转FL基因基质细胞对脐血造血干细胞的作用

造血干细胞不足，限制了造血干细胞移植在临床的应用。我们曾探讨了持续稳定表达人FL(FLT3配体)和GMCSF(粒-巨噬细胞集落刺激因子)的转基因基质细胞系对CD34^ 细胞具有扩增作用，而在CD34^ 细胞中只有CD34^ 、CD38^-细胞才可使造血功能重建。本实验拟通过已建立的持续稳定表达人FL转基因基质细胞系，进一步探讨FL基因修饰的骨髓基质细胞对人脐血造血干细胞的体外扩增作用。     

人源化SCID小鼠模型的建立及其鉴定

目的：探讨在SCID小鼠体内移植人免疫细胞，建立人源化SCID小鼠模型及其特性鉴定。方法：SCID小鼠腹腔注射环磷酰胺（CTX）抑制骨髓造血，连续4天后，通过腹腔注射移植人外周血单个核细胞（PBMC）。4、8和12周后分别取小鼠外周血、脾脏、肝脏。荧光显微镜下观察SCID小鼠外周血中人CD3^＋、CD19^＋细胞；流式细胞仪测定全血中人CD3^＋、CD19^＋细胞百分率；免疫组织化学分析SCID小鼠肝脏和脾脏中人CD3^＋、CD19^＋细胞；ELISA检测SCID小鼠血清中人免疫球蛋白含量。结果：（I）SCID小鼠移植人外周血单个核细胞4、8和12周后在小鼠外周血中通过荧光显微镜下可观察到人CD3^＋、CD19^＋细胞，4周后流式细胞仪测得小鼠外周血单个核细胞中人CD19^＋、CD3^＋细胞百分率分别为10．6％、31．7％；（2）免疫组织化学结果显示在小鼠脾脏中存在人CD3^＋、CD19^＋细胞；（3）移植人外周血单个核细胞4、8和12周后ELISA测得小鼠血清中人免疫球蛋白的含量分别为390、1100和1040μg／ml。结论：成功地在SCID小鼠体内建立了人免疫系统。     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景:细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题。目的:实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响。方法:将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠。在扩增培养0,7d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞。结果与结论:移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组(P0.05)。扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达。结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能。     

培养前后脐血CD34~＋细胞在NOD/SCID鼠体内造血重建功能的比较

目的:以NOD/SCID小鼠为模型, 经半致死剂量照射后输注新鲜或培养后的造血细胞, 以比较培养前后脐血CD34 细胞的造血重建功能.方法:从新鲜脐血中分离单个核细胞(MNC), 采用干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、Flt3配体(FL)、白细胞介素3(IL-3)和白细胞介素6(IL-6)细胞因子组合体外培养14 d.通过MiniMACS免疫磁性吸附柱从新鲜或培养后的MNC中分离CD34 细胞, 4×105个CD34 细胞和5×106CD34-细胞混合后通过尾静脉输注入NOD/SCID小鼠中.饲养过程中动态观察外周血象恢复情况, 6周后检测小鼠骨髓和脾脏细胞中人源细胞及各系造血细胞的含量.结果:体外培养MNC 14 d后, 总细胞扩增了1.78倍;细胞移植6周后, 输注新鲜和培养后造血细胞的小鼠均存活, 在小鼠骨髓和脾脏中均可检测到人源细胞及各系人源血细胞和人特异ALU基因序列, 小鼠外周血象恢复到辐照前水平.培养后CD34 细胞在小鼠体内的植入水平与新鲜CD34 细胞的相近, 而其各系人源血细胞的含量高于新鲜CD34 细胞. 结论:体外培养14 d后的CD34 细胞仍保持了体内植入和重建造血的能力, 且其多系造血重建能力优于新鲜CD34 细胞.     

成人骨髓间充质干细胞对造血干细胞体外增殖的影响

目的研究骨髓间充质干细胞（MSC）对脐带血（CB）CD34^＋细胞体外增殖和造血重建能力的影响。方法取人骨髓单个核细胞贴壁培养．梭形细胞完全融合后传代，用流式细胞仪检测免疫表型；将CBCD34^＋细胞接种到MSC或其他培养液中．比较不同培养条件对造血干细胞扩增能力、集落形成能力及黏附分子表达的影响。结果在加入IL-3的培养体系中．在MSC和细胞因子作用下，CD34^＋细胞扩增7d和14d后，有核细胞（NC）、CD34^＋细胞和CDl33^＋细胞数，实验组均显著多于对照组。CD34＋细胞在未加入IL-3的培养体系中培养8d后，实验组NC、CD34^＋细胞、CD34^＋CD38-细胞和造血祖细胞集落扩增倍数均显著高于对照组。扩增后CD34^＋细胞的ALCAM、VLA-α4、VLA-α5、VLA-β1、HCAM、PECAM和LFA-1表达较扩增前无显著变化。结论MSC可为造血干细胞（HSC）体外扩增提供适宜的微环境，有助于CD34^＋细胞体外增殖并抑制HSC分化，保持其造血重建潜能和归巢能力。     

脐血CD34+造血干/祖细胞基因表达图谱的研究

目的：通过脐血CD34^＋造血干／祖细胞的基因表达分析，理解造血干／祖细胞生物学特性。方法：利用MiniMACS免疫磁珠法从脐血细胞中分离CD34^＋造血干／祖细胞，提取总RNA，用SMART-PCR技术从微量RNA中扩增产生足够量的cDNA用于高密度点阵膜分析检测CD34^＋造血干／祖细胞表达的基因。结果：在所检测的588个基因中，发现63个基因具有显著的表达水平，其中18个基因强表达。这些基因主要涉及造血干细胞增殖、分化、应激响应、凋亡、转录调节以及细胞周期等。结论：对理解脐血干／祖细胞生物学性质以及指导造血干细胞体外培养提供了分子生物学基础。     

脐血体外同时扩增造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞

目的：探索体外同时扩增脐血中造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞的可能性和最佳细胞因子组合方案。方法：采集健康正常足月产新生儿脐血，分离出单个核细胞，在不同的细胞因子组合作用下培养14天。培养于0、3、7和14天时收集细胞，用FCM分析扩增前后脐血CD34^＋、CD3^＋T及DCs细胞含量。结果：3组不同细胞因子组合实验组A：SCF＋IL-3，6；B：SCF＋IL-3，6，4；c：SCF＋IL-3，6，4（5X）均能显著扩增脐血中的单个核细胞和CD34’细胞，各组的CD34^＋细胞最高值出现在第7天，CD34^＋细胞平均增加倍数10—20倍不等。在扩增初期，各组CD3^＋T有所下降，7天时CD3^＋T细胞有不同程度的增加，14天时扩增最高的组别中CD3^＋T细胞是新鲜脐血的2倍。DCs标志CD1a、CDS0、CD83和CD86。在所有组别中培养3天时有所下降，第7天时在含IL4的组别中有显著上升，且CD1a和CD80表达高于CD83和CD86；14天时则有所回落。IL4对CD34^＋和CD3^＋T细胞扩增有一定促进作用。结论：脐血中T细胞、DC细胞在一定细胞因子组合下。可与CD34^＋细胞同时在体外被扩增和诱导分化。     

表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞联合脐血CD34~+干细胞共移植对辐射损伤小鼠的影响

目的观察表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)联合脐血CD34+造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)共移植对辐射损伤小鼠的影响。方法表达SDF-1、HOXB4和SDF-1/HOXB4基因的3个腺病毒载体分别转染正常人骨髓MSCs,将其联合脐血CD34+细胞经尾静脉移植到辐射损伤的NOD/SCID小鼠体内(MSCs 8×105细胞/只,CD34+1×105细胞/只),分别为SDF-1/MSCs+CD34+组(SDF-1组)、HOXB4/MSCs+CD34+组(HOXB4组)、SDF1-HOXB4/MSCs+CD34+组(S-H组),另外3组为未转染MSCs+CD34+组(MSC-HSC组)、单纯CD34+组(HSC组)、单纯辐照组(IR组)。检测移植后各组小鼠存活率、外周血象恢复、骨髓病理变化及人源CD45+细胞植入率。结果 S-H组小鼠存活率高,且外周血WBC、HGB、PLT和骨髓造血功能恢复快。在移植后6周骨髓CD45+细胞植入率(47.43%±8.89%)较其余各组高。结论表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞(MSCs)联合脐血CD34+造血干细胞(HSCs)共移植能促进造血重建及植入,提高移植成功率。     

VCAM-1修饰人脐血基质细胞对造血干/祖细胞扩增作用的实验研究

目的： 初步研究VCAM-1修饰的hUCBSCs促进造血干/祖细胞体外扩增的作用。方法： 在成功构建VCAM-1－pcDNA3.1(+)真核表达载体的基础上，转染原代培养的人脐血基质细胞，采用半定量RT-PCR法和免疫细胞化学技术检测转染前后hUCBSCs VCAM-1的表达情况；以VCAM-1修饰的人脐血基质细胞为滋养层，体外扩增脐血CD34+细胞，并对扩增后的脐血CD34+细胞进行CFU-GM、CFU-E、CFU-Mg半固体培养。结果： 脂质体介导VCAM-1－pcDNA3.1(+)真核表达载体成功转染人脐血基质细胞；RT-PCR和免疫细胞化学从mRNA水平和蛋白质水平均证明转染后VCAM-1表达明显高于转染前（P<0.05）；VCAM-1修饰的人脐血基质细胞能够有效支持脐血CD34+细胞的体外扩增(P<0.01)，其中对CFU-Mg的扩增作用强于未转染组(S组，P<0.05)。结论： VCAM-1修饰的人脐血基质细胞能够有效地支持造血干/祖细胞的体外扩增，显示其在造血重建方面潜在的应用价值。     

脐血体外同时扩增T、NK及干祖细胞移植治疗BALB/c小鼠白血病

目的观察体外同时扩增T、NK及干祖细胞脐血用于移植治疗BALB/c小鼠白血病效果.方法在不同的细胞因子组合作用下定向扩增脐血干祖细胞及T、NK免疫细胞.扩增7天后,5 × 106个/只脐血细胞经尾静脉接种X射线照射的白血病小鼠,观察各组小鼠存活时间及检查存活证据及微小残留白血病细胞.结果1.细胞因子SCF,IL-3,IL-6,IL-7,IL-2组合能显著扩增脐血中的CD34 、CD3 T、NK细胞.2.尾静脉接种2×106个/只K562产生可移植性白血病BALB/c裸鼠.3.BALB/c白血病小鼠移植6周后,实验组共存活鼠12只.而未移植者在60天内死于肿瘤.4.流式细胞分析移植30天后小鼠外周血中人CD3 细胞从最低新鲜脐血移植组(0.48±0.40)%,最高SCF IL-3,6,7组中为(3.01±1.25)%.RT-PCR 检测发现,在12只扩增后移植存活6周小鼠中,检测不到bcr/abl 基因.在3只新鲜脐血移植存活6周的小鼠中,1只呈现阳性,说明移植取得了造血与免疫重建.所有脐血移植小鼠均未出现明显临床GVHD 症状.结论这种扩增后含一定水平T、NK免疫细胞的脐血能重建可移植性BALB/c 白血病小鼠的造血和免疫.