人bFGF基因克隆表达及表达产物的纯化和生物学活性分析

目的：通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的表达,为ｂＦＧＦ进一步研究提供材料来源,方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术将ＰＣＲ产物克隆到ｐＧＥＭ－５Ｚ载体并测序,然后克隆到表达载体ｐＸＨ上。结果：转化重组质粒ｐＬＸ１的大肠杆菌经４２℃温控诱导４￣５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白的分子量约３５０００,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体     

人bFGF基因克隆表达及表达产物的纯化和生物学活性分析

目的：通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＤＨ５α中的表达,为ｂＦＧＦ进一步研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术将ＰＣＲ产物克隆到ｐＧＥＭ－５Ｚ载体并测序,然后克隆到表达载体ｐＸＨ上。结果：转化重组质粒ｐＬＸ１的大肠杆菌经４２℃温控诱导４５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白的分子量约３５０００,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的９９％。经ＦａｃｔｏｒＸａ酶切后得到分子量约为１７０００的ｂＦＧＦ,其生物学活性ＥＤ５０为２２９ｎｇ／ｍｌ。结论：经ＰＣＲ方法扩增的ｂＦＧＦ可在大肠杆菌中高效表达,为其进一步结构与功能研究打下基础     

锌对大鼠胸腺,脾脏淋巴细胞增殖功能影响的研究

从哺乳期开始建立大鼠缺锌（ＺＤ）和高锌（ＺＥ）模型，应用流式细胞术（ＦＡＣＳ）研究微量元素锌对胸腺、脾脏淋巴细胞增殖功能的影响。结果表明：（１）ＺＤ组和ＺＥ组胸腺、脾脏静止期（Ｇ０、Ｇ１期）细胞明显增高，而增殖期（Ｓ＋Ｇ２＋Ｍ期）细胞及增殖指数明显降低，与自由喂养组（ＡＬ）及配对组（ＰＦ）组比差别非常显著。（２）ＺＤ组及ＺＥ组胸腺、脾脏细胞内ＲＮＡ及蛋白质含量降低；细胞内ｃＡＭＰ含量及ｃＡＭＰ／ｃ     

Experimental Studyon Anti－tumor Effect of SplenocytesInduced by Anti－CD3McAb，PHA and IL－2

（沈张悦）（邵静芳）（王晓林）（朱慧芬）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙｏｎＡｎｔｉ－ｔｕｍｏｒＥｆｆｅｃｔｏｆＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓＩｎｄｕｃｅｄｂｙＡｎｔｉ－ＣＤ３ＭｃＡｂ，ＰＨＡａｎｄＩＬ－２￥ＳＨＥＮＧｕａｎ－ｘｉｎ，ＷＡＮＧＸｉａｏ－ｌｉ...     

单克隆抗体F（ab‘）2片段2种纯化方法的建立及比较

目的：建立纯化（ｍＡｂ）Ｆ（ａｂ‘）２片段的有效方法。方法：在ｐＨ５．５环境下，用ＤＴＴ激活木瓜酶，在没有ＤＴＴ存在下消化抗人肝癌ｍＡｂ ＨＡｂ１８ ＩｇＧ１，３７℃，反应８ｈ，然后分别用Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００（１ｃｍ×６５ｃｍ）凝胶过滤柱和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－ＦＦ（２ｃｍ×１８ｃｍ）阴离子交换柱纯化。结果：经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１００ｇ／Ｌ）电泳测定，２种方法纯化的Ｆ（ａｂ’）２     

抗HSV—1杂交瘤细胞系的建立及单抗特性研究

以ＨＳＶ－１为抗原，免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，取其脾细胞在ＰＧＥ介导下与ＳＰ２／０细胞常规融合，ＩＦＡ法筛选鉴定，反复克隆，共获得７株能稳定、持续分泌抗ＨＳＶ的ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系。核型分析染色体数为８７￣１０３条之间，Ｉｇ类型分别为ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３，腹水抗体效价在１０＾－５￣１０＾－７之间免疫沉淀。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，２株与１３２Ｋ多肽发生特异性反应，只具有ＨＳＶ－１型特异性，其余３     

分泌抗丙型肝炎病毒NS5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

目的建立能稳定分泌抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ５重组蛋白单克隆抗体（ＭｃＡｂ）,并对其生物学活性进行实验室鉴定。方法用重组ＨＣＶＮＳ５区蛋白为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞ＳＰ２／０进行融合,经有限稀释克隆３次后制备分泌ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株,并用酶免疫（ＥＩＡ）法对其分泌抗体进行初步鉴定。结果融合后的阳性克隆中筛选出６株能稳定分泌ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株,命名为２Ｃ８,２Ｄ２,１Ｄ６,２Ｇ２,１Ｆ５和１Ｆ１０。这６株ＭｃＡｂ与ＮＳ５重组抗原均有良好的反应性,杂交瘤培养上清的ＥＩＡ抗体滴度为１∶４００～１∶１６００,其中１株诱生的同系小鼠腹水滴度为１∶８００００。这６株ＭｃＡｂ均为ＩｇＧ１亚型。结论该ＭｃＡｂ的制备,可为ＨＣＶ感染者血清和肝组织中抗原检测方法的建立和生物工程药物的研制创造条件。     

抗人乳腺癌血清抗原单克隆抗体GB2的制备及鉴定

采用人乳腺癌血清抗原免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，经ＥＬＩＳＡ筛选，有限稀释及克隆后获得了一析玢泌特异抗体的杂交瘤细胞株，命名为单克隆抗体ＧＰ２（ＭｃＡｂＧＢ２）。ＭｃＡｂＧＢ２经硫酸铵及ＤＥＡＥ纤维素纯化后效价达１：２×１０＾６，经琼脂糖免疫双扩证明ＭｃＡｂＧＢ２属小鼠ＩｇＧ１亚类。免疫印迹结果表明ＭｃＡｂＧＢ２识别的抗原呈两条区带，分子量分别为１１６ｋｄ及４５ｋｄ     

抗HSV－1杂交瘤细胞系的建立及单抗特性研究

以ＨＳＶ－１为抗原，免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，取其脾细胞在ＰＧＥ介导下与ＳＰ２／０细胞常规融合，ＩＦＡ法筛选鉴定，反复克隆，共获得７株能稳定、持续分泌抗ＨＳＶ的ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系。核型分析染色体数为８７～１０３条之间，Ｉｇ类型分别为ＬｇＧ＿１、ＩｇＧ＿（２ｇ）、ＩｇＧ＿３，腹水抗体效价在１０￣（－５）～１０￣（－７）之间免疫沉淀。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析，２株与１３２Ｋ多肽发生特异性反应，只具有ＨＳＶ－１型特异性，其余３株与１２０～１２８Ｋ多肽，２株与６０Ｋ多肽发生特异性反应，具有ＨＳＶ型共同抗原特异性。７株ＭｃＡｂ与ＣＭＶ均不发生特异反应。这些杂交瘤细胞系的建立对于ＨＳＶ的临床早期、快速诊断有重要的应用价值。     

霍奇金病RS／H细胞bcl—2,fas和cyclin D1蛋白表达及其相关关系

该文利用免疫组化检测了４０例霍奇金病（ＨＤ）／Ｈ细胞ｂｃｌ－２,ｒａｓ、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１的表达,并对其相关关系进行了研究。结果显示：ｂｃｌ－２和ｆａｓ蛋白一信号在ＲＳ／Ｈ细胞中主要呈浆膜型。在ＨＤ上亚型ＬＰ,ＮＳ,ＭＣ和ＬＤ中ｂｃｌ－２阳性细胞密度逐渐增高（Ｐ〈０．０５）,而ｆａｓ阳性细胞密度依次降低（Ｐ〈０．０５）;并呈明显负相关（ｒ＝－０．５６９０）。在４０例ＨＤ中ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１阳性表达     

刺苋花粉特异性变应原成分的分析研究

目的：分析刺苋花粉的抗原成分以及刺苋花粉特异性变应原组分,为刺苋花粉变应原的纯化和标准化变应原疫苗的研制提供理论依据.方法：取刺苋花粉浸出液,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离,以16例刺苋花粉过敏的病人血清为探针,进行免疫印迹（Western blotting）,检测刺苋花粉浸出液的致敏组分.结果：SDS-PAGE显示可辨蛋白条带有11条,分子量在15～80 kD之间,其中主带有9条,分子量依次为18 kD、24 kD、29 kD、35 kD、39 kD、40 kD、42 kD、62 kD、78kD.Western blotting结果表明,16份刺苋花粉过敏患者的血清全部呈阳性反应,浸出液中共有4条致敏条带,其中主要致敏蛋白的分子量是78 kD和40 kD.结论：刺苋花粉78 kD和40 kD的变应原为主要特异性变应原.     

采用Western blotting的方法分析蚕蛹致敏原成份

目的应用Western blotting的方法检测蚕蛹(silkworm chrysalis)浸出液中致敏原的成份,为蚕蛹致敏原的研究和临床诊断提供依据.方法取蚕蛹浸出液,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离,再转印到PVDF膜上,封闭后将血清与膜条共同孵育,后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgE抗体反应,显色底物用对氨基联苯胺.结果SDS-PAGE显示蚕蛹可辨条带有12条,分子量在14～94 kD之间,其中主带有8条,分子量依次为80 kD、68 kD、62kD、50 kD、29 kD、28 kD、18 kD、16 kD.Western blotting结果表明,22例蚕蛹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有6条致敏条带,其中分子量68 kD和29 kD是主要致敏组份,阳性反应率均为100%.结论蚕蛹分子量68 kD和29 kD的组份为主要致敏组份,结果可为开发适合我国特色的蚕蛹变应原提供依据.     

格林巴利综合征患者脑脊液髓鞘碱性蛋白抗体测定及其抗原制备

目的探讨格林巴利综合征(GBS)是否存在中枢神经系统脱髓鞘现象.方法应用酸提法从胎儿大脑白质中提取髓磷脂碱性蛋白(MBP),经Sephdex-G150柱层析纯化和SDS-PAGE圆盘电泳分析,以纯化的MBP为抗原,用EUSA法测了44例GBS患者、38例其他神经疾病(OND)患者和33例正常人.结果经酸提后的碱蛋白,共有3个洗脱峰;SDS-PAGE证实第三峰中含1.7kD和2.1kD两条区带;GSF-MBP-EgG检测,GBS组阳性率为38.6%(17/44),OND组阳性率为34%(13/38),对照组阳性率为9%(3/33).结论MBP作为髓鞘的主要蛋白在GBS的自身免疫性脱髓鞘的过程中起重要作用.     

梭子蟹过敏原致敏组分的分析研究

目的应用免疫印迹(Western blotting)的方法分析梭子蟹[Portunus pelogicus(Linnaeus)]的致敏组分,为蟹过敏原的纯化和标准化变应原疫苗的研制提供理论依据。方法取常规方法制备的梭子蟹浸出液,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,用考马斯亮蓝染色分析其抗原蛋白的组分,同时用对蟹过敏的病人血清进行免疫印迹。结果SDS- PAGE显示梭子蟹可辨有19条蛋白带,分子量在13kD-90kD之间,其中主带有9条,分子量是20.9kD、24.2kD、27.1kD、29.2kD、33.7kD、38.9kD、48.7kD、74.7kD、89.1kD。Western blotting结果表明,16例蟹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有5条致敏条带,其中分子量在74.4kD、48.7kD的是主要致敏组分,阳性反应率均为100%。结论梭子蟹74.4kD和48.7kD组分为主要过敏原。     

Identification of the major allergen of Macrobrachium rosenbergii (giant freshwater prawn)

Objective

To characterize the major allergens of Macrobrachium rosenbergii (giant freshwater prawn).

Methods

Raw and cooked extracts of the giant freshwater prawn were prepared. The IgE reactivity pattern was identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting technique with the sera of 20 skin prick test (SPT) positive patients. The major allergen identified was then characterized using the proteomics approach involving a combination of two-dimensional (2-DE) electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics tools.

Results

SDS-PAGE of the raw extract showed 23 protein bands (15–250 kDa) but those ranging from 40 to 100 kDa were not found in the cooked extract. From immunoblotting experiments, raw and cooked extracts demonstrated 11 and 5 IgE-binding proteins, respectively, with a molecular mass ranging from 15 to 155 kDa. A heat-resistant 36 kDa protein was identified as the major allergen of both extracts. In addition, a 42 kDa heat-sensitive protein was shown to be a major allergen of the raw extract. The 2-DE gel fractionated the prawn proteins to more than 50 different protein spots. Of these, 10 spots showed specific IgE reactivity with patients'' sera. Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) analysis led to identification of 2 important allergens, tropomyosin and arginine kinase.

Conclusions

It can be concluded that the availability of such allergens would help in component-based diagnosis and therapy of prawn allergies.     

斯氏肺吸虫成虫10—30KD抗原蛋白的分离及在免疫诊断中的应用

在酶免疫转移印渍技术（EITB）分析斯氏肺吸虫虫体成份，显示10～30KD抗原蛋白（主带22、24和26KD）对该病具免疫诊断价值的基础上，将SDS－PAGE和电洗脱技术相结合，分离并纯化出斯氏肺吸虫成虫的10～30KD蛋白组份，采用Dot－ELISA方法免疫诊断肺吸虫。10～30kD的斯氏肺吸虫成虫抗原与斯氏、卫氏肺吸虫病人血清均呈阳性反应，与其它吸虫病和健康人血清末产生反应。该结果进一步表明10～30KD斯氏肺吸虫成虫抗原的Dot－ELISA为肺吸虫病高度特异、敏感的免疫诊断方法。并为两种肺吸虫的共同抗原，可用于免疫诊断斯氏、卫氏肺吸虫病。     

周围神经43kD蛋白单克隆抗体的制备

目的：制备周围神经43kD蛋白单克隆抗体。方法：通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶系统,从周围神经组织中分离回收43kD蛋白作为抗原,免疫BALB／C小鼠,通过杂交瘤技术,点膜印迹法检测,获得相应的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以Western blot方法检测抗体的特异性。结果：阳性克隆可持续稳定分泌抗43kD蛋白抗体,Western Blot显示在43kD处出现特异的阳性反应条带。结论：建立了分泌抗43kD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,获得了43kD蛋白单克隆抗体。     

乙肝基因疫苗系列质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的 构建一系列乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白的真核细胞表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法 采用常规PCR法扩增S、前S2－S、前S1－前S2－S片断,利用重叠PCR法扩增出前S1－S片断后,分别插入Rc/CMV及pSG5UTPL/Flag载体质粒中,并在其ATG起始密码前加入KOZAK序列后转染SP2／0细胞,Western-Blot杂交检测所表达蛋白,并用核酸自动分析仪分析所插入片断的核酸序列。结果 插入片断的核苷酸序列与相应的大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的编码基因一致,Western-Blot杂交检测出了相应的目的蛋白。结论 获得了8个能高效表达乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的真核细胞表达质粒。     

婴儿利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧基酶优势表位基因的分子克隆与表达

目的 基于前期分析并选取的婴儿利什曼原虫PEPCK的优势表位基因,构建相应重组原核表达载体以获得重组蛋白,构建相应重组真核表达载体并验证真核载体在NIH3T3细胞中的表达,为后续动物的免疫和感染实验备下基础。方法 根据PEPCK优势表位基因序列,经PCR反应及酶切连接构建重组原核与真核表达质粒pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK并分别转染至E. coli和NIH3T3细胞中进行表达。采用SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定原核重组质粒在大肠杆菌中的表达和原核表达蛋白被镍柱纯化后的情况,采用免疫荧光实验验证真核重组质粒在细胞中的表达。结果 重组原核与真核载体的正确测序结果表明重组载体构建成功。SDS-PAGE电泳和Western Blot的结果显示,大肠杆菌中表达的原核重组蛋白以及纯化后的蛋白在48.08 kD处存在条带,转染了真核重组载体的NIH3T3细胞的免疫荧光结果呈阳性。结论 成功构建了PEPCK优势表位基因的重组原核和真核表达载体:pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK,成功表达相应的重组蛋白并纯化并验证了pVAX1-EPEPCK在NIH3T3细胞中的表达,为后续DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强免疫的动物实验备下基础。     

胃癌组织核基质与p16基因上游序列的相关性研究

目的 :研究胃癌组织核基质蛋白与 p16基因上游序列的相关性。 方法 :应用SDS PAGE技术和Southwestern印迹技术 ,对 2 2例胃癌组织、癌旁组织及正常组织的核基质蛋白进行研究。结果 :与正常组织比较 ,胃癌组织 3 0kD、2 8kD的核基质蛋白表达量明显减少 (P <0 .0 5 ) ;不同分化类型及不同临床分期胃癌组织间比较 ,3 0kD、2 8kD核基质蛋白表达量无明显差异 (P >0 .0 5 )。正常组织核基质蛋白与p16基因上游序列的结合主带为 2 8kD、3 0kD、40kD、43kD、5 0kD ,胃癌组织中为 40kD、66kD。胃癌组织与正常组织比较 ,66kD结合阳性信号明显增强 (P <0 .0 5 ) ;而不同分化类型及不同临床分期胃癌组织间 ,66kD结合阳性信号无显著性差异。结论 :胃癌组织中核基质蛋白的改变及 66kD蛋白与p16基因上游区结合量的异常可能是胃癌发生的早期分子事件。