性脑损伤

目的观察人骨髓基质细胞(BMSCs)移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的保护作用,探讨BMSCs脑移植治疗HIBD的可行性.方法36只新生大鼠随机分为对照组、HIBD组和移植组(均n=12).HIBD组和移植组大鼠7日龄时结扎左侧颈总动脉后吸入8%氧气2h制成HIBD模型.对照组仅分离左颈总动脉,不予结扎和缺氧.分离培养人BMSCs,损伤后3 d将BMSCs立体定位脑移植到移植组大鼠左侧感觉运动皮层.3～4周龄时,观察大鼠行为学和组织学的改变,并用免疫荧光检测移植细胞的存活情况.结果缺氧缺血后3周,HIBD组海马DG区和皮层单位面积内神经元数目较正常组减少[海马DG区:(39.2±5.6)个vs(51.1±3.9)个,P＜0.001;皮层:(12.3±3.0)个vs(17.8±3.0)个,P＜0.001].BMSCs移植后海马DG区和皮层单位面积内神经元数目[海马:(44.9±3.1)个,皮层:(17.5±3.1)个]较HIBD组增加(P＜0.01).与对照组比较,HIBD组在T迷宫、感觉运动功能测试中表现出明显的不足.BMSCs脑移植组各项行为学测试成绩较HIBD组均有明显改善.免疫荧光显示移植后3周,BMSCs在脑内存活.结论BMSCs脑移植可以改善新生鼠HIBD.     

新生大鼠缺氧缺血后不同部位脑组织中Par-4基因的表达

目的：观察Par-4基因在新生大鼠脑缺氧缺血后，不同脑组织中的表达。方法：制备新生大鼠缺氧缺血性脑病的动物模型。利用RT-PCR检测脑缺氧缺血后不同时间点海马组织、大脑额叶皮质及小脑中Par-4的mRNA表达的改变，利用Western blot检测在缺氧缺血24h后，海马组织大脑额叶皮质和小脑中Pat-4蛋白表达量的改变。结果：①海马组织和大脑额叶皮质中的Pat4 mRNA在脑缺氧缺血后2h已明显升高，至6h已达高峰。而小脑未见表达；②在新生大鼠脑缺氧缺血24h后，海马组织及大脑额叶皮质中Pat-4蛋白表达量显著升高，并且海马组织中Par-4蛋白表达量高于大脑额叶皮质中Par-4蛋白表达量。而小脑未见其蛋白表达。结论：缺氧缺血对新生大鼠不同脑组织中Par-4基因表达影响不同，Pat-4可能参予了缺氧缺血对新生大鼠海马组织和大脑额叶皮质的致病过程。     

新生大鼠脑低氧缺血早期纹状体多巴胺含量的变化

采用新生大鼠脑低氧缺血及单纯缺氧模型,测定动物脑损伤早期纹状体多巴胺(DA)含量的变化.右颈总动脉结扎合并2h高温,低氧导致7日龄大鼠出现自发性向右旋转,左右侧纹状体DA含量失平衡,右侧低于左侧。单纯脑缺氧动物既无自发性旋转,又无DA含量失衡。提示脑缺氧缺血对纹状体DA末梢造成损伤。本文结合前文[1]工作结果,比较并讨论了发育中动物纹状体不同递质系统对脑缺氧缺血的敏感性。