食蟹猴骨髓基质干细胞体外诱导分化的实验研究

为观察食蟹猴骨髓基质干细胞（BMSC）体外培养及诱导分化情况，分离食蟹猴的BMSC，以神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果发现，分离得到的食蟹猴BMSC能在体外培养中增殖，分化，这些具有克隆能力的BMSC能表达神经干细胞特异性抗原Nestin，并能进一步诱导分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有GFAP和NSE抗原表达。提示灵长类BMSC是多分化潜能细胞，具有较强的自我更新和多分化能力，在适当的诱导分化条件下可形成具有神经系细胞（神经元和神经胶质细胞）特征的细胞；BMSC可作为神经干细胞的种子细胞。     

体外诱导骨髓基质细胞向神经干细胞和成熟神经细胞分化的实验研究

探索骨髓基质细胞（BMSCs）分化为神经干细胞和成熟神经细胞的可行性，为BMSCs在神经科学领域的应用提供依据。以犬的BMSCs为实验对象，利用bFGF、RA、GDNF等作为增殖或分化诱导因子，对各阶段细胞进行免疫细胞化学鉴定。结果发现，增殖培养24－72h见细胞分裂像和克隆单位；诱导培养3天，部分细胞开始表达NSE或GFAP，继续增殖培养仍可见细胞克隆（干细胞特性）；诱导培养第10天有成熟神经细胞形成（成分鉴定证实）。说明BMSCs在体外培养条件下，经过多种因子的“程序性”作用，可以向神经干细胞、成熟神经元及胶质细胞方向分化。提示BMSCs可作为“种子细胞”在神经科学领域加以利用。     

重组腺病毒介导noggin诱导骨髓问充质干细胞向神经细胞分化

目的 探讨体外分离、培养大鼠间充质干细胞(MSCs)的方法 ,采用重组腺病毒介导的noggin基因体外诱导方法 ,观察MSCs向神经细胞的定向分化效应.方法 原代培养MSCs 24h开始贴壁,呈梭形,集落样生长,纯化后,采用含noggin基因的重组腺病毒(pAdEasy-1-noggin)感染原代培养的MSCs,诱导骨髓MSCs分化为神经细胞.用鉴定神经特异性烯醇化酶(NSE)、神经元核抗原(NeuN)、神经丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫细胞化学方法 对诱导后的细胞进行鉴定.结果 倒置显微镜下观察可见,MSCs经重组腺病毒感染后48h,细胞向神经细胞分化,胞体呈锥形、多角形,由胞体伸出较长的轴突样和树突样突起,且有分支.免疫组织化学鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达NSE、NeuN和NF-200,而GFAP表达阴性.结论 利用密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;noggin基因重组腺病毒载体可成功诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.     

全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离方法,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法。方法取大鼠骨髓,全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增。倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞。用MTT法间接测定不同代数细胞活力。诱导分化,先用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导（BHA）和二甲基亚砜（DMSO）诱导。观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞。结果全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性,CD45阴性。MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞。细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白（β-Ⅲ-Tubulin）、巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）表达阳性。结论采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞。     

成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

为探讨成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性 ,无菌条件下行骨穿 ,梯度密度离心分离获取成人骨髓源细胞 ,以“CYTOKINE·神经干细胞培养液”培养 ,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖情况 ;以NESTIN、NSE及GFAP免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。细胞培养所涉及的细胞因子主要有GDNF(2 0ng/ml)、LIF(10ng/ml)和RA(0 5 μg/ml)等。结果发现 ,成人骨髓源细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的神经干细胞 ,后者形成细胞球 (或称“神经球”) ,该细胞球表达特殊的神经干细胞NESTIN抗原 ;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养 ,单个的细胞又很快形成新的神经球。神经干细胞球进一步分化 ,可见到有的细胞胞体增大并出芽 ,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系 ,表达NSE或GFAP抗原。说明成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞 ;用人骨髓组织诱导神经干细胞作为种子细胞具有可行性和有效性     

真皮来源间充质干细胞的分离培养及成神经分化的研究

目的：研究真皮来源间充质干细胞的分离培养方法及其向神经细胞分化的条件及可行性。方法：取大鼠真皮组织，采用贴壁传代培养筛选法，分离培养真皮间充质干细胞，流式细胞术检测细胞周期，经β-巯基乙醇诱导，倒置显微镜下观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果：分离的早期贴壁的真皮来源间充质干细胞经过连续传代培养至第4代，细胞形态较为均一，86％的细胞处于G0／G1期，细胞表面波形蛋白表达阳性，但因子Ⅷ和角蛋白表达阴性。经β-巯基乙醇诱导，真皮间充质干细胞可向神经细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征，分化后的细胞表达神经元标志物——神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经微丝（NF-200）。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，一定条件下可分化为神经元。提示真皮可能是成体多能干细胞的又—来源，有望在神经组织修复和再生中发挥作用。     

高压氧干预对绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞培养及增殖分化的影响CSCD

目的 探讨骨髓间充质干细胞培养及高压氧对其增殖分化的影响.方法 采用全骨髓细胞贴壁培养法提取绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞进行培养,取P3代骨髓间充质干细胞,用神经节苷脂和胶质细胞源性神经生长因子诱导液进行成神经元样细胞诱导,并在培养及诱导时进行高压氧干预,1次/d,为高压氧干预组（高压氧组）.采用免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）表达,绘制细胞生长曲线.未进行高压氧干预的为对照组.结果 贴壁培养法分离培养骨髓间充质干细胞,经多次换液后可纯化细胞.高压氧组间充质干细胞对数生长期提前,进入平台期后细胞数量多于对照组,高压氧干预后细胞于24 h内出现轴突、树突,48 h后2组对比,高压氧组80％以上细胞出现突起,且细胞突起较长、较粗.对照组突起的细胞比例不足80％,细胞分散,突起短,未连成网状.结论 骨髓间充质干细胞全骨髓贴壁培养法操作简单,细胞繁殖能力强,经高压氧干预后骨髓间充质干细胞生长加快.在细胞诱导时联合高压氧干预,细胞分化数量多,突起长.提示高压氧能促进体外骨髓间充质干细胞向神经元样细胞增殖和分化.     

成体小鼠脊髓实质神经干细胞的分离培养及其多能性的鉴定

目的从成年小鼠脊髓实质中分离培养并鉴定成体神经干细胞。方法采用无血清培养基及单细胞克隆技术，从成年小鼠脊髓实质中分离培养获得大量具备单细胞克隆能力的细胞，经免疫荧光染色证实单克隆细胞表达Nestin抗原并在分化后表达各种特异性的神经细胞抗原。结果从成年小鼠脊髓实质中分离培养获得的具备连续克隆能力的细胞可表达神经干细胞的Nestin抗原，并且分化后表达神经元及胶质细胞的特异性抗原。结论成功地从成年小鼠的脊髓实质中分离出具备增殖分化能力的成体神经干细胞，为进一步利用其进行脊髓损伤治疗的研究提供了实验基础。     

胚胎脊髓提取液对神经干细胞分化发育的影响

目的 观察胚胎脊髓提取液(fetal spinal cord extracts,FE)对神经干细胞(neural stem cells,NSC)分化的影响并探讨其机制.方法 制备FE加入NSC培养体系中诱导分化,分别于分化后第3、7天进行免疫荧光细胞化学鉴定,观察分化细胞表型并计算神经元样细胞所占的比例.结果 两组均可观察到神经元,实验组所占比例较高,可达23.39%,明显多于对照组(P＜0.01).两组GFAP阳性星形胶质细胞分化已经比较成熟,也可检测出MBP阳性少突胶质细胞.结论 FE通过提供胚胎脊髓源性神经营养因子、各种细胞因子和细胞外基质,支持NSC成活并诱导其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,且神经元的分化比例达到23.39%.     

去舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

目的 探讨HA-1077（fasuclil，法舒地尔）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞的影响。方法 采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测。设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2，采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测，观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响。结果 采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs，分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞，随着时间延长，阳性率逐渐提高。7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5／8、CKl0／13、CK19阳性率均远高于诱导组（P〈0．01）。结论 HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升，Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用。     

VEGF、bFGF联合应用对胎鼠大脑皮质神经干细胞分化的影响

目的观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合应用对胎鼠大脑皮质神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法取孕14dSD大鼠,收集胎鼠大脑皮质NSCs,采用无血清培养基传代培养,取P3代细胞,分别加入200μg/LVEGF和(或)20μg/LbFGF进行诱导分化,并设对照组(不加VEGF和bFGF),7d后采用免疫细胞化学方法检测巢蛋白(Nestin)、β微管蛋白-Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果从胎鼠大脑皮质中分离的细胞在体外悬浮生长,形成致密的球形细胞团,传代后能形成新的细胞球,免疫细胞化学染色显示细胞球nestin表达阳性。诱导分化后的细胞部分表达β-tubulin-Ⅲ,部分表达GFAP。与对照组比较,VEGF和(或)bFGF均可使NSCs向神经元方向分化的比例增加,其中VEGF+bFGF联合作用后NSCs的β-tubulin-Ⅲ阳性率(80.3%)最高,GFAP阳性率(18.6%)最低。bFGF作用后NSCs的β-tubulin-Ⅲ阳性率(60.4%)和GFAP阳性率(38.5%)与VEGF作用后(分别为60.3%、38.7%)比...     

SD大鼠神经干细胞培养鉴定实验研究

为探讨从SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质分离并鉴定神经干细胞的可行性 ,以从上述部位分离的细胞作为种子细胞来源 ,在本实验室特制“CYTOKINE·神经干细胞培养基”中进行了神经干细胞培养诱导 ,单细胞连续传代培养 ,并分别以Nestin、NSE及GFAP免疫抗体鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。结果发现 ,4种来源的组织细胞在相应培养条件下均有神经干细胞快速增殖 ,并有由多细胞组成的神经球形成 ,经鉴定 ,该细胞球表达特殊的胚胎神经干细胞Nestin抗原 ;进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度进行培养 ,单个的细胞又很快形成神经球。对神经干细胞进行连续培养或加血清传代培养可使其进一步分裂增殖 ,有小芽形成并发育成突起、建立神经纤维联系 ,其中有的胞体增大 ,逐渐发育为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接 ,交织成网 ,经鉴定为神经元及神经胶质细胞。 4种组织来源的细胞中所含有的干细胞数量不同 ,胎鼠较成年鼠更富含神经干细胞 ,室管膜或脑室下区所含神经干细胞较皮质更丰富 ,皮质来源的神经干细胞和室管膜来源的神经干细胞在形态学和分化程度上无特殊区别。该结果提示 ,SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质 4种组织来源的细胞均含有神经干细胞 ;神经干     

脑源性神经营养因子对亚低温处理后移植干细胞的存活及分化的影响

目的 研究脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)对亚低温处理后移植干细胞的存活及分化的影响.方法 脂质体介导BDNF表达质粒转染293T细胞,ELISA法确定BDNF高峰表达时相,收集高表达时相阶段细胞上清液.建立SD大鼠液压脑创伤模型,分为A组(干细胞移植组)和B组(干细胞移植+BDNF组),两组同时给予亚低温治疗(33℃)5 d.对第4天和第8大(复温后第3天)脑组织标本行增殖细胞核抗原(PCNA)、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学及原位细胞凋亡检测,实验动物予以神经功能缺陷评分.结果 ELISA结果显示细胞转染48～60 h后BDNF持续高表达.亚低温处理第4天两组PCNA、巢蛋白均高表达,NSE及GFAP无或极低表达,细胞凋亡少见,但B组较A组更少(P＜0.05).复温后第3天两组PCNA、巢蛋白均表达下降,NSE及GFAP表达升高,但B组较A组NSE阳性率更高,细胞凋亡更少(P＜0.05).B组获得最佳动物神经功能评分.结论 BDNF可增加低温环境下的干细胞存活率,并诱导干细胞向神经元分化.

Abstract：

Objective To study the effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) on the environmental nutrition and neural differentiation of the transplanted stem cells under hypothermia.Methods The BDNF gene mediated by liposome was transfected into 293T cell line, and ELISA assay was applied to find the peak time of BDNF expression. When BDNF was highly expressed, the supernatant was collected for establishment of SD rat models of brain injury. The rats were divided into Group A (stem cell transplantation group) and Group B (stem cell transplantation and BDNF group). Rats in both groups were under hypothermia treatment for five days. Four and eight days later ( three days from rewarming), rat brain tissues were obtained to detect the expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), nestin, neuron-specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) by immunohistochemical method and to detect the apoptosis by in situ hybridization. Finally, the nerve function scores were obtained for evaluation of the nerve function. Results The ELISA showed that the high level of BDNF expression was at 48 to 60 hours after gene transfection. PCNA and nestin were highly expressed, while NES and GFAP showed nil or low level of expression in both groups at the fourth day after hypothermia, with little apoptotic cells especially in the Group B (P ＜0.05). The expressions of PCNA and nestin were decreased, but the expressions of NSE and GFAP were increased at the third day after rewarming. The positive rate of NSE expression in the Group B was much higher and the apoptotic cells were much less compared with the Group A ( P ＜ 0. 05 ). A better nerve score was obtained in the Group B. Conclusion BDNF can enhance the survival rate of the transplanted stem cells and induce their differentiation into neurons under hypothermia.     

原浆型和纤维型星形胶质细胞调控神经干细胞定向分化的比较研究

目的探讨原浆型星形胶质细胞（protoplasmic astrocyte,PAS）和纤维型星形胶质细胞（fibrous astrocyte,FAS）对神经干细胞（neural stem cell,NSC）定向分化的调控作用。方法将4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-Diamidino-2-phenyindole,dilactate,DAPI）标记的NSC分别与PAS、FAS共培养,10天后免疫组化法对分化神经元进行鉴定,显微镜下随机选取20个视野,每次计数100个细胞,计算NSC分化为神经元的比例。结果NSC与PAS共培养后分化成的神经元比例较高,与胶质细胞的比例约为61％：39％;FAS与NSC共培养后分化神经元数量相对较少,以胶质细胞居多,其比例约为41％：59％。结论PAS与FAS相比更能促进NSC向神经元分化。     

血管内皮祖细胞对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞脂肪化的影响

 目的 探讨血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)对骨质疏松(OP)大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)自主脂肪化的影响。方法 选6周龄雌性 SD 大鼠,建立OP模型。体外分离、培养大鼠EPC、BMSC。分别取第3、6代BMSC及原代EPC,建立EPC/BMSC 间接共培养体系。实验分组:假手术组BMSC(BMSC sham)、OP组BMSC(BMSC ovx)、OP BMSC /EPC共培养组(BMSC ovx/EPC);MTT法检测细胞增殖情况;油红 O染色检测成脂分化情况,real- time PCR检测成脂分化标志物PPARγ2的mRNA表达水平。结果 BMSC ovx/EPC 组BMSC的增殖能力显著高于BMSC ovx组;BMSC ovx/EPC组自主脂肪细胞分化水平明显低于BMSC ovx组。结论 EPC可通过间接接触提高骨质疏松大鼠BMSC的增殖能力,并能有效抑制OP大鼠BMSC的自主脂肪化。     

红细胞生成素(EPO)对脑源性神经干细胞增殖与分化的调控作用

目的探讨红细胞生成素(EPO)对大鼠海马神经干细胞(NSCs)体外增殖和分化的影响。方法利用无血清培养、单细胞克隆技术,体外培养SD大鼠海马组织源NSCs,在NSCs增殖和分化过程中添加不同剂量EPO,以免疫细胞化学方法对NSCs及其分化后的细胞进行鉴定。结果与对照组相比,不同接种密度条件下的NSCs加入EPO后,增殖期表达Nestin的细胞增加2～4倍,分化期表达Nestin的细胞数明显减少;表达Tuj1和GFAP的细胞出现早,且Tuj1阳性细胞较对照组明显增加(P<0.05),加入antiEPO后Tuj1阳性细胞较对照组明显减少(P<0.01);相同细胞接种密度下,添加不同剂量EPO后Tuj1阳性细胞数呈剂量依赖性增加。结论EPO可促进大鼠海马源NSCs的增殖,并使其呈剂量依赖性的向神经元分化。     

人脐血间充质干细胞移植促进大鼠颅脑创伤后神经功能的恢复

目的 将人脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)注射到创伤性脑损伤(TBI)大鼠顶叶皮层及海马区,观察神经细胞标志物的表达和促进神经功能的恢复.方法 HUCB-MSCs用双苯酰亚胺(bis-benzimide)标记24 h,通过立体定向将细胞注射到损伤脑组织内.全部大鼠分为假损伤组、损伤组(TBI)、对照组(TBI+PBS)和治疗组(TBI+MSCs).用免疫组化和免疫荧光标记的方法检测移植细胞的存活、迁移和分化情况,用神经损伤严重程度评分(NSS)对神经功能恢复结果进行评价.结果 在接受移植的脑创伤大鼠局部有大量的MSCs存活,一些细胞分化为神经元或神经胶质细胞,并表达NSE和GFAP等神经细胞的标志物,治疗组的神经功能评分较其他组有明显的改善.结论 HUCB-MSCs可明显改善脑创伤后神经功能的恢复,并能很好替代骨髓MSCs而用于干细胞移植.     

人脐血间充质干细胞移植促进大鼠颅脑创伤后神经功能的恢复

目的 将人脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)注射到创伤性脑损伤(TBI)大鼠顶叶皮层及海马区,观察神经细胞标志物的表达和促进神经功能的恢复.方法 HUCB-MSCs用双苯酰亚胺(bis-benzimide)标记24 h,通过立体定向将细胞注射到损伤脑组织内.全部大鼠分为假损伤组、损伤组(TBI)、对照组(TBI+PBS)和治疗组(TBI+MSCs).用免疫组化和免疫荧光标记的方法检测移植细胞的存活、迁移和分化情况,用神经损伤严重程度评分(NSS)对神经功能恢复结果进行评价.结果 在接受移植的脑创伤大鼠局部有大量的MSCs存活,一些细胞分化为神经元或神经胶质细胞,并表达NSE和GFAP等神经细胞的标志物,治疗组的神经功能评分较其他组有明显的改善.结论 HUCB-MSCs可明显改善脑创伤后神经功能的恢复,并能很好替代骨髓MSCs而用于干细胞移植.     

人脐血间充质干细胞移植促进大鼠颅脑创伤后神经功能的恢复

目的 将人脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)注射到创伤性脑损伤(TBI)大鼠顶叶皮层及海马区,观察神经细胞标志物的表达和促进神经功能的恢复.方法 HUCB-MSCs用双苯酰亚胺(bis-benzimide)标记24 h,通过立体定向将细胞注射到损伤脑组织内.全部大鼠分为假损伤组、损伤组(TBI)、对照组(TBI+PBS)和治疗组(TBI+MSCs).用免疫组化和免疫荧光标记的方法检测移植细胞的存活、迁移和分化情况,用神经损伤严重程度评分(NSS)对神经功能恢复结果进行评价.结果 在接受移植的脑创伤大鼠局部有大量的MSCs存活,一些细胞分化为神经元或神经胶质细胞,并表达NSE和GFAP等神经细胞的标志物,治疗组的神经功能评分较其他组有明显的改善.结论 HUCB-MSCs可明显改善脑创伤后神经功能的恢复,并能很好替代骨髓MSCs而用于干细胞移植.