胚胎干细胞的体外培养及分化的研究现状和前景

胚胎干细胞(Embryonicstemsell,ES细胞)是从早期胚胎内细胞团(Innercellmass,ICM)或原始生殖细胞(Primordialgermcell,PGCs)经体外分化抑制培养分离克隆的,ES细胞在组织工程、基因治疗和发育生物学等的应用研究中起着重要作用。本文介绍了ES细胞的生物学特点及国内外研究进展和动态,阐明了建立ES细胞系的技术要点以及它的应用前景。     

胚胎干细胞生物学特性

来源于早期胚胎或原始生殖细胞的胚胎干细胞(ES细胞)可在体外抑制分化培养条件下无限扩增,并保持未分化状态和多能性.ES细胞研究是国际生物科学的热点课题之一.多年来,众多学者对ES细胞形态结构、核型、分化潜能、碱性磷酸酶、胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达以及一些分子标记等生物学特性作了大量研究报道,为ES细胞分离鉴定提供了理论基础.     

牛胚胎干细胞分离克隆及定向分化研究

胚胎干（embryonic stem,ES）细胞自Evans和Kanfman（1981）首次从小鼠胚胎中分离到后,胚胎干细胞技术一度成为各国学者研究的热点。ES细胞是自附置前早期胚胎或附置后胚胎原始生殖细胞分离克隆的一种具有自我更新和全向分化潜能的细胞,其具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能,同时又可以在体外进行培养、扩增、转化、筛选和冻存。它为克隆治疗以及深入研究基因结构与功能、胚胎发育、各种遗传病模型以及克隆动物和转基因动物等提供了新型实验材料。ES细胞在发育生物学基础研究、组织工程研究、临床医学等方面具有诱人的应用前景和重要的科学意义。本研究以牛为实验材料,探讨影响牛ES细胞分离克隆的因素,完善牛ES细胞的分离克隆程序,为人类ES细胞的研究提供相关的技术参数,主要取得了如下几方面的成果。     

胚胎干细胞造血分化研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是具有多向分化潜能和无限增殖能力的细胞,可以从囊胚的内细胞团(ICM)和早期胚胎的原始生殖细胞(PGCs)中分离得到.ES细胞在体外具有分化成胎儿或成体动物各种类型细胞的潜能,可分化为各种组织细胞,包括口腔上皮细胞、造血细胞、平滑肌、横纹肌、神经上皮、复层扁平上皮等[1].     

胚胎干细胞的应用研究

胚胎干细胞(ES)是来源于早期胚胎内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(PGC)的一种多能细胞,具有体外无限复制和高度分化潜能的特性。目前,胚胎干细胞已逐渐应用在胚胎干细胞体外测试(EST)与新药开发,移植治疗与细胞替代治疗,转基因动物与克隆上,并已取得了一定的研究成果。     

大鼠胚胎干细胞的研究进展

胚胎干细胞是来源于早期胚胎内细胞团或着床后胚原始生殖细胞的一类未分化的全能性(多能性)干细胞,具有无限增殖和全向分化的能力。ES细胞能够自我更新和多向分化的生物学特性具有重要的医学价值,在基因治疗、组织工程学、药学研究等许多领域都具有广泛的应用前景。至今为止人类已建立了数百个小鼠的ES细胞系。但相对大鼠而言,由于其ES细胞在体外培养时较易发生分化,故建系较难。Iannaccone等从大鼠PVG近交系大鼠的囊胚分离克隆了大鼠ES细胞系-RESC-01。本文主要综述了目前分离、培养大鼠胚胎干细胞的技术进展,我实验小组在预实验中得到的结果及面临的问题,讨论其在临床工作中的应用前景。     

免疫外科法分离克隆BALB/c小鼠胚胎干细胞

目的　使用免疫外科法分离克隆BALB c小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcells,ES细胞 ) ,为进一步建立BALB c小鼠ES细胞系打下基础。方法　用免疫外科法从 4 5枚BALB c小鼠囊胚中分离得到 2 0枚去除滋养层细胞的ICM ,接种在MEF饲养层上 ,使用DMEM(高糖 ) 15 ?S 0 1mmol Lβ 巯基乙醇 0 0 1mmol L非必需氨基酸 10 0 0IU mlLIF 10 0IU mL青霉素 10 0IU ml链霉素培养液 ,17枚形成典型的ICM集落 (85 0 % ) ,有一枚胚胎传至第 10代。用于全胚培养的BALB c小鼠胚胎共 10 2枚 ,使用与免疫外科相同的培养方法 ,6 6枚形成典型的ICM集落 (6 4 7% ) ,其中一枚胚胎传至第 8代。结果　免疫外科法较全胚培养法有利于小鼠ES细胞的分离与克隆 ;添加LIF(10 0 0IU ml)有利于小鼠ES细胞的分离与传代 (P <0 0 5 ) ;0 0 5 %胰酶 0 0 0 8?TA是较好的ES细胞消化液 ,对细胞综合损伤力小 ,且传代后ES细胞集落形成能力也较高 (P <0 0 5 )。结论　分离得到的ES细胞经形态学观察 ,AKP染色 ,体外分化实验 ,核型分析等证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。     

胚胎干细胞的体外培养及分化的研究现状和前景

胚胎干细胞（Embryonic stem sell，ES细胞）是从早期胚胎内细胞团（Inner cell mass，ICM）或原始生殖细胞（Primordial germ cell．PGCs）经体外分化抑制培养分离克隆的，ES细胞在组织工程、基因治疗和发育生物学等的应用研究中起着重要作用。本文介绍了ES细胞的生物学特点及国内外研究进展和动态，阐明了建立ES细胞系的技术要点以及它的应用前景。     

由囊胚内细胞团分离人胚胎干细胞

胚胎干（Embryonic stem，ES）细胞是由着床前胚胎内细胞团（Inner cell mass，ICM）或原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGC）经体外分离培养而建立的克隆细胞系。ES细胞的特点是只生长、不分化，并保持早期胚胎发育的多能性。本文比较了人囊胚在G２．２培养液和含DMEM培     

人胚胎干细胞分化研究进展

胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell,ES细胞）是由着床前囊胚期内细胞团（Inner Cell Mass,ICM）或早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖细胞（Primordial Germ Cells,PGCs）建立的、可在体外未分化状态下长期增殖传代的、具有稳定的二倍体核型和多能干细胞表面特异抗原标记的、可分化为3个胚层来源的各种组织和细胞类型（包括生殖腺和生殖细胞）的永久细胞系。基于其特性,目前普遍认为,ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育,新基因的发现,药物的筛选和致畸实验及作为细胞组织移植治疗,克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。本文综述了人胚胎干细胞诱导分化研究进展。     

全反式维甲酸诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的研究进展

干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞,它包括胚胎干细胞和成体干细胞.胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是由早期胚胎内细胞团或胎儿原始生殖细胞分离克隆出的具有无限增殖和全能化潜力的细胞.在合适的条件下,胚胎干细胞可以定向诱导形成多种细胞类型.近年来发现可以定向诱导ES分化为神经细胞,这使移植ESC治疗中风、新生儿缺氧缺血性脑病成为可能.准确的分化诱导是应用胚胎干细胞移植促进脑功能重建的基础.目前在体外较多的使用全反式维甲酸(retinoic acid,RA)诱导ESC分化为神经细胞.现将这方面研究进展综述如下.     

人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

[目的]探索体外定向诱导胚胎干细胞(ES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将小鼠胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜共培养4～5 d,观察其形态分化,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化.[结果]与人羊膜共培养4～5 d后,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色后,多数细胞呈现β1整合素阳性,对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞;流式细胞仪检测结果显示实验组和对照组β1整合素阳性细胞分别为81.4%和8.4%,两者比较差异显著,Z检验P<0.01.[结论]人羊膜组织可在体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞.     

胚胎干细胞体外定向诱导分化为神经细胞的方法

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从着床前胚胎(孕3~5 d)的内细胞群(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)等分离得到的能在体外培养的一种高度未分化细胞。早在1981年Evans及Martin分别成功分离培养了小鼠的胚胎干细胞系。1998年Thomoson     

GLP-1、Betacellulin、Activin A、bFGF和Nicotinamide联合诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞

[目的]探讨体外联合应用GLP-1、betacellulin、activin A、bFGF和nicotinamide 5种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化为胰岛素分泌细胞.[方法]以GLP-1、betacellulin、activin A、bFGF和nicoti-namide 5种生长因子诱导E14.1小鼠ES细胞30 d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫组化检测分化细胞胰岛素表达,以流式细胞仪检测胰岛素分泌细胞的分化率,用RIA法测定培养液中胰岛素水平.[结果]分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和胰岛素免疫组化染色阳性,胰岛素分泌细胞的分化率平均为13.6%±3.7%,在5.6 mmol/L和25 mmol/L葡萄糖浓度作用下培养液中胰岛素水平分别为(0.04±0.01)ng/mL和(0.09±0.02)ng/mL.[结论]体外联合应用GLP-1、betacellulin、activin A、bFGF和nicotinamide 5种生长因子能将小鼠ES细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,但胰岛素分泌功能较差.     

小鼠原始生殖细胞源胚胎干细胞的分离培养和建系

目的 :对小鼠胚胎干细胞分离材料的获取及处理、胚胎干细胞分化抑制培养、细胞系的建立及保存所用技术进行探讨。方法 :取胎鼠生殖嵴及其周围组织 ,采用胎鼠的胚胎干细胞与其成纤维细胞共培养的方式进行。结果 :分离得到大量原始生殖细胞(PGCs)集落。多次克隆传代具有胚胎干 (ES)细胞的诸多特征 ,如有连续传代的能力 (有两组分别传至 3代和 4代 ) ,有典型鸟巢状结构 ,AKP染色阳性 ,体外分化实验具有形成类胚体的能力。结论 :从胎鼠生殖嵴中能够获得大量的ES细胞。采用的胚胎干细胞与其成纤维细胞共培养的方式进行胚胎干细胞的分离培养和建系是可行的     

昆明种系小鼠胚胎干细胞的分离培养及特性鉴定

目的 提高昆明小鼠胚胎干细胞（ES细胞）建株的成功率。方法 收集小鼠3．5d的囊胚培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ES细胞样集落,经两次亚克隆分离培养ES细胞;进行相差显微镜观察、碱性磷酸酶染色和体内外分化能力鉴定。结果 获得两个稳定ES细胞集落,传至第11代。ES细胞呈集落样生长,碱性磷酸酶染色强阳性,体外分化的细胞沿拟胚体外向性生长,形态多样,在体分化可形成来源于3个胚层的组织。结论 两次亚克地获得的细胞具有ES细胞主要的生物学性状,有助于提高昆明小鼠ES细胞建株的能力。     

可分化为肝系细胞的干细胞

干细胞是一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞 ,可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。Evans等[1] 1981年首次建立了小鼠的胚胎干细胞系 ,之后国外相继建立了金黄地鼠 (Goldenhamster;Mesocricetusauratus)、大鼠、鸡、兔、猪和猴的胚胎干细胞系。 1998年美国的Thomson等[2 ] 和Gearhart等[3] 分别建立了人的胚胎干细胞 (embryonicstemcell,ES细胞 )和胚胎生殖干细胞 (embryonicgermcell,EG细胞 )系 ,干细胞研究被Science杂志评为 1999年十大进展的首位。利用干细胞可培育新组织和新器官 ,供移植和替代治疗之用 ,另外还可将干细胞作为…     

小鼠胚胎干细胞在六种培养体系的培养观察

目的　观察小鼠胚胎干细胞在六种培养体系中的生长情况。方法　小鼠胚胎干细胞 (ESD3细胞株 )在以下六种培养体系中培养 :1 .原代小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)有血清培养 ,2 .MEF无血清培养 ,3.SNL细胞有血清培养 ,4.LIF(白血病抑制因子 )有血清无饲养层培养 ,5.LIF无血清无饲养层培养 ,6.大鼠肝细胞 (BRL)条件培养基培养。经体外培养 1 0代后 ,观察其克隆形态 ,同时进行碱性磷酸酶检测并将ES细胞接种于裸小鼠皮下 ,观察ESD3的未分化状态和多潜能性。结果　六种培养体系培养的ESD3具有典型的ES细胞克隆形态 :巢状 (集落状 )隆起生长 ,边缘清楚 ,表面平滑 ,结构致密 ;AKP强阳性 ;裸小鼠体内形成了由多种组织构成的畸胎瘤。结论　六种培养体系均能支持ESD3生长 ,并能保持其未分化性和多潜能性 ,为ES细胞的应用研究奠定了良好的基础。     

特异性标记胚胎干细胞分化的成血管细胞

克隆小鼠flk1基因启动子和增强子,构建成血管细胞特异性表达GFP载体,并转染小鼠胚胎干细胞(ES).将ES分化形成胚胎体(EB),观察EB中GFP表达,收集第4天的EB细胞进行流式细胞分析和分选,以获得GFP+细胞进行血细胞集落形成实验,以确定GFP标记细胞造血分化潜能.结果显示,成功构建成血管细胞特异性表达GFP载体;转染的ES形成的EB中可见绿色荧光细胞.流式细胞分析结果发现,转基因组EB中的GFP+细胞(27.5%)与对照组EB中FLK1+细胞(28.1%)比较差异无统计学意义;GFP+和FLK1+细胞形成集落数比较差异无统计学意义.表明对ES分化产生的成血管细胞实现了特异性标记,为后续研究ES体外造血分化的分子机制奠定了基础.     

心脏毒性的临床前检测

胚胎干细胞（ES）衍生心肌细胞代表一个系统，介于原位细胞和培养细胞之间。未分化ES细胞允许进行标准化、扩展和基因操控处理，已分化细胞可提供反映其原始细胞正常生理活动的图像。本文对检测心脏毒性的几种常见模型与含有体外分化的纯心肌细胞的检测系统进行比较。