PCR室间质量控制研究状况

ＰＣＲ技术现已得到一定程度的普及，许多单位将其作为一种常规应用于多种病原微生物的临床检测和诊断。国外学者近年来相继报道对全球范围内许多研究室建立的乙肝病毒ＤＮＡ，丙肝病毒ＲＮＡ和结核杆菌ＤＮＡ的ＰＣＲ检测方法进行的室间质量控制研究，结果表明不同研究室所建立的ＰＣＲ的敏感性和特异性，差别较大，本文对此简要综述。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测DNA甲基化方法的建立

近期，表观遗传学与肿瘤发生关系的研究日益增多。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，并已成为肿瘤早期诊断的研究热点。甲基化特异性PCR（MSP）是检测DNA甲基化的常用方法之一，该方法灵敏度和特异度高，但操作繁琐，难以自动化。TaqMan荧光定量PCR法，即Methylight在MSP的基础上设计1条TaqMan探针，该方法的准确性和检测的灵敏度都很高。然而，因需要设计合成特异的探针而使其的应用受限，而且TaqMan探针昂贵。本研究建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR（FQ—PCR）检测DNA甲基化的方法，通过临床标本检测和对比试验，以证明其与Methylight的检测效能，以便为DNA甲基化检测的临床应用提供工具。     

巢式PCR检测外周血血浆和白细胞中人巨细胞病毒核酸

目的比较用巢式PCR检测外周血血浆和白细胞中人巨细胞病毒（HCMV）DNA的阳性率。方法93例外周血标本分离血浆和白细胞，分别提取DNA后进行巢式PCR检测，同时进行荧光定量PCR以及HCMV IgM测定。结果白细胞HCM VDNA检出率为32．3％，明显高于血浆的16．1％（P〈0．017），巢式PCR检测敏感度高于荧光定量PCR（检出率8．6%，P〈0．017）；9例具有系列标本的患者中，用白细胞DNA检测的阳性例数和频度均高于血浆DNA。结论检测HCMV DNA时，以白细胞作为检测材料的阳性率高于血浆，巢式PCR敏感度高于荧光定量PCR。     

等位基因特异性PCR结合金磁微粒免疫层析检测膀胱癌患者尿液中TERT突变

目的建立可检测人尿液DNA中端粒酶逆转录酶(TERT)启动子区域突变的方法。方法设计等位基因特异性PCR引物,利用温度梯度PCR确定等位基因特异性PCR程序,利用金磁微粒检测板进行扩增产物检测。收集34例膀胱癌患者的尿液,提取DNA,利用该文建立的等位基因特异性PCR结合金磁微粒免疫层析方法检测TERT启动子区域突变。结果建立了结合等位基因特异性PCR和金磁微粒免疫层析的TERT启动子区域C228T和C250T突变检测方法。34例膀胱癌患者尿液中8例患者存在C228T突变,1例患者存在C250T突变。结论该研究建立了TERT启动子区域C228T和C250T突变检测方法,可应用于膀胱癌患者尿液DNA突变检测。     

咽拭子和痰标本中SARS冠状病毒核酸检测

目的 建立SARS冠状病毒的RT—PCR核酸检测方法。方法 合成针对SARS冠状病毒特异性引物，从SARS病人及疑似病人标本中提取RNA，经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析，并将序列与SARS冠状病毒和其它已知冠状病毒进行同源性分析。结果 从SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到多例RT—PCR阳性片段，其中8个片段经克隆和DNA序列分析证实为SARS冠状病毒序列(同源性100％)，而所有参照标本RT—PCR均为阴性。结论 该方法可用于SARS冠状病毒的RT—PCR核酸检测。     

SYBR greenⅠRQ-PCR定量检测DNA方法的改良与建立

目的探讨用改良SYBR green I实时定量PCR（RQ—PCR）技术消除引物二聚体（PDs）对定量分析的影响，建立准确的定量检测DNA含量的方法。方法以β-actin为目的基因，通过对扩增产物和PDs熔解曲线的分析找出各自的解链温度（Tm），选择在高于PDsTin但低于目的片段Tm的温度时检测荧光信号，建立改良SYBR green IRQ—PCR方法。结果该法可消除PDs对SYBR green IRQ—PCR的影响。用此法构建所得标准曲线斜率为－3．178866，相关系数为－0．980535，PCR反应动力学范围达5个log值（10^2-10^6）；精确性检测中，DNA含量实测值与预测值的差异无统计学意义（P〉0．05）；稳定性检测中，3种不同浓度标本的批内变异和批间变异分别为1％、3％、2％和2％、4％、4％。结论改良SYBR green IRQ—PCR可有效消除PDs对定量分析的影响，对目的基因DNA拷贝数进行PCR反应线性范围广、敏感性、精确性和稳定性好的定量检测。是一种简便实用的DNA定量检测的方法。     

荧光定量PCR检测鼻咽部脱落细胞内EBV-DNA

目的 建立荧光定量PCR（FQ－PCR）检测鼻咽部脱落细胞中EBV－DNA的方法。方法 以患者鼻咽部脱落细胞内DNA作为样本，以EB病毒基因序列中EBNA1（核抗原1）基因片段作为扩增的靶DNA，同时从人β－珠蛋白DNA片段作为内参照，合成了两对引物，并设计了两个特异的荧光探针，优化了FQ－PCR反应体系，同时对这两个片段进行扩增，每一标本得到两个Ct值；CtE和Ctβ，得到单位细胞EB病毒的相对量。结果 临床标本29例中，阳性22例，阴性7例，临床资料证实阳性者全部为鼻咽癌（NPC），阴性者全部为非鼻咽癌。结论 建立的FQ－PCR检测鼻咽部脱落细胞中EBV－DNA的方法，能反映单位细胞病毒的复制情况，可用于NPC的筛查，并可能应用于该病的风险评估和疗效观察。     

巢式聚合酶链式反应检测布鲁氏菌核酸DNA方法的建立

目的建立一种具有灵敏性高,特异性强的巢式聚合酶链式反应(PCR)方法检测血液标本中布鲁氏菌核酸DNA。方法使用细菌基因组提取试剂盒提取纯菌核酸DNA;使用血液等组织基因组核酸DNA提取试剂盒提取血液标本核酸DNA,对提取的核酸DNA先行常规PCR预扩增,以扩增的PCR产物为模板进行荧光定量PCR第二次扩增(即巢式PCR)。对纯菌提取的核酸DNA进行灵敏度和和特异性测试,构建巢式PCR的Ct值与核酸DNA拷贝数之关系曲线;检测临床血液标本核酸DNA,同时比较常规两种PCR方法检测结果。结果常规PCR检测的灵敏度为512个核酸DNA拷贝数;巢氏PCR检测有效范围为921.6 ng/μl^6.8 fg/μl,对应的Ct值为12.04~37.50,其指数关系为:y=(e-0.695x)×1012;R2=0.9986,巢式PCR扩增效率为2.28×109倍,检测限为2个布鲁氏核酸DNA拷贝数。巢式PCR的灵敏度为91.67%,特异度为93.10%,阳性预测值为91.67%,阴性预测值为93.10%。对一起羊养殖场采集的25份血液标本应用巢式PCR方法检测,结果阳性率为92.00%(23/25);27份健康人群血液标本没有检测出(无Ct值)。结论巢式PCR具有较好的灵敏性和特异性,特别适合于血液标本布鲁氏菌核酸DNA的检测。     

预制备抗体—DNA偶联物的免疫聚合酶链反应检测HBsAg

目的：探讨一种实用敏感的乙型肝炎表面抗原（HBsAg)检测方法。方法：利用亲和素作为桥梁连接生物素化DNA和抗体，形成抗体－亲和素－DNA偶联物，在抗原抗体特异性反应的基础上，聚合酶链反应（PCR）扩增抗体所连的DNA片段，通过检测DNA来判断相应抗原存在与否。结果：免疫PCR检测敏感度为常规酶联免疫试剂盒的300倍，结论：预制备抗体＿DNA偶联物的免疫PCR是一种检测HBsAg的敏感方法。     

实时荧光定量PCR在人血液循环DNA检测中的应用

循环DNA主要存在于人血浆和血清等体液中，在多种人类疾病中含量升高，具有临床诊断意义和预后判断价值。本研究以人工重组质粒DNA为内参照物，建立双重实时荧光定量PCR检测方法，对健康人血浆和血清DNA含量进行定量测定。[第一段]     

100例HBV—DNA阳性结果与乙肝血清学标志物间的相互性分析

1材料与方法1．1标本血清来源于本院门诊和病房的就诊者。1．2仪器美国PE公司生产的9600DNA扩增仪；芬兰实验仪器MultiskanRC酶标仪。1．3PCR法试剂盒由南方医院基因技术研究室及上海复华公司提供；ELISA法，用ELISA法检测HWsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。试剂由华美公司提供。试验按说明书操作。2结果见附表3讨论3．1从所测结果可以看出，HBV—DNA阳性的标本有75％ELISA法检测HBsAg、HBeAg、HBcAb为阳性，5％HBsAg、HBeAg为阳世。但是，仍有20％AnV—DNA阳性的标本，ELISA法检测HkAg是阴性（过去认为HB…     

两种冰冻全血基因组DNA提取方法的比较

目的比较挑取白细胞法和裂解红细胞法获得人冰冻全血中的白细胞，提取基因组DNA的方法。方法分别分析DNA的收获量和OD260／0D280比值，同时，用PCR/SNP敏感性分子开关技术对两种方法获得的模板DNA进行SNP分析。结果挑取白细胞法DNA收获率高，纯度高，裂解红细胞法得到的DNA的产量和纯度相对较低；用PCR/SNP敏感性分子开关检测表明挑取白细胞法和裂解红细胞法制备的DNA模板可进行有效的体外扩增，但挑取白细胞法目的条带特异，而裂解红细胞法有扩增条带但有非特异带。结论对冰冻全血推荐采用挑取白细胞法进行大规模血样DNA的提取，建立高质量的DNA库，用于复杂疾病的基因检测和疾病SNP相关性研究。     

PCR检测血液中烟曲霉菌DNA方法探讨

[目的]探讨聚合酶链反应(PCR)方法检测血液中烟曲霉菌DNA的敏感性和特异性及应用效果。[方法]将烟曲霉菌菌株转种于沙氏琼脂斜面上制备烟曲霉菌菌孢子悬液，建立免疫功能低下烟曲霉菌感染动物模型，采用PCR方法检测2、4、8、16、24和48h血液、血浆中以及不同保存条件下血液标本中的烟曲霉菌DNA。[结果]动物全血中烟曲霉菌DNA检测2h检出33％，4h检出83．3％，8h后检出率100％；而血浆中烟曲霉菌：DNA检测在24h达最高检出率即50％；在全血中烟曲霉菌DNA检测与血液培养对比检测结果，全血烟曲霉菌DNA检出率明显优于烟曲霉菌血液培养法；在4℃、-20℃保存24、72h内敏感性基本相同，室温下保存48h内检测的敏感性无明显变化，室温保存72h后检测的敏感性比24h降低40％(9／15)。[结论]在侵袭性曲霉菌感染的PCR诊断中，以全血中提取烟曲霉菌DNA检出率明显优于血浆中烟曲霉菌DNA检出率。     

实时荧光定量PCR检测HBV—DNA在诊断乙型肝炎中的价值

目的：分析实时荧光定量PCR（Real Time PCR）检测HBV—DNA在诊断乙型肝炎病毒（HBV）中的作用。方法：分别用实时荧光定量PCR和ELISA方法检测389份临床病人血清，并用t检验分析比较HBV—DNA阳性结果。结果：在血清学标志物组合模式中，多种组合都可检测出HBV—DNA含量，尤其是在传统认为没有HBV感染的血清中也可检测到一定程度的HBV—DNA含量。结论：实时荧光定量PCR检测HBV—DNA是乙肝病毒在体内复制和传染的可靠指标，特别是在反映HBeAg阴性的乙型肝炎患者是否有病毒复制的诊断中有重要意义。     

单管多重PCR快速检测STD病原菌

目的建立一种同时检测解脲支原体(UU)、沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)三种病原体DNA的方法并用于临床标本检测。方法建立单管多重PCR体系,其结果与常规PCR法比较。结果可以一次性检测出解脲支原体、沙眼衣原体和淋病奈瑟菌。结论该法特异性好,单管多重PCR体系检测3种STD病原菌DNA的灵敏度最低为0.43 fg,与单独的PCR检测的灵敏度相同,将它做成体外基因诊断试剂盒能快速特异性指导单种和多重感染。     

实时荧光定量PCR检测结直肠癌患者粪便肿瘤型M2-PK DNA及临床应用研究

目的建立适用于结直肠癌患者粪便标本肿瘤型M2丙酮酸激酶(M2-PK)DNA检测的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法,分析自建方法的临床应用价值。方法采用PCR方法扩增肿瘤型M2-PK DNA片段(162bp),纯化后采用TA克隆法转入PGM-T载体,构建重组质粒。以重组质粒为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,评价自建方法的敏感性、特异性和重复性。选择2014年1月至2016年6月确诊的结直肠癌患者200例,同期体检健康者100例,采用自建方法对受试者粪便和血清标本进行肿瘤型M2-PK DNA检测,并与酶联免疫吸附法肿瘤型M2-PK检测结果进行比较。结果测序结果证实重组质粒构建成功。自建方法检测肿瘤型M2-PK DNA的灵敏度为10copy/mL,对肌肉型M2-PK DNA和M1型丙酮酸激酶(M1-PK)DNA检测结果为阴性,批内及批间变异系数为0.3%~2.9%。实时荧光定量PCR检测患者粪便标本肿瘤型M2-PK DNA阳性率为92.50%,ELISA检测肿瘤型M2-PK阳性率为80.00%。粪便和血清标本肿瘤型M2-PK DNA实时荧光定量法检测结果与肿瘤病理分期密切相关。结论本研究建立的实时荧光定量PCR法适用于结直肠癌患者粪便标本肿瘤型M2-PK DNA检测,具有特异性强、灵敏度高的特点,可用于结直肠癌早期诊断。     

Delta模块HLA配型检测方法的建立

为了建立delta模块配型的检测方法，采用盐析法提取DNA，PCR技术扩增delta模块。GeneScan模式检测PCR产物。结果表明，在104份随机样本中，PCR扩增出的delta模块具有高度多态性。DNA片段长度范围在81-393bp，片段数目为6-32个；片段长度集中在81-118bp，140-175bp，217-301bp，340-393bp4个区域。结论：建立的delta模块配型技术是可行的，可以用于造血干细胞移植供者的筛选。首次获得了中国汉族人群delta模块的数据资料。     

应用聚合酶链反应法检测食品中的沙门菌

目的建立食品中沙门菌聚合酶链反应（PCR）的快速检测方法。方法根据沙门菌invA基因序列设计引物；氯化镁孔雀绿选择性增菌0到8h后，煮沸法提取DNA，用PCR扩增电泳。结果PCR法能特异性检测出食品中的沙门菌，扩增片段为389bp，增菌前的检出限为10^2CFU／g，增菌后为2CFU／25g。结论应用PCR检测沙门菌具有快速、特异、灵敏和简便的特点。     

肺炎链球菌多重巢式荧光PCR分型方法的建立和应用

目的建立一种敏感且节省标本的多重巢式荧光PCR方法，用于临床标本中肺炎链球菌的分型。方法以检测肺炎链球菌种属（lytA基因）和20组常见血清型的引物和探针为基础，分别采用92株不同血清型的肺炎链球菌菌株和系列稀释的参考DNA模板，建立多重巢式荧光PCR方法。 评价该方法的特异性和敏感性，同时与荧光PCR方法进行比较。 将该方法用于14份肺炎链球菌培养阳性和30份肺炎链球菌培养阴性的临床标本的检测，评价实际应用效果。结果多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法能准确鉴定/区分大部分菌株（90/92）的血清型。 前者的检测灵敏度为1～100 fg/μl，9种血清型的灵敏度高于荧光PCR方法（10～100 fg/μl）。 44份临床标本中，多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法分别检测出34和31份阳性（P＝0.778），2种方法的DNA模板使用量分别为15 μl和66 μl。结论多重巢式荧光PCR比荧光PCR方法节省标本且更加灵敏。     

人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立

目的 建立带有内参照的双重实时荧光定量PCR方法检测血浆DNA含量.方法 构建重组质粒DNA作为内参照物,采用共用下游引物的双重实时荧光定量PCR技术同步扩增人看家基因β-actin和重组质粒载体中人工合成DNA序列,定量检测健康成年人血浆DNA含量.结果 本法能在同一个反应管中对目的基因和内参照进行同步扩增,两者的扩增无相互干扰,特异性好;重组质粒DNA的平均扩增效率达90%,β-actin基因的平均扩增效率接近100%;本法批内变异系数（CV）11%,批间CV17%.结论 成功建立含有内参照的双重实时荧光定量PCR方法,可对血浆DNA进行定量检测.