人胎盘组织源造血干/祖细胞的初步研究

为了探讨足月胎盘组织源单个核细胞(human mature placenta tissue-derived mononuclear cells,hPTMNC)中CD34+细胞的体外增殖、分化能力,寻找新的造血干/祖细胞来源供临床应用,分别采用流式细胞术检测、造血干/祖细胞集落培养和体外无细胞因子长期培养的方法,测定胎盘组织源和脐血中的CD34+细胞及其亚群和集落形成单位的数量。结果表明:胎盘组织源CD34+细胞(2.74±0.61%)及其亚群CD34+/CD38-细胞(2.46±0.42%)、造血干/祖细胞集落CFU-GM(186.90±24.52)和BFU-E(101.40±13.35)水平都较脐血CD34+细胞(1.73±0·32%)、CD34+/CD38-细胞(0.80±0.25%)、CFU-GM(136.90±25.15)、BFU-E(49.20±8.13)高;前者在体外无细胞因子培养条件下存活时间长,且细胞数量增加约2倍。结论:胎盘是胎儿期的造血器官,胎盘细胞成分更幼稚,是一种造血干/祖细胞移植的新的种子细胞。     

脐血浆刺激造血活性研究

目的　研究脐血浆刺激造血活性。方法　检测脐血浆的造血因子水平及其扩增外周造血干细胞 (PBSC)作用和刺激生成CFU GM、CFU Mix、BFU E作用。结果　① 33例脐血浆中 4例检测出GM CSF ,2 0例检测到IL 3和IL 6 ,33例检测到EPO ,各细胞因子之间不具相关性 ;②液体培养 6d后 ,脐血浆组有核细胞数为 (1.0 8± 0 .2 0 )× 10 6/ml,胎牛血清 (FCS)组为 (0 .72± 0 .0 5 )× 10 6/ml,脐血浆对体外培养维持PBSC活细胞数明显优于FCS(P <0 .0 5 ) ,但无明显扩增作用 (P >0 .0 5 ) ;甲基纤维素半固体培养PBSC 14d时 ,脐血浆组集落数为 (13± 11)× 10 5,而FCS组集落数为 0 ,二者比较有显著差别 (P <0 .0 1)。结论　脐血浆含有多种造血因子 ,其刺激造血活性与IL 3浓度成正相关 ,但与IL 6和EPO的相关性则较小。     

脐血干细胞库的建立及其临床应用

目的建立无关供者脐血干细胞库,用于治疗骨髓衰竭、恶性及非恶性血液病、某些遗传病、重型免疫缺陷等疾病的干细胞移植.方法采集足月顺产或剖宫产的新生儿脐血,以羟乙基淀粉分离红细胞,DMSO/LMD冷冻保存.每份脐血常规检测细胞活率、有核细胞计数、祖细胞体外培养、CD34+细胞检测、HLA配型及病原学检测等.结果共采集2318份脐血,合格1240份,合格率为53.5%,合格脐血采集的平均体积(98.3±27.0)ml,分离后脐血有核细胞为(1.2±0.5)×109,回收率为(88.90±9.65)%.脐血细胞存活率为(97.00±2.61)%.CFU-GM数为(5.18±14.35)×105,BFU-E数为(10.35±11.55)×105,CFU-Mix数为(1.03±1.47)×105.脐血分离后CD34+细胞百分率为(0.5±0.32)%,细菌培养阳性4例,4例脐血CMV-IgM阳性.在广州脐血库的172例脐血移植登记患者中,HLA匹配4个位点以上的占91.12%.至2000年5月共提供9份应用于无关供者脐血移植,其中6例植入,植入成功率66.7%.结论脐血库的建立可使脐血能够较好地应用于造血干细胞移植治疗,建立脐血库有良好的应用前景.     

脐血造血干细胞库建立及其临床应用

目的 建立脐血造血干细胞库,用于治疗白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血等疾病。方法 采集新生儿脐血,用6％HES离心法分离脐血有核细胞以缩小脐血体积,样本以10％DMSO保存,检测有核细胞数、CD_(34)~+、CFU-GM及HLA,并作病原学捡测。结果 收集590份脐血,合格230份(合格率39％),平均脐血体积(89±20)ml,平均有核细胞数(1.48+0.36)×10~9,分离后有核细胞数(1.25±0.28)×10~9,有核细胞回收率(91+7)％,脐血CD_(34)~+细胞的百分率为(0.37±0.26)％,复苏后CFU-GM回收率为84％,平均每份脐血含CFU-GM(0.9±0.4)×10~6个集落,14％的样本CMV抗体阳性。73人查询,HLA 4个抗原以上相合率为95.7％。至2001年7月,提供3份脐血用于非亲缘脐血移植,1份用于亲缘脐血移植,3例植入,1例排斥。结论 建立脐血库有良好的应用前景。     

脐血细胞的生物学特性的研究

目的 探讨脐血造血干/祖细胞的质和量以及淋巴细胞的表型特征。方法 收集34份脐血,利用6％的羟乙基淀粉沉淀红细胞,用甲基纤维素半固体培养法观察造血干/祖细胞的增殖能力,流式细胞仪检测CD34~ 细胞的数量和淋巴细胞的表型。结果 34份脐血的有核细胞回收率为79.2％±13.7％,平均有核细胞数为(12.2±4.3)×10~8;BFU-E、CFU-GM分别为(2.05±1.22)×10~6、(3.14±1.43)×10~6;CD34~ 细胞数平均为(1.98±1.30)×10~7;CD4~ T淋巴细胞表达CD45RA达90.97％±6.96％,CD8~ T淋巴细胞表达CD45RA达98.93％±0.36％,均显著高于正常成人外周血淋巴细胞(P<0.01)。结论 单份脐血的干/祖细胞可以满足成人移植的需要,且脐血中的淋巴细胞功能不成熟,同种异体的免疫反应弱,用于移植时移植物抗宿主病(GVHD)的发生率可能较低。     

人胎盘组织造血干/祖细胞的分离富集

为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞(HSPC)的标化流程,采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬液,用羟乙基淀粉(6%HES)法从中分离出单个核细胞(MNC),再经免疫磁珠分选法分选出CD34-、CD34+CD38-、CD34+CD38+3个细胞亚群,用流式细胞术对各阶段分选细胞进行表型分析并计算分选细胞的富集度和回收率。结果表明:机械法加胶原酶消化法制备的人胎盘组织单个细胞悬液中单个核细胞(MNC)数达(12.30±3.51)×108,与脐血初始样品所含的MNC数(8.86±5.38)×108比较差异无统计学意义,而其CD34+细胞所占百分率[(3.93±2.31)%]则明显高于脐血[(0.44±0.29)%]。胎盘组织单个细胞悬液经6%HES分离后MNC和CD34+细胞的回收率分别为(45.3±11.7)%和(51.1±9.8)%;MNC经免疫磁珠分选后,其CD34+细胞的纯度和回收率分别为(73.4±14.1)%和(52.7±11.7)%。结论:本实验所建立的"机械法加胶原酶消化法-HES分离MNC-MACS分选目标细胞"的分离纯化方法可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的HSPC,为进一步研究胎盘HSPC提供了比较经济、效果较好的分离富集方案。     

FL与SCF、IL-3、GM-CSF及EPO协同调控脐血造血干/祖细胞的体外扩增

目的　探讨造血细胞因子的不同组合对脐血造血干 /祖细胞的扩增作用。方法　应用免疫磁珠法分离纯化脐血CD3 4+ 造血干 /祖细胞 ,在体外液体培养体系中经各种不同细胞因子组合扩增 1周 ,用流式细胞仪检测CD3 4+ 造血干 /祖细胞并进行甲基纤维素法半固体培养 2周 ,在倒置显微镜下计数集落产率。结果　在FL、SCF、IL 3、GM CSF、EPO造血细胞因子的不同组合下脐血造血干 /祖细胞得以扩增 ,以IL 3+SCF +FL +EPO组的扩增效率最高 ,其有核细胞数、CD3 4+ 细胞及CFU GM、BFU E集落分别扩增 46 2± 175、3.47± 1.6 4、2 6 4± 10 5和 12 8± 6 7倍。结论　FL对扩增CD+ 3 4细胞具有较强的协同作用 ,合理的细胞因子组合扩增的脐血造血干 /祖细胞可成为异基因造血干细胞移植的主要来源。     

全反式维甲酸促进造血干/祖细胞植入的实验研究

目的　通过小鼠脐血移植 (UCBT)模型在体内观察全反式维甲酸 (RA)对脐血造血干 祖细胞 (HSPC)植入的影响。方法　用 380mg kg致死量环磷酰胺 (CTX)预处理后 ,将C57BL 6(H 2 b)的胎鼠和新生鼠外周血 (FNPB) (有核细胞数为 1× 1 0 6和 0 .5× 1 0 6个 )分别输注至BALB c(H 2 d)小鼠体内 ,于移植前 2天至移植后 2天分别用 1 5mg·kg-1 ·d-1 和 5mg·kg-1 ·d-1 RA处理受鼠 ,观察受鼠造血和免疫恢复、移植物抗宿主病 (GVHD)、植入水平和存活率。结果　经两种剂量RA处理后 ,造血和免疫重建明显加快 (P <0 .0 5)。未见急性GVHD。受鼠植入水平比对照组明显提高。当移植 1× 1 0 6细胞数时 ,两种剂量RA处理组均可提高移植后 30天和 60天存活率 (分别为 72 .73 %和 70 .83 % ) ,与对照组(41 .67% )相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 5) ;当移植 0 .5× 1 0 6细胞数时 ,两种剂量RA亦能提高存活率(分别为 42 86 %和 43 .48% ) ,与未经RA处理对照组 (1 4 .2 9% )相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 5) ,并且与移植 1× 1 0 6细胞数未经RA处理组的存活率相当。结论　在小鼠UCBT模型中 ,RA能促进脐血HSPC的植入 ,为RA应用于临床UCBT提供了实验依据     

两份脐血联合移植治疗成人慢性粒细胞性白血病一例

为了探讨两份非亲缘供者脐血联合移植治疗成人血液系恶性肿瘤患者的造血重建及移植相关性并发症 ,对 1例成人慢性粒细胞性白血病患者进行两份非亲缘供者脐血联合移植。预处理采用白消安 /环磷酰胺 (Bu/Cy)方案。移植物抗宿主病 (GVHD)的预防采用霉酚酸酯 (MMF)联合环孢霉素 (CsA)和短程氨甲喋呤 (MTX )方案。移植总单个核细胞数为 4.63× 10 7/kg ,CD3 4 + 细胞数为 8.3 4× 10 5 /kg。采用PCR法测定患者外周血细胞短串重复序列 (STR)获取植入证据。结果表明 :患者于移植后 2 3天外周血中性粒细胞绝对值 >0 .5× 10 9/L ,移植后 3 3天外周血血小板 >2 0× 10 9/L ,移植后 47天血小板 >50× 10 9/L。移植后 ,患者Ph染色体转阴性 ,bcr/abl融合基因阴性。移植后 3 1天 ,46天及 71天查外周血STR显示其中 1份脐血完全植入。患者于移植后 13天出现Ⅱ度急性GVHD ,经治疗后消失。结论 :脐血联合移植可用于成人恶性血液病的治疗 ,多份脐血联合移植可能是解决单个核细胞数偏低问题的途径之一     

异基因外周血干细胞移植供者CD34细胞及亚群的测定

目的　探讨流式细胞技术测定异基因外周血干细胞移植 (allo PBSCT)中供者细胞表面分化抗原 34 (CD34 )细胞及其亚群变化和意义。方法　应用流式细胞多色分析技术 ,测定 15 1份allo PBSCT供者 ,经细胞因子动员后外周血标本CD34 及其亚群变化及影响因素。结果　在检测的15 1份标本中 ,CD34 细胞占外周血单个核细胞的 (0 .95 4± 0 .46 6 ) % ,含量为 (3.5 5± 2 .41)× 10 9/L ;其中CD34 CD38-亚群含量为 (0 .2 5 3± 0 .2 40 )× 10 9/L ,占CD34 细胞的 6 .78% ;CD34 HLA DR 亚群含量为 (0 .2 73± 0 .310 )× 10 9/L ,占CD34 细胞的 6 .82 % ,两者差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ;随着采集次数的增加 ,CD34 细胞及其亚群数量逐渐减少 (P <0 .0 5 ) ;随着供者年龄增加 ,其外周血CD34 细胞数逐渐减少 ,≥ 40岁供者CD34 细胞百分比和含量比 <2 0岁供者分别降低了 47%和 5 0 % ;动员后外周血CD34 细胞数存在性别差异 ,男性供者外周血CD34 细胞数较女性高 2 3%。结论　应用流式细胞多色技术测定外周血造血干祖细胞 ,不仅能确定造血细胞数量 ,而且对造血干祖细胞的质量进行评价 ,为临床干细胞移植治疗提供重要数据。     

1963份脐血造血干细胞的处理与保存

本研究目的是建立脐血造血干细胞库的标准工作程序。采用自然沉降法加离心法制备脐血的造血干细胞 ,经CD34 细胞计数、集落培养、微生物检测、传染病指标检测、HLA分型后 ,将造血干细胞贮存在液氮中保存。结果表明 :贮存脐带血造血干细胞有核细胞数平均值为 (10 .94± 2 .74 )× 10 8,回收率为 (79.82± 17.76 ) % ,CD34 细胞数平均值为 (5 1.6 2± 30 .5 3)× 10 5。 8份脐带血造血干细胞冰冻 2年后复苏 ,其有核细胞、CD34 细胞、CFU GM回收率分别为 (91.4± 6 .0 ) %、(84 .6± 2 0 .0 ) %、(85 .8± 14 .9) %。结论 :本方法和程序能有效地保存脐带血造血干细胞。     

人胎盘源贴壁细胞支持脐血CD34+细胞体外扩增

从胎盘中分离培养人胎盘源贴壁细胞 (humanplacentaderivedadherentcells,hPDAC) ,研究其对脐血CD34+细胞体外扩增作用。以酶消化法自人胎盘组织中分离培养hPDAC ,并以流式细胞术对其进行鉴定。进一步 ,采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞 ,建立以hPDAC为滋养层的CD34+细胞体外扩增培养体系 ,并与无滋养层的液体培养体系相比 ,观察不同培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞百分率的影响。结果表明 ,人胎盘组织中可分离培养出hPDAC ,并证实其为混合性细胞群体 ,主要含有间充质细胞。以hPDAC为滋养层的共培养体系较无滋养层液体培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞均具有明显的扩增效应 ,其中以SCF +IL 3+IL 6 +FL +hPDAC组扩增效果最强 ,分别扩增了 ( 12 6 .0± 6 .7)倍 ,( 4 9.8± 1.7)倍和 ( 8.3± 1.6 5 )倍。上述结果提示 ,hPDAC具有体外支持造血作用 ,并提供了一与脐血CD34+细胞体外扩增相适应的新滋养层。     

人胎盘与脐动、静脉血造血干/祖细胞归巢相关黏附分子表达的研究

为了评价人胎盘组织造血干/祖细胞(hematopoieticstem/progenitorcell,HSPC)的归巢能力,采用机械法制备人胎盘组织单个细胞悬液,用流式细胞术分析胎盘组织及脐动、静脉血有核细胞中CD34+细胞及其亚群的含量,检测三者来源的CD34+细胞表面归巢相关黏附分子CD44、CD11a、CD62L、CD49d、CD49e和CD54的表达水平。结果显示,胎盘组织CD34+细胞及CD34+CD38-细胞百分率明显高于脐动、静脉血;脐动脉与脐静脉血中HSPC百分率没有明显差异。胎盘来源CD34+细胞高度表达黏附分子CD11a、CD49d、CD44、CD49e及CD54,其中表达CD49e及CD54水平明显高于脐动、静脉血CD34+细胞。胎盘来源的CD34+CD62L+细胞百分率为(64.58±15.52)%,低于脐静脉血来源的表达。结论:人胎盘富含HSPC。胎盘来源的CD34+细胞多数黏附分子的表达水平近似或高于脐血,提示胎盘HSPC的归巢能力有可能强于脐带血。     

山东脐血库保存4000人份脐血资料的统计分析

对山东脐血库保存的 4 0 0 0人份脐血的部分结果进行了统计分析 ,每份脐血的平均有核细胞数超过 1.2× 10 9,每份脐血CD34+ 细胞总量平均为 3.9× 10 6,有 76 8人份脐血有核细胞数超过 1.5× 10 9,一般可满足体重 4 0kg以上的患者使用。对基因频率的分析表明 ,常见基因与中国其他地区的统计结果相近 ,有 4 0 %的患者可以在山东脐血库找到 1个位点不合的脐血     

人脐血及骨髓淋巴细胞免疫表型的比较及其意义

为比较脐血和骨髓淋巴细胞及祖细胞分化抗原，通过流式细胞术（FCM）双标法对38份脐血及10份骨髓免疫细胞表型进行了分析研究。研究发现：（1）脐血及骨髓淋巴细胞中均测到稚淋巴细胞（CD3^-CD4^ )，且前中含量较多，但脐血细胞毒T细胞含量（CTL，CD3^ CD16^ 56^ )低于骨髓；（2）脐血中NK细胞（CD3^-CD16^ 56^ )比例高于骨髓；（3）脐血有核细胞中CD34^ 细胞的比值接近于骨髓，但脐血CD34^ 细胞中髓系祖细胞（CD34^ CD13^ ,CD34^ HLA-DR^ )及淋巴系祖细胞（CD34^ CD19^ )含量均低于骨髓，结论：（1）脐血免疫细胞具有不成熟性，这估计是脐血移植后GVHD程度轻的主要原因；（2）脐血淋巴细胞中NK细胞含量较高，推测脐血移植后移植物抗白血病效应（GVL）并不会降低；（3）脐血CD34^ 细胞中髓系祖细胞及淋巴系祖细胞比例均低于骨髓，可能是脐血移植后造血及免疫重建速度较慢的原因之一。     

转基因骨髓基质细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增作用的研究

为探讨转染FL基因的人原代骨髓基质细胞对脐血CD34+ 细胞的体外扩增效应 ,建立了转基因骨髓基质细胞与人脐血CD34+ 细胞共培养体系。采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+ 细胞 ,在不同的体外培养体系中进行培养并取样检测细胞总数 ,CFC和CD34+ 细胞百分率。结果表明 ,在不同组合的培养体系中 ,转基因骨髓基质细胞培养体系较骨髓基质细胞培养体系和无滋养层培养体系对有核细胞总数 ,CFC含量和CD34+ 细胞含量均具有明显的扩增作用 ,分别扩增了 12 2 .5± 4 .3,39.6± 2 .7和 11.8± 0 5 2倍 (P <0 .0 5 )。结论 :转染FL基因的人骨髓基质细胞协同其它细胞因子可增强对人脐血CD34+ 细胞的体外扩增作用。     

人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究

为了研究人骨髓间充质干细胞(MSC)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用,将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系(HFCL)经60Coγ线照射后分别制备细胞滋养层,比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC-IC数的影响.结果表明,无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO),HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组,以第0天细胞数为100%(下同),有细胞因子组为(9797±361)%vs(7061±418)%,无细胞因子组为(5305±354)%vs(1992±247)%,均P＜0.01.MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异[(825±305)%vs(820±191)%,P＞0.05],但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组[(939±212)%vs(1617±222)%,P＜0.01].MSC滋养层组维持脐血中LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组[第5周CFU-GM数(129.95±8.73)个/105接种细胞数vs(89.81±10.29)个/105接种细胞数,P＜0.05];细胞因子存在时,其作用更为明显[第5周CFU-GM数(192.93±4.95)个/105接种细胞数vs(90.47±14.28)个/105接种细胞数,P＜0.01].MSC与HFCL按一定比例混合,可提高扩增效率.当MSC与HFCL之比为41时,集落形成数量最高,达(186.89±11.11)个/105接种细胞数,明显高于比例为32(131.45±13.02)个/105接种细胞数和二者单用组[前者(138.92±14.84)个/105接种细胞数,后者(64.63±6.11)个/105接种细胞数;均P＜0.01].结论MSC维持脐血中LTC-IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL,HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC,MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率.     

脐血来源树突状细胞的体外诱导及扩增

本研究的目的是分析脐血的细胞组成 ,研究加入细胞因子培养前后脐血树突状细胞的变化 ,探索体外诱导、扩增树突状细胞的方法并进行表型鉴定。选择正常成人外周血 9份 ,脐血 12份 ,分离单个核细胞。在脐血单个核细胞中加入细胞因子GM CSF、IL 3、SCF和EPO ,培养 4周。应用流式细胞仪和CD4、CD8、CD19、CD34、CD38、CD1a、CD11c及CDw12 3单克隆抗体测定正常成人外周血、培养前后 1,2 ,3,4周脐血细胞表面抗原及树突状细胞情况。结果表明 :正常成人外周血CD34 细胞 0 .0 2× 10 5 ml,CD1a 细胞 0 .0 1× 10 5 ml,CD11c 细胞 4 .32×10 5 ml,CD83 细胞 1.31× 10 5 ml,CDw12 3 细胞 1.4 1× 10 5 ml。新鲜脐血中CD34 细胞 0 .2 2× 10 5 ml,CD1a 细胞 0 .2 7× 10 5 ml,CD11c 细胞 5 .87× 10 5 ml,CD83 细胞 1.94× 10 5 ml,CDw12 3 细胞 2 .73× 10 5 ml。加入细胞因子GM CSF ,IL 3,SCF ,EPO后培养 1- 4周的脐血单个核细胞分化为CD1a ,CD11c ,CD83 ,CDw12 3 树突状细胞 ,在培养的 2 - 4周 ,脐血树突状细胞数量明显增多 ,此后逐渐减少。通过培养 ,树突状细胞数量增加 ,CD1a 细胞达 11.0 2× 10 5 ml,CD11c 细胞 2 8.2 4× 10 5 ml,CD83 细胞 10 .5 7× 10 5 ml,CDw12 3 细胞 18.7× 10 5