端粒酶逆转录酶小干扰RNA对胰腺癌Capan-2细胞抑制作用的实验研究

目的探讨RNA干扰（RNAi）对胰腺癌Capan-2细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的抑制效应。方法化学合成靶向于hTERT基因的4个小分子干扰RNA（siRNA）序列,用阳离子脂质体为载体转染Capan-2细胞,分为siRNAl～SinRNA4、siRNA阴性对照和空白对照6组。通过RT—PCR和蛋白质印迹法分别检测胰腺癌细胞转染后细胞hTERTmRNA和蛋白水平,并用MTS法检测细胞生长增殖。结果siRNA1—siRNA4组hTERTmRNA相对表达量分别为0．51±0．22,0．56±0．19,0．44±0．13和0．89±0．21,端粒酶相对活性分别为0．60±0．15,0．63±0．16,0．17±0．12和0．72±0．16,hTERT蛋白相对表达量分别为0．47±0．21,0．52±0．19,0．10±0．11和0．84±0．15,其中siRNA1～siRNA33组的hTERTmRNA表达量、端粒酶活性和蛋白表达量与空白对照组比较有显著性差异（P均〈0．05）。siRNA1～siRNA44组Capan-2细胞在转染后48h时的细胞增长平均抑制率分别为50％,54％,63％和18％。不同siRNA序列对capan-2的转染效率不同,其中siRNA3组能显著下调hTERTmRNA和蛋白的表达水平,并能抑制端粒酶活性和促进Capan-2细胞凋亡,与空白对照组比较均有显著性差异（P均〈0．01）。结论靶向hTERT的RNAi能明显抑制capan-2细胞的增殖,hTERT可作为胰腺癌基因治疗的靶点。     

siRNA分子非病毒载体的生物体内给药系统

 目的综述小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)经非病毒载体介导生物体内给药的研究进展。方法查阅国内外相关文献,进行分析、归纳和综述。结果与结论siRNA分子由于其本身的特性,生物体内给药必须借助合适的给药系统,相对病毒载体,非病毒载体具有简便,安全和毒性小等特点,易于为临床所接受,因而近年来发展迅速。     

基于穿透血脑屏障的siRNA纳米递药系统研究进展

近年来,中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病已经严重威胁了人类的生命健康,血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的存在阻止了大部分药物进入大脑,这使得CNS疾病的治疗成为当今医学和药学领域的重大难题。纳米技术的出现使得药物具有穿透BBB的潜力,小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)药物的快速发展也给CNS疾病患者带来了曙光,但是纳米载体向脑部递药会遇到许多障碍,作为siRNA纳米载体进行脑部递送的条件也非常苛刻。本文主要综述了脂基纳米粒、壳聚糖纳米粒、聚乙烯亚胺纳米粒、树状大分子纳米粒、纳米凝胶、纳米胶束、纳米乳、外泌体、细胞、siRNA缀合物等作为siRNA脑部递药系统的研究进展及优缺点,以期探寻一种合适的siRNA纳米递送系统,用于BBB的穿透。     

siRNA沉默兔bFGF基因表达对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨利用RNAi技术沉默bFGF基因抑制兔血管平滑肌细胞增殖的作用。方法：针对兔bFGF基因的mRNA序列合成siRNA,然后构建携带bFGF—siRNA的质粒载体,将其转染体外培养的VSMC,分别用MTT法、流式细胞术分析细胞增殖率和凋亡率的变化,免疫细胞化学染色观察细胞PCNA的表达变化,同时用RT—PCR检测细胞转染前后bFGF基因表达量的变化。结果：表达bFGF—siRNA的质粒载体转染后VSMC增殖能力减弱,凋亡增加,bFGF的mRNA表达量明显减弱。结论：利用bFGF—siRNA质粒表达载体沉默bFGF基因mRNA能抑制VSMC的增殖。     

叶酸缺乏协同保罗样激酶1小干扰RNA抑制胃癌细胞株生长的研究

目的探讨叶酸缺乏和保罗样激酶1(PLK-1)小干扰RNA(siRNA)的联合作用对胃癌肿瘤细胞的影响。方法 PLK-1 siRNA用Lipofectamine TM 2000作载体转染胃癌细胞株SGC7901和BGC823,real-time PCR和Western blot验证转染效果;然后将转染的SGC7901和BGC823细胞株,继续在叶酸缺乏和正常叶酸浓度培养基中培养72 h,检测细胞增殖、凋亡、周期和蛋白Bcl-2的变化情况。结果叶酸缺乏与PLK-1 siRNA具有协同抑制SGC7901、BGC823细胞增殖,促进凋亡和使细胞周期停滞在G2/M期的作用,二者能协同抑制SGC7901、BGC823 Bcl-2蛋白表达。结论叶酸缺乏和PLK-1 siRNA均能抑制胃癌细胞SGC7901、BGC823的生长,两者具有协同效应。该效应可能与Bcl-2蛋白的抑制有关。     

RNA干扰抑制脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达的实验研究

目的:靶向白细胞介素6受体(sIL-6R)基因构建具有高干扰效率的RNA干扰载体,观察其对脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达抑制效果。方法:靶向sIL-6R基因设计3条短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸片段,构建sIL-6R siRNA重组质粒真核表达载体,转染脊髓源星形胶质细胞,筛选出对sIL-6R基因干扰效率最高的sIL-6R siRNA,用免疫组化染色、RT-PCR及Western blot技术观察其对脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达抑制效果。结果:成功构建sIL-6R siRNA重组质粒真核表达载体,免疫组化染色、RT-PCR及Western blot检测结果证实sIL-6R siRNA能显著下调sIL-6R的表达。结论:sIL-6Rs iRNA重组质粒真核表达载体对脊髓损伤后sIL-6R表达有明显的抑制作用,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤修复中的应用奠定了前期基础。     

RNA干扰及其在药用植物代谢工程中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是把双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)导入某些生物和细胞而引起同源mRNA降解的现象,是一种转录后基因沉默机制。dsRNA在体内被Dicer二聚体切割成21～25bp的小干涉RNA(smallinterfering RNA,siRNA),然后在siRNA引导下,由RNA诱导沉默复合体(RN Ainduced silencing complex,RISC)降解靶mRNA。RNA干扰作为一种新型反义技术可以有效的抑制特异基因的表达,因此可用于对药用植物次生代谢产物的生物合成途径进行调控,达到调控天然产物生物合成的目的。现将RNAi机制研究的最新进展及RNAi在药用植物代谢工程方面的应用进行综述。     

RNA干扰技术在肝癌治疗领域的应用新进展

在全球范围内,肝癌是第5大常见的恶性肿瘤,也是导致人类死亡的主要因素之一。目前,几乎没有针对肝癌的有效治疗手段。因此,发展一种新手段意义重大。RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)作为一种基因沉默技术,能高效且特异地抑制相关基因的表达,为肝癌的基因治疗提供了新的手段和希望。对近几年RNAi技术在肝癌领域的应用进行综述。     

原代皮质神经元的转染及RNA干扰

目的：探讨成功转染原代神经元的方法,为有效利用RNA干扰技术（RNAi）技术研究、治疗中枢神经系统疾病奠定基础。方法：取新生sD鼠皮质神经元,采用Amaxa Nucleofector？技术将外源GFP表达质粒PEGFP—C1vector转染进原代皮质神经元,在荧光显微镜下观察转染效率;同时还将干扰GFP的siRNA转染进原代皮质神经元,通过观察GFP荧光的变化,来探讨原代神经元内的RNAi现象。结果：在Amaxa Nucleofector？转染技术和转染体系下,PEGFP—C1 vector可有效进入原代皮质神经元并进行表达,当共转染特异性siRNA时可呈现出明显的基因干扰现象。在此过程中神经元没有明显的神经毒性反应。结论：Amaxa Nucleofector技术是一种有效转染原代皮质神经元的方法。该方法解决了以往传统转染方法不能有效转染原代神经元的难题,从而为进一步利用原代神经元研究中枢神经系统疾病提供了良好的技术支持。     

靶向VEGF—hTERT基因siRNA表达载体抑骨肉瘤生长的实验研究

目的：观察靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖的影响和对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法：构RNA干扰腺病毒载体rA-hTERT和rAd-VEGF,单独和联合转染人骨肉瘤细胞系MG-63细胞后实时荧光定量PCR检测hTERT和VEGF基因表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后使用siRNA表达载体治疗,观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果：①转染后48h,rAd-hTERT对hTERT基因mRNA的抑制率约84%,对VEGF基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-VEGF对VEGF基因mRNA的抑制率约82%,对hTERT基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-hTERT-VEGF干扰组对hTERT基因表达抑制率约87%,VEGF基因表达抑制率约83%,联合干扰与单基因干扰相比,对hTERT-VEGF基因的表达抑制差异无显著性（P〉0.05）。②干扰组转染后l～6d均能促进细胞凋亡,联合干扰细胞凋亡率与单基因干扰细胞凋亡率相比,差异均有显著性（P〈0.05）。裸鼠实验中,基因组肿瘤的生长均受到明显抑制,且联合干扰组与单基因组比较有显著性差异（P〈0.05）。对骨肉瘤的肺转移联合干扰组有显著的抑制作用。结论：靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞系MG-63细胞和裸鼠骨肉瘤的生长及转移均有明显的抑制作用。