siRNA抑制食管癌EC9706细胞VEGF-C体内外表达的定量分析

目的观察小分子干扰RNA(siRNA)对人食管癌EC9706细胞中血管内皮生长因子C(VEGF-C)体内外表达的抑制作用。方法根据VEGF-C cDNA已知序列,设计并体外转录合成3条siRNA,将它们分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染EC9706细胞,并以无关序列转染和正常EC9706细胞为对照。以免疫组化S-P法和定量分析技术,分别检测上述各组细胞中和荷瘤动物瘤组织中VEGF-C蛋白的表达强度(positive unit,PU)。结果未转染细胞对照组和无关序列转染组,均有大量VEGF-C蛋白阳性颗粒,两者之间PU差异无显著性;siRNA转染的3组中,仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒,与未转染细胞对照组和无关序列组相比,PU值差异均有统计学意义(P<0.01)。结论VEGF-C siRNA能有效抑制食管癌EC9706细胞中VEGF-C体内外的表达,可望成为一种抗食管癌淋巴管生成的新方法。     

沉默EC9706核干细胞因子基因对裸鼠移植瘤生长的作用

观察由RNAi诱导的EC9706核干细胞因子（NS）基因沉默对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:BALB/c裸鼠15只,分为3组,siRNA干预组皮下注入pRNAT-U6.1-siNS2转染的EC9706细胞,无关siRNA对照组皮下注入pRNAT-U6.1-siC转染的EC9706细胞,空白对照组皮下注入正常EC9706细胞,接种5周分别测定各组裸鼠移植瘤体积,并应用RT-PCR技术检测裸鼠移植瘤组织中NS mRNA的表达。结果:无关siRNA对照组及空白对照组于第4天在接种部位出现肉眼可见的肿块,siRNA干预组于第6天在接种部位发现肉眼可见肿块。第5周各组裸鼠成瘤率均为100%。空白对照组、无关siRNA对照组和siRNA干预组瘤体大小分别为（1 806.40±77.75） mm3、（1 702.20±88.60） mm3和（847.00±82.25） mm3,3组相比差异有统计学意义（P<0.05）。空白对照组、无关siRNA对照组和siRNA干预组移植瘤组织中NS mRNA的表达量分别为0.681±0.033、0.685±0.034和0.497±0.056,3组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论:沉默EC9706细胞的NS基因可抑制裸鼠移植瘤生长,降低裸鼠体内NS mRNA的表达。沉默NS基因有可能成为治疗食管癌的新策略。      

沉默锌指蛋白217基因对食管鳞癌EC9706细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨锌指蛋白217基因(ZNF217)在食管鳞癌侵袭转移中的作用.方法 合成ZENF217基因的siRNA序列并转染对数生长期食管鳞癌EC9706细胞.设置转染无义序列siRNA和未转染EC9706细胞为阴性对照和空白对照.半定量RT-PCR和Western blot方法分别检测转染48 h后3组细胞ZNF217 mRNA和蛋白的表达变化;侵袭小室检测3组细胞穿膜细胞数变化;MTT法分析3组细胞增殖能力的变化.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞ZNF217 mRNA和蛋白表达均显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05);转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞穿膜细胞数显著下降,差异有统计学意义(P ＜0.05);ZNF217 siRNA能明显抑制EC9706细胞体外增殖能力(P＜0.05).结论 ZNF217基因表达下降能显著抑制EC9706细胞体外侵袭力和增殖能力,ZNF217基因有望成为食管癌基因治疗的有效靶点.     

全反式维甲酸对EC9706荷瘤裸鼠抑瘤作用的实验研究

目的：观察全反式维甲酸的体内抗肿瘤作用，探讨其体内抑瘤的作用机制。方法：采用裸鼠EC9706人食管癌细胞实体瘤模型进行体内抑瘤实验研究，应用全反式维甲酸10d后处死裸鼠，观察荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况，测定肿瘤生长抑制率；HE染色对肿瘤组织进行细胞形态学观察，TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡，免疫组织化学法检测凋亡相关基因bax及bcl-2蛋白的表达情况。结果：全反式维甲酸对裸鼠EC9706人食管癌细胞实体瘤生长具有明显的抑制作用，抑瘤率达60％以上。组织学观察及TUNEL检测结果显示，肿瘤组织中散在凋亡细胞和凋亡小体。免疫组织化学检测结果显示，凋亡相关基因bax蛋白表达增加，bcl-2蛋白表达下降。结论：全反式维甲酸具有较强的体内抗肿瘤作用，作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

沉默STAT3基因对人食管癌EC1细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

目的构建STAT3靶向短发夹RNA（shRNA）质粒,研究其对人食管癌EC1细胞裸鼠皮下移植瘤的作用,探讨其在食管癌基因治疗中的可行性和特异性。方法构建STAT3的siRNA真核表达载体pSUPER-EGFP-STAT3,稳定表达该质粒的细胞为实验组,转染空质粒细胞及未处理细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型;监测肿瘤生长变化,HE染色观察肿瘤病理学变化,RT-PCR、免疫组化方法检测STAT3mRNA和蛋白变化。结果裸鼠体内实验显示,实验组肿瘤增长受到明显抑制;HE染色显示对照组肿瘤体积大、异形明显;RT-PCR、免疫组化结果表明实验组STAT3mRNA和蛋白表达下调。结论shRNA沉默STAT3基因能抑制人食管癌EC1细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,且能在体内有效下调STAT3mRNA和蛋白的表达,为食管癌的基因治疗提供了新的靶点,开辟了新的思路。     

利用siRNA抑制HER-2表达的研究

目的利用siRNA抑制人乳腺癌MCF-7细胞中HER-2基因的表达。方法针对HER-2mR-NA设计了5条siRNA,并构建相应的表达质粒,将质粒转染MCF-7乳腺癌细胞,筛选稳定表达株,利用RT-PCR分析siRNA对细胞中HER-2mRNA的降解作用;利用流式细胞术分析细胞表面HER-2蛋白的表达;利用裸鼠进行体内成瘤性实验,用免疫组化法检测瘤组织中HER-2的表达。结果siRNA3P能明显降低MCF-7细胞中HER-2mRNA的丰度;流式细胞分析表明,其中siRNA2P和3P稳定转染的MCF-7细胞表面HER-2的表达明显降低;五种表达不同siRNA的MCF-7细胞在裸鼠体内的成瘤性均有所降低,并且瘤组织中HER-2蛋白的表达也明显减少。结论靶向HER-2mRNA的siRNA能在体内外有效抑制HER-2的表达,可用于乳腺癌的基因治疗。     

eIF4E反义寡核苷酸对人食管癌EC9706细胞中eIF4E HPA表达的影响

目的:探讨真核起始因子4E(eIF4E)反义寡核苷酸对人食管癌EC9706细胞中elF4E及肝素酶(HPA)蛋白、mRNA表达的影响,并观察其对EC9706细胞侵袭力的抑制效果.方法:针对eIF4E mRNA翻译起始区设计经硫代磷酸化修饰的反义寡核苷酸(ASODNS),经脂质体转染食管癌EC9706细胞,采用原位杂交、Western Blot和Boy-den chamber侵袭实验等方法检测抑制前后EC9706细胞中eIF4E及HPA表达情况及细胞侵袭力改变.结果:elF4E ASODNS转染食管癌EC9706细胞24、48、72h后,eIF4E及HPA的mRNA与蛋白表达量均较对照组有所降低(P＜0.05).且均以转染72h的抑制效应最为明显,在每个时间段内随剂量增加elF4EASODNS抑制效应明显增强(P＜0.05);eIF4EASODNS对HPA蛋白、mRNA表达的抑制效应和对eIF4E蛋白、mRNA表达的抑制效应,呈正相关关系(蛋白r=10.02, mRNA r=10.17,P均<0.01);eIF4EASODNS体外转染食管癌EC9706细胞后,其穿越Matrigel的细胞数明显少于细胞对照组、空白对照组和无关对照组(P均<0.05).结论:elF4E ASODNS可抑制食管癌EC9706细胞中eIF4E、HPA蛋白及mRNA表达,且可抑制食管癌EC9706细胞的浸润转移.该研究结果为临床治疗食管癌等恶性肿瘤浸润转移奠定一定的理论基础.     

重组质粒pEgr-P16在EC9706细胞中的辐射诱导凋亡作用

背景与目的:研究pEgr-P16重组质粒在食管癌细胞系EC9706中的辐射诱导凋亡作用.材料与方法:pEgr-P16重组质粒通过脂质体介导转染人食管癌EC9706细胞,定量RT-PCR检测2 Gyγ射线照射后被转染细胞中P16的表达和细胞凋亡率的变化.结果:对照组无P16蛋白表达,转染质粒组细胞接受2Gyγ射线照射后2～24 h P16表达量与时间呈曲线关系,在22 h时P16的mRNA水平最高;P16基因联合放射可诱导食管癌细胞凋亡,凋亡率高于单纯照射组和单纯基因诱导组.结论:γ射线可诱导pEgr-P16重组质粒在人EC9706细胞中表达并显著提高EC9706细胞的凋亡率.本研究结果为食管癌基因-放射治疗的进一步研究奠定了实验基础.     

siRNA对人食管癌EC9706细胞真核起始因子4E表达的影响

目的探讨siRNA对人食管癌EC9706细胞中eIF4E表达的影响。方法针对GeneBank中eIF4E基因的不同靶点,设计并合成两条特异siRNA及一条无义siRNA寡核苷酸模板,利用体外转录法合成siRNA,在脂质体介导下以150ng/μl、200ng/μl和250ng/μl三种浓度转染EC9706细胞,分别培养24h、48h、72h,同时设正常对照组。采用免疫细胞化学及原位杂交技术检测转染前后EC9706细胞中eIF4E蛋白和mRNA的表达;应用流式细胞技术检测转染前后EC9706细胞周期的变化情况。结果转染siRNA后细胞形态发生明显改变。不同浓度的两条特异siRNA转染细胞后,eIF4E蛋白及mRNA表达量均较正常对照组降低,并且具有显著的剂量依赖性（P<0.05）,但两转染组之间相比,差异无统计学意义（P>0.05）;无义siRNA未表现出对eIF4E基因表达的抑制效应（P>0.05）;两条特异siRNA转染组与无义siRNA转染组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。三种不同浓度siRNA转染细胞72h后与无义转染组及正常对照组相比,G₀/G₁期细胞比例显著增加,S期细胞比例相对减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论特异性siRNA能有效抑制人食管癌EC9706细胞中eIF4E基因的表达,抑制细胞增殖。     

自噬基因Beclin1对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的:探讨自噬基因Beclin1在裸鼠体内对人肺腺癌A549细胞成瘤性的影响。方法:将重组质粒pRNAT-U6.2/Lenti-si423和pLenex-Beclin1通过脂质体介导的方法分别转染到A549细胞中。采用实时荧光定量PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR,RFQ-PCR)和蛋白质印迹法分别检测转染细胞中Beclin1mRNA和蛋白的表达;MTT法检测转染细胞在体外的增殖能力。将过表达或沉默Beclin1基因的A549细胞株分别接种于裸鼠右侧腋部皮下,观察瘤体的生长速度和大小,并采用RFQ-PCR和免疫组织化学法检测瘤体组织中Beclin1mRNA和蛋白的表达。结果:转染重组质粒pLenex-Beclin1的A549细胞中Beclin1mRNA和蛋白表达量显著增加,而体外增殖能力被明显降低;转染重组质粒pRNAT-U6.2/Lenti-si423的A549细胞中Beclin1mRNA和蛋白表达量显著减少。过表达Beclin1组的裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,肿瘤体积明显缩小、质量明显减轻,移植瘤组织中Beclin1mRNA以及蛋白的相对表达量增加;而Beclin1基因沉默组的移植瘤组织中Beclin1mRNA及其蛋白的相对表达量降低。结论:自噬基因Beclin1的过表达可以抑制A549细胞在裸鼠体内的生长,有望成为肿瘤治疗的一个新靶点。     

CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

Objective: To construct the small interfering RNA (siRNA) expression vector of carcino-embryonic antigen (CEA) and inhibit the expression of CEA in EC9706 cells by RNA interference. Methods: Two pairs of oligonucleotide sequences were designed and synthesized according to the encoding sequence of mRNA of CEA. The annealed oligonucleotide frag-ments were cloned into pRNAT-U6.2 expression vector and identified by sequencing. The recombinant plasmid pRNAT-U6.2-CEA was transfected into EC9706 cells. The expression of CEA in the stable transfected cells was assayed by real time PCR and Western blot. Results: DNA sequencing showed that the oligonucleotide fragments were correctly inserted into pRNAT-U6.2 vector, and CEA expression in the transfected cells was down-regulated significantly by pRNAT-U6.2-CEA at both the mRNA and protein levels. Conclusion: The siRNA expression vector of CEA is successfully constructed and inhibits CEA expression in EC9706 cells. This facilitates further studies of the function of CEA at the molecular level.     

Notch1信号途径在食管鳞癌细胞株EC9706的作用研究

目的：研究Notch1基因在食管癌细胞株中的表达及其对食管鳞癌细胞EC9706凋亡的影响.方法：通过免疫细胞化学检测Notch1基因在EC9706细胞中的表达.通过RT-PCR扩增Notch1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Notch1,转染EC9706细胞,利用Western blotting检测转染pcDNA3.1-Notch1载体12h,24h,48h,72h的食管癌细胞株与转染空载体食管癌细胞株中Notch1的表达,并观察每一时期食管癌细胞株的凋亡情况.结果：在食管癌细胞株中Notch1基因低表达,此外,转染Notch1后的细胞株Notch1表达量与转染空载体相比有明显差异（F=80.442,P＜0.05）.经组间两两比较,实验组食管癌细胞株的Notch1的表达量在12h时比对照组食管癌细胞株的表达量显著增高（P＜0.01）,前者约为后者的4.6倍.但48h至72h时Notch1表达量实验纽与对照组食管癌细胞株无显著性差异（P＞0.05）.进一步通过倒置显微镜发现48h至72h细胞出现大量凋亡的现象.上述结果说明12h Notch1表达量的增加,使食管癌细胞EC9706中的Notch1信号途径得以激活,该途径激活后导致48h到72h时的细胞大量凋亡.结论：Notch1在食管癌细胞中的激活引起细胞大量凋亡,提示Notch1基因有可能成为治疗食管癌的新靶点.     

Notch1基因在食管鳞癌细胞株EC9706中的表达及其对细胞凋亡的影响

背景与目的:早期的研究显示,Notch1信号途径与肿瘤的发生密切相关,在细胞的生长、增殖、分化和凋亡中起着十分重要的作用.本研究旨在研究Notch1基因在食管鳞癌EC9706细胞中的表达及其对EC9706细胞凋亡的影响.方法:通过免疫细胞化学方法检测Notch1基因在EC9706细胞中的表达.采用RT-PCR技术扩增Notch1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Notch1(命名为pcNICD),转染EC9706细胞,利用RT-PCR及Western blot检测稳定转染pcNICD 载体、转染pcDNA3.1空载体及未处理的EC9706细胞中Notch1的表达,另通过流式细胞仪检测未处理、转染pcDNA3.1和转染pcNICD的EC9706细胞的凋亡.结果:EC9706细胞中发现Notch1基因的表达.与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,转染pcNICD的EC9706细胞中Notch1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显增加,大约增加3倍(P＜0.05);但未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞中Notch1的表达差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞检测结果显示,在未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞中,细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05);但与与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比.转染pcNICD的EC9706细胞转染后24 h、48 h和72 h时细胞凋亡率明显增加(P＜0.01).结论:Notch信号途径的激活引起食管鳞癌EC9706 细胞的凋亡.提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞癌的新靶点.     

Notch1信号途径在食管鳞癌细胞中的激活及对细胞周期的影响

目的 观察Notch1信号途径在食管鳞癌EC9706细胞中的激活状态及 其对细胞周期的影响。方法 通过免疫细胞化学检测Notch1基因在 食管鳞癌细胞株EC9706细胞中的表达,并通过免疫荧光方法研究 Notch1基因在EC9706细胞中的激活状态。并且利用CCK-8试剂检测食管癌细胞的增殖状态。此外,采用RT-PCR和Western blot技术检 测与细胞周期相关基因的表达,最后通过流式细胞仪进一步探索激 活的Notch1信号途径对细胞周期的影响。结果 转染pcNICD后的食 管鳞癌细胞株中发现Notch1基因的表达。免疫荧光结果显示,转染 pcNICD后的食管鳞癌细胞株中Notch1信号途径处于激活状态。与未处理和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,稳定表达NICD的EC9706细 胞的生长速率明显受到抑制（P<0.01）。此外,与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,稳定表达NICD的EC9706细胞的CDK2, cyclin D1和E基因的mRNA和蛋白的表达明显下调（P<0.05）。转染pcNICD的EC9706细胞在G0/G1期的比率高达74.5%,而未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞在G0/G1期的比率分别为59.1%和59.0%。细胞周期分析显示瞬时表达NICD的EC9706细胞在G0/G1期比率的增加,提示激活的Notch1信号途径能够诱导细胞静止在G₀/G₁ 期。结论 Notch1信号途径的激活引起食管鳞癌细胞的细胞周期 静止,提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞癌的新靶点。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

Nuclear expression of Twist promotes lymphatic metastasis in esophageal squamous cell carcinoma

Twist-1 protein (also called Twist) has been suggested to be involved in tumor epithelial-mesenchymal transition (EMT) related progression, however, the mechanism by which twist promotes lymph node metastasis is not fully understood. In the present study, we found that nuclear twist expression is clearly correlated with lymph node (LN) metastasis as determined by immunohistochemistry (IHC). A highly invasive EC109 cell subline, EC109-P, was established by repeated in vitro transwell isolations for the cell model. Immunofluorescence (IF) assay demonstrated that nuclear twist expression was markedly higher in the highly invasive EC109-P cell line when compared with EC109 and EC9706 cells. Based on our cell model, the function and mechanism by which twist regulates LN metastasis in ESCC was investigated. The results showed that the overexpression of Twist could significantly increase the invasion and VEGF-C expression of EC9706 cells, whereas the knockdown of twist expression results in the opposite effects. This finding was further strengthened by the results of the analysis of co-expression of twist and VEGF-C by IHC in ESCC clinical samples. In summary, our study indicates that nuclear twist plays an important role in ESCC lymphatic metastasis by increasing the expression of VEGF-C. The combination of twist and VEGF-C detection could be a reliable prediction of LN metastasis in ESCC.     

RNAi干扰食管癌EC9706细胞MTA1基因表达对侵袭和迁移的影响

Objective  To observe the effect of MTA1 gene silencing by RNA interference on invasion and migration of esophageal carcinoma 9706 cells. Methods  siRNA expression vector targeting MTA1 gene was transfected into EC9706 cells by Lipofectamine method. MTA1 mRNA and protein expressions were detected through quantitative RT-PCR and Western Blot, respectively. The invasion and migration of EC9706 cells were evaluated by scrape wound healing assay and cell invasion assay in vitro. Results  MTA1 gene expression decreased significantly. The scrape wound of EC9706 cells healed more slowly and the cell population that cut through Matrigel were less in the EC9706 cells transfected with siRNA expression vector than non-transfected EC9706 cells and EC9706 cells transfected with blank vector (P < 0.05). Conclusion  MTA1 gene silencing by RNAi can inhibit the invasion and migration of esophageal carcinoma effectively. It is supposed that MTA1 gene may be a prospective molecule target in tumor therapy. Supported by a grant from the “Tenth Five-Year Plan” Research Foundation for the Key Construction Project (211 Projects) by Ministry of Education of China (2002).     

RNAi-induced K-Ras Gene Silencing Suppresses Growth of EC9706 Cells and Enhances Chemotherapy Sensitivity of Esophageal Cancer

To analyze the growth, proliferation, apoptosis, invasiveness and chemotherapy sensitivity of EC9706 cellsafter K-Ras gene silencing, an expression carrier pSilencer-siK-Ras was constructed, and the EC9706 cell linewas transfected using a liposome technique. Six groups were established: Control, siRNA NC (transfected withempty vector pSilencer2.1); Ras siRNA (transfected with pSilencer-siK-Ras2); Paclitaxel; Paclitaxel + siRNANC; and Ras siRNA + Paclitaxel. After the treatment, RT-PCR, Western blotting, MTT assay, flow cytometryand the Transwell technique were used to assess expression of K-Ras mRNA and protein in EC9706 cells, aswell as cell growth, proliferation, apoptosis and invasiveness. The effect of Paclitaxel chemotherapy was alsotested. pSilencer-siK-Ras2 effectively down-regulated expression of K-Ras mRNA and protein in EC9706 cells,growth being significantly inhibited. Flow cytometry indicated obvious apoptosis of cells in the experimentalgroup, with arrest in the G1 phase; cell migration ability was also reduced. After pSilencer-siK-Ras2 transfectionor the addition of Paclitaxel, EC9706 cells were suppressed to different extents; the suppressive effect wasstrengthened by combined treatment. The results suggested that RNAi-induced K-Ras gene silencing couldenhance chemotherapy sensitivity of esophageal cancer.