泡球蚴感染中自噬相关蛋白对巨噬细胞极化的影响

目的通过对感染泡球蚴小鼠肝脏的自噬相关蛋白以及巨噬细胞不同分型的检测,探讨在泡球蚴感染过程中自噬对巨噬细胞极化的影响及可能机制。方法取雌性BALB/c小鼠16只,随机分为实验组与对照组。实验组建立泡球蚴感染小鼠模型,于感染90天处死,通过HE染色观察小鼠肝脏的病理学变化,利用免疫组化等技术检测肝脏中自噬相关蛋白的表达,利用免疫荧光激光共聚焦法进行肝脏组织巨噬细胞与自噬相关蛋白共定位,采用流式细胞术检测肝脏巨噬细胞M1、M2表达水平。结果感染90天时,实验组小鼠肝脏自噬相关蛋白LC3、p62表达均增高,相对表达量分别为2.08±0.3和1.85±0.2,与对照组比较差异均有统计学意义(F值分别为260.114和434.116,均P0.01);实验组小鼠肝脏组织中自噬相关蛋白LC3、p62与巨噬细胞存在共定位表达,Pearson’s相关系数与对照组比较有统计学意义(F值分别为132.219和36.325,均P0.01),Manders重叠系数与对照组比较有统计学意义(F值分别为205.410和140.665,均P0.01);实验组小鼠肝脏巨噬细胞数增加至31.74±1.68,M1型巨噬细胞增加至66.46±1.82,M2型巨噬细胞减少至22.46±0.63,与对照组比较差异均有统计学意义(F值分别为309.358、194.001和759.194,均P0.01)。结论泡球蚴感染小鼠肝脏自噬相关蛋白高表达,促进巨噬细胞以M1型极化,抑制M2型极化,以减轻炎症反应,帮助机体清除病原体。     

Beclin1基因mRNA及其蛋白在泡球蚴感染小鼠肝脏中的表达

目的通过对感染泡球蚴的小鼠肝脏进行自噬相关Beclin1基因mRNA及其蛋白的检测,了解自噬在泡球蚴感染过程中的变化。方法取雌性BALB/c小鼠32只,随机分为实验组与对照组。实验组建立泡球蚴感染小鼠模型,于感染30 d和90 d各处死8只,通过HE染色观察小鼠肝脏的病理学变化,利用qRT-PCR、免疫组化等技术分别检测泡球蚴感染小鼠肝脏中Beclin1基因mRNA及蛋白的表达。结果实验组小鼠肝脏Beclin1基因mRNA及蛋白表达均增高,其中感染30 d和90 d Beclin1基因mRNA及蛋白相对表达量分别为2.34±0.59、14.19±3.49和1.69±0.59、9.23±1.37,差异均有统计学意义(P0.05);与对照组同期比较差异均有统计学意义(P0.05)。且肝组织有典型囊泡病灶。结论泡球蚴感染小鼠肝脏中Beclin1基因高表达,且以感染30d时增高更显著,提示在泡球蚴感染早期和中期,自噬随着感染呈现先增强再减弱的趋势。     

泡球蚴感染小鼠肝脏自噬相关蛋白的表达及其与纤维化关系的研究

目的 通过观察泡球蚴感染不同阶段小鼠肝脏纤维化情况与自噬相关蛋白表达情况,分析在泡球蚴感染中自噬与肝纤维化的关系。方法 取雌性BALB/c小鼠45只,随机分为模型组(30只)与对照组(15只)。模型组小鼠感染泡球蚴,并分别于感染8、30、60、90、180 d处死,通过HE染色观察小鼠肝脏的组织病理学变化,Masson染色观察小鼠肝脏胶原纤维变化,免疫组化法检测肝脏中Atg5、LC3与α-SMA蛋白的表达情况,qRT-PCR检测肝脏中Atg5、LC3、α-SMA mRNA表达水平。结果 模型组小鼠感染泡球蚴8～90 d, Atg5、LC3、α-SMA蛋白及其mRNA表达逐渐增加,其中感染30～90 d时与对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.05);感染180d时Atg5、LC3表达量较之前减低,而α-SMA表达量继续增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 泡球蚴感染早、中期小鼠肝脏自噬相关蛋白高表达,可能促进肝星状细胞活化。     

肿瘤坏死因子-α和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在肝泡型棘球蚴周围单核细胞中的表达

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)在肝泡型棘球蚴周围单核细胞中的表达。方法40只雌性昆明小鼠随机分为实验组(n=20)和假手术对照组(n=20),实验组小鼠开腹直视下肝脏穿刺注射0.1 ml泡型棘球蚴混悬液,对照组注射等量生理盐水。感染6个月后处死小鼠,取肝组织,观察泡型棘球蚴的生长和转移情况;用苏木素-伊红(HE)染色法观察组织病理变化;免疫组织化学法检测TNF-α和caspase-3在肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围组织中的表达;原位末端标记技术(TUNEL)检测肝组织和泡型棘球蚴病灶周围单核细胞的凋亡。结果感染6个月后,实验组小鼠肝脏可见大小不等的结节状或团块状的泡型棘球蚴组织,淋巴结转移率为45.0%(9/20)。HE染色后观察发现,实验组肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围均有大量单核细胞浸润。免疫组化染色结果显示,实验组TNF-α和cas-pase-3蛋白在肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围均有不同程度的阳性表达,单核细胞阳性细胞检出率分别为100%、100%和95%、100%,与对照组肝组织中阳性细胞检出率(5%和0)比较均有统计学意义(P<0.01)。TUNEL结果显示,肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围单核细胞发生凋亡,单核细胞阳性细胞检出率为100%,与对照组比较有统计学意义(P<0.01)。结论泡型棘球蚴在感染宿主过程中,引起TNF-α蛋白高表达,可能参与了诱导肝泡型棘球蚴周围宿主单核细胞的凋亡,从而抑制宿主的免疫功能。     

泡球蚴感染小鼠肝脏中IL-10和TGF-β1的动态变化

目的观察泡球蚴感染小鼠肝脏中白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β1)的动态变化。方法将60只雌性BALB/c小鼠随机均分为实验组和对照组,实验组腹腔注射活原头节悬液0.2ml(约含400个原头节),对照组腹腔注射等量生理盐水,分别于接种后2、8、30、90、180和360d各处死5只小鼠,取肝组织进行病理学检查,并用免疫组织化学法检测肝组织中IL-10和TGF-β1的表达情况。结果实验组小鼠,腹腔和肝小叶出现多处直径不等的小囊泡,随感染时间的延长逐渐增多增大,与周围肝组织分界不明显。HE染色显示,实验组小鼠肝脏出现炎症细胞浸润,泡球蚴纤维囊壁与肝细胞和囊壁之间炎症反应带的形成等不同程度的病理改变;对照组小鼠肝小叶结构完整,偶见少量炎症细胞浸润,肝细胞胞浆疏松化和脂肪变性。实验组小鼠肝组织表达水平随着泡球蚴感染时间的延长而逐渐上升,感染后90d,实验组小鼠肝组织中IL-10和TCF-β1的表达水平均达高峰,细胞阳性率分别为(16.39±1.73)%和(23.69±2.29)%,与对照组比较[(1.09±0.10)%和(0.98±0.09)%]差异均有统计学意义(P<0.01),而且之后均维持在较高水平。结论小鼠泡球蚴感染中晚期,IL-10和TGF-β1表达水平均提高,其免疫抑制作用不利于清除和控制肝脏中泡球蚴。     

泡球蚴感染中期小鼠肝脏病灶周围肉芽肿TGF-β1及其受体TβRⅠ和p-Smad2/3的表达及意义

目的观察泡球蚴感染中期BALB/c小鼠病灶周围肉芽肿中转化生长因子(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)和p-Smad2/3蛋白的表达及意义。方法 8~10周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组。将BALB/c小鼠开腹,肉眼直视下肝左叶注射100μl泡球蚴混悬液,建立小鼠肝泡球蚴感染模型,对照组以相同方法注射等量的生理盐水。于造模第12周时处死小鼠,取肝脏组织,4%甲醛固定、石蜡包埋,4μm连续切片,HE和Masson染色,光镜下观察泡球蚴感染病灶周围病理改变和纤维化程度,采用免疫组织化学技术检测肉芽肿TGF-β1、TβRⅠ受体及p-Smad2/3蛋白的表达。结果实验组小鼠病灶周围以形成典型的大小和形状各异的囊泡为主要特征,囊泡外周纤维结缔组织增生明显,存在不同程度的纤维化。囊泡外围肉芽肿TGF-β1、TβRI和p-Smad2/3的显色指数分别为3.90±1.39、3.18±0.95和3.60±0.93,对照组分别为0.28±0.18、0.32±0.18和0.20±0.14,差异均有统计学意义(P均0.01)。结论囊泡外围组织纤维化较重部位TGF-β1、TβRI和p-Smad2/3表达也相应较高,提示TGFβ1/Smad信号通路可能参与泡球蚴感染小鼠病灶纤维化过程。     

二肽基肽酶-4在泡球蚴感染致肝纤维化中的作用研究

目的 明确二肽基肽酶-4(DPP4)在泡球蚴感染所致肝纤维化中的作用。方法 取泡球蚴不同感染时期(1、3、6个月)小鼠肝脏组织,HE染色检查肝脏组织病理学变化,天狼星红染色法检测肝纤维化程度,免疫组织化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和DPP4的表达,采用相关分析法分析DPP4蛋白表达水平与肝纤维化的相关性。小鼠肝星状细胞(JS1),经60μg/ml泡球蚴蛋白(EmP)刺激后采用实时荧光定量PCR检测DPP4、α-SMA、COL1A1、TIMP1、MMP2的mRNA表达水平。结果 与对照组比较组,模型组小鼠感染泡球蚴后1、3、6个月α-SMA表达上调(阳性面积分别为3.521±0.8862、7.846±0.9873、15.34±0.6263)(均P<0.05),且呈时间依赖;天狼星红染色病灶旁纤维组织阳性面积增加(阳性面积分别为56979±9550、69844±763.8、82687±13774)(均P<0.05),且呈时间依赖;DPP4表达上调(阳性面积分别为5038±201.2、6110±174.4、9021±697.4)(均P<0.05),且呈时间依赖。...     

泡球蚴感染BALB/c小鼠肝脏TGF-β1表达的动态变化

目的观察泡球蚴感染BALB/c小鼠肝脏转化生长因子β1（TGF-β1）的动态变化。方法将60只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,肉眼直视下肝脏穿刺感染泡球蚴。分别于感染后2 d8、d、4周、12周、24周、36周采取小鼠肝脏组织,通过HE和Masson染色观察小鼠肝脏病理改变,免疫组织化学法观察泡球蚴感染不同阶段的TGF-β1动态变化。结果泡球蚴感染小鼠肝脏汇管周围出现炎细胞浸润、脂肪变性、坏死、钙化和肝泡球蚴纤维囊壁形成等多种病理改变;TGF-β1表达水平呈先升高再下降趋势,感染4周、12周、24周、36周时的阳性率分别为（1.44±3.22）%、（18.83±4.03）%（、9.44±4.71）%和（8.13±3.65）%,其中感染12周和36周与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。结论泡球蚴感染BALB/c小鼠TGF-β1表达上调,可能与感染小鼠肝纤维化的发展有关。     

泡球蚴感染C57BL/6小鼠肝脏CD34表达的动态变化

目的 观察泡球蚴(Em)感染C57BL/6小鼠肝脏CD34微血管密度(MVD)的动态变化。方法 将40只C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组,实验组通过肉眼肝叶穿刺感染泡球蚴(Em),对照组通过注射等量PBS。分别于感染后30 d、60 d、90 d及120 d后取小鼠肝脏组织,苏木素-伊红(HE)染色观察肝脏的病理组织学改变,免疫组织化学染色观察泡球蚴感染后CD34-MVD的动态改变。结果 实验组泡球蚴组织各时间点中CD34-MVD分别为(39.10±11.84)/HP、(66.80±11.08)/HP、(111.20±8.00)/HP和(56.14±7.12)/HP,实验组泡球蚴周围肝组织分别为 (1.14±0.82)/HP、(1.56±0.92)/HP、(2.32±1.43)/HP和(1.38±0.82)/HP ;对照组分别为(1.00±0.94)/HP、(1.30±1.06)/HP、(2.00±1.15)/HP和(1.10±0.87)/HP。实验组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);实验组泡球蚴组织内比较,差异有统计学意义(F=94.63,P<0.001);实验组泡球蚴周围肝组织内比较,差异无统计学意义(F=3.24,P>0.05);对照组内比较,差异无统计学意义(F=1.98,P>0.05)。结论 泡球蚴浸润性生长过程中可能伴随着血管新生,血管新生可能为其生长重要的机制之一。     

泡球蚴感染BALB/c小鼠肝脏中ICOS表达的动态变化

目的观察泡球蚴感染BALB/c小鼠肝脏中诱导性协同刺激分子(ICOS)的动态变化。方法将60只BALB/c小鼠随机分成实验组和对照组,实验组经腹腔注射感染泡球蚴,对照组以相同的方法注射生理盐水。分别于感染后2、8、30、90、180和300d各处死5只小鼠,取肝脏组织,通过HE染色观察病理变化,通过免疫组化观察泡球蚴感染后ICOS的动态改变。结果与对照组比较,泡球蚴感染小鼠肝脏ICOS表达升高,表达部位主要在肝细胞浆和肝细胞膜。结论泡球蚴感染鼠肝组织ICOS表达增高。ICOS可能参与泡球蚴感染致肝纤维化及肝损伤过程。     

Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ胶原基因在泡球蚴感染中期小鼠肝脏中的表达及意义

目的观察泡球蚴感染中期BALB/c小鼠所致肝纤维化时Ⅰ型胶原(Col1a1)、Ⅲ型胶原(Col3a1)、Ⅳ型胶原(Col4a1)基因的表达及意义。方法将雌性BALB/c小鼠随机分为实验组(8只)和对照组(5只)。实验组小鼠开腹,肉眼直视下左肝叶内注射泡球蚴混悬液,建立疾病动物模型;对照组以同样方法注射等量生理盐水。于感染中期第12周,颈椎脱臼处死小鼠,实验组取病变组织和病变邻近肝组织,对照组取注射部位所在肝组织以及临近肝组织,用4%甲醛固定,常规石蜡包埋,HE、Masson染色后观察形态学改变和肝纤维化程度。取病变临近肝组织,提取总RNA,反转录合成cDNA,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测Col1a1、Col3a1、Col4a1基因的表达,计量结果用相对单位(AU)表示。结果泡球蚴感染组和对照组Collal基因表达量分别为(2.155±0.809)AU和(1.000±0.221)AU,差异有统计学意义(t=3.427,P<0.05);Col3a1基因表达量分别为(18.641±10.244)AU和(1.000±0.412)AU,差异有统计学意义(t=10.324,P<0.01);Col4a1基因表达量分别为(0.894±0.495)AU和(1.000±0.381)AU,差异无统计学意义(t=1.932,P>0.05)。Masson染色检查泡球蚴感染组肝纤维化评分为2.72±1.04,对照组为1.0,差异有统计学意义(t=4.105,P<0.05)。结论在泡球蚴感染小鼠中期,引起肝纤维化的胶原主要为Ⅲ型和Ⅰ型。     

泡球蚴感染小鼠Tregs与Th17细胞相关细胞因子的平衡变化

目的通过检测泡球蚴感染小鼠血清中Tregs相关细胞因子IL-10与Th17细胞相关细胞因子IL-17的浓度变化,探讨其在泡球蚴感染过程中的平衡变化关系。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组小鼠腹腔接种泡球蚴,对照组小鼠腹腔接种等量生理盐水,分别在接种后2、8、30、90、180和360d实验组与对照组各取5只小鼠,采血,收集血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-10和IL-17的表达水平。结果与对照组相比,小鼠血清IL-10水平在感染中晚期显著升高(P<0.01);IL-17水平在整个感染期均显著性升高(P<0.05),且晚期高于早期(P<0.01);IL-10与IL-17水平成正相关(r=0.655,P<0.01)。结论通过相关细胞因子的作用,Tregs与Th17细胞可能共同促进泡球蚴慢性感染的形成。     

小鼠肝多房棘球蚴中血管新生与病程发展的相关性研究

目的初步探讨小鼠肝多房棘球蚴中血管新生与疾病发生发展的相关性。方法将60只6～8周龄的C57BL/6雌性小鼠随机分成实验组和对照组,每组30只。小鼠经5%水合氯醛溶液麻醉后开腹,实验组小鼠肝脏注射多房棘球蚴原头节混悬液100μl (约400个原头节),对照组注射等量PBS,无菌缝合关腹。分别于感染后30、 60、 90、 120 d,肝脏灌注法观察病变组织血管分布和新生情况;尾静脉采血, ELISA检测小鼠血清中血管内皮生长因子A (VEGFA)的表达;实验组取棘球蚴组织和棘球蚴周围肝组织,对照组取相应肝组织,制备石蜡切片,苏木素-伊红(HE)染色观察病理组织学改变;免疫组织化学染色法观察不同感染时间、不同部位肝脏组织中VEGFA、 CD34和CD31的表达情况。结果肝脏灌注法结果显示,随着感染时间的延长,实验组小鼠肝脏棘球蚴组织逐渐增大,周围可见明显的血管分布。ELISA检测结果显示,感染后30、 60、 90和120 d,实验组小鼠血清中VEGFA浓度分别为269.00、 420.62、 539.00和271.73 pg/ml,差异有统计学意义(P 0.01),且均高于相应对照组的VEGFA浓度(194.00、 173.00、 234.00和127.00 pg/ml)(P 0.05)。HE染色结果显示,随着感染时间的延长,实验组小鼠棘球蚴组织体积逐渐增大,并伴有嗜酸性粒细胞浸润、结核样肉芽组织形成和纤维组织增生,病变内部区域可见原头节和钙化灶。免疫组织化学结果显示,感染后棘球蚴组织中均可见VEGFA、 CD34和CD31不同程度的表达,阳性染色定位于棘球蚴组织内皮细胞。感染后30、 60、 90和120 d,棘球蚴组织中VEGFA免疫组织化学评分分别为(1.60±0.52)、(3.10±0.87)、(4.80±1.32)和(2.40±1.07)分,其中感染后30 d与感染后60 d、 90 d比较差异均有统计学意义(P 0.05, P 0.01);棘球蚴组织与棘球蚴周围组织(VEGFA评分均为0)和对照组(VEGFA评分均为0)比较差异均有统计学意义(P 0.01)。感染后30、 60、 90和120 d,棘球蚴组织中微血管密度(CD34-MVD)分别为(38.70±11.06)/HP、(65.50±8.46)/HP、(109.90±9.40)/HP和(56.86±6.64)/HP,差异有统计学意义(P 0.001),且均高于棘球蚴周围组织和对照组(P 0.01)。棘球蚴组织中CD31-MVD分别为(19.80±3.12)/HP、(30.70±2.50)/HP、(47.90±4.77)/HP和(31.10±3.84)/HP,差异有统计学意义(P 0.01),且均低于Em周围组织和对照组(P 0.001)。结论多房棘球蚴浸润性生长中伴有血管新生, VEGFA的分泌刺激了血管新生,新生血管促进棘球蚴的生长。     

泡球蚴感染C57BL/6小鼠不同阶段Ⅲ型胶原的表达及意义

目的探讨Ⅲ型胶原(Col3a1)在泡球蚴感染C57BL/6小鼠早期(1月,Em-1m)和中期(3月,Em-3m)的表达变化及意义。方法采用门静脉注射法建立泡球蚴感染小鼠模型,分别于感染后1个月和3个月将小鼠处死,取肝脏,HE染色和天狼星红染色观察纤维化程度,免疫组化检测Col3a1的表达。用60μg/ml泡球蚴蛋白体外刺激人肝星状细胞(LX-2)12h、24h、48h和72h后,qRT-PCR检测LX-2细胞中Col3a1mRNA表达水平。结果 HE染色显示泡球蚴感染组小鼠发生肝脏纤维化。天狼星红染色显示泡球蚴感染Em-1m组和Em-3m组胶原纤维阳性面积与假手术组(Sham组)比较有统计学意义(Em-1mvs Sham-1m:8.14±0.84vs 1.00±0.37;Em-3mvs Sham-3m:34.40±5.07vs1.00±0.08,P0.01);Col3a1免疫组化检测阳性面积比值泡球蚴感染Em-1m和Em-3m组与假手术组比较有统计学意义(Em-1mvs Sham-1m:32.05±5.24vs 1.00±0.37;Em-3mvs Sham-3m:37.58±10.84vs 1.00±0.08,P0.01)。qRT-PCR结果显示60μg/ml泡球蚴组织蛋白刺激LX-2 72h后Col3a1mRNA相对表达量为1.29±0.49,与刺激12h时的Col3a1mRNA相对表达量0.35±0.08相比差异有统计学意义(P0.05)。结论随着泡球蚴感染时间的增加,小鼠肝脏Col3a1表达逐渐增加且纤维化程度加重。     

细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞免疫功能的影响北大核心CSCD

目的探讨不同剂量细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞(natural killer T cells)免疫功能的影响。方法经肝门静脉注射细粒棘球蚴建立C57BL/6小鼠感染模型,对照组注射生理盐水。感染组分为低剂量组(50个原头蚴,LD)、中剂量组(500个原头蚴,MD)和高剂量组(2 000个原头蚴,HD)。于造模后12周采集小鼠肝脏和脾脏标本,采用HE及Masson染色检查肝脏病灶和纤维化程度;采用流式细胞术检测小鼠脾脏NKT细胞表型、不同NKT亚群比例,以及相关细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17A)的表达情况。结果不同剂量细粒棘球蚴感染组小鼠肝脏均可见囊泡结构样病灶,病灶周围出现胶原沉积,对照组肝脏仅汇管区可见少量胶原沉积。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT细胞比例分别为(1.34±0.27)%和(1.33±0.21)%,与对照组(2.54±0.43)%和低剂量组(2.41±0.53)%比较差异有统计学意义(F=16.451,P<0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69^(+)CD4^(+) NKT细胞比例分别为(15.6±2.00)%和(17.5±3.98)%,与对照组(11.1±2.82)%和低剂量组(11.1±1.31)%比较差异有统计学意义(F=8.130,P<0.05)。高剂量感染组小鼠脾脏CD69^(+)CD8^(+) NKT细胞比例为(70.1±7.52)%,与对照组(85.3±2.68)%和低剂量组(83.1±3.90)%比较差异有统计学意义(F=12.42,P<0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69^(+)DN NKT细胞比例分别为(29.3±2.02)%和(27.2±5.20)%,与对照组(35.6±4.26)%比较差异有统计学意义(F=3.277,P<0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT1型细胞分泌IFN-γ比例低于对照组和低剂量组(F=40.00,P<0.01)。高剂量感染组小鼠脾脏NKT2型细胞分泌IL-4比例高于对照组、低剂量组和高剂量组(F=10.54,P<0.001)。中、高剂量感染组脾脏NKT17型细胞分泌IL-17A比例低于对照组和低剂量组(F=13.00,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏NKT10型细胞分泌IL-10比例高于对照组(F=45.59,P<0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT1型细胞分泌IFN-γ比例分别为(14.55±2.12)%和(10.43±0.85)%,与对照组(25.88±6.82)%和低剂量组(22.13±4.36)%比较差异有统计学意义(F=16.73,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT2型细胞分泌IL-4比例分别为(10.14±1.00)%、(10.64±0.73)%和(12.97±1.66)%,与对照组(7.07±0.72)%比较差异有统计学意义(F=19.99,P<0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT17型细胞分泌IL-17A比例分别为(2.46±0.72)%和(2.26±0.57)%,与对照组(4.11±1.07)%和低剂量组(4.56±0.91)%比较差异有统计学意义(F=10.54,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4^(+)NKT10型细胞分泌IL-10比例分别为(8.42±1.38)%、(12.65±4.19)%和(15.7±3.72)%,与对照组(4.66±0.87)%比较差异有统计学意义(F=15.78,P<0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD8^(+)NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=20.08,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD8^(+)NKT型细胞分泌IL-10与高于对照组比较差异有统计学意义(F=24.41,P<0.01或P<0.001)。中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=26.82,P<0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IL-10比例与对照组比较差异有统计学意义(F=22.96,P<0.05)。结论细粒棘球蚴感染中期,不同剂量感染诱导小鼠机体产生的细胞免疫反应由NKT1型和NKT17型模式转向NKT2型和NKT10型亚群优势,导致NKT细胞亚群之间的偏移失衡,造成细粒棘球蚴在宿主体内慢性寄生。     

泡球蚴持续感染对小鼠肝脏纤维化的影响

目的评价泡球蚴持续感染对小鼠肝脏纤维化的影响,为研究泡型棘球蚴病肝纤维化进展及其治疗方法提供参考。方法以泡球蚴感染长爪沙鼠血清(25、50、100μL)和泡球蚴及其生发层细胞、原头节分别对肝星状HSC-T6和LX-2细胞进行体外刺激48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖,应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HSC-T6细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白(collagen 1, Col1)和α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达量。收集泡球蚴感染1、2、4、6、8个月小鼠血清和肝脏,分别采用ELISA法检测血清中Col1和α-SMA含量,采用天狼猩红染色法动态观察肝脏胶原纤维沉积情况。结果泡球蚴感染沙鼠血清体外可诱导HSC-T6和LX-2细胞增殖,不同血清剂量组细胞增殖率差异均有统计学意义(FHSC-T6=126.50、FLX-2=201.50,P均0.05);其中100μL血清对HSC-T6和LX-2细胞促增殖率最高,HSC-T6和LX-2细胞增殖率分别为(573.36±206.34)%和(940.38±61.65)%。泡球蚴感染沙鼠血清体外刺激后,HSC-T6细胞培养上清中Col1和α-SMA蛋白含量均上升;且以100μL血清刺激后Col1和α-SMA含量最高,分别为(20.99±2.01)ng/m L和(305.52±16.67)pg/mL。泡球蚴及其生发层细胞、原头节均可体外诱导HSC-T6和LX-2细胞增殖,增殖率分别为(142.65±9.17)%和(189.99±7.75)%、(118.55±8.96)%和(122.54±0.21)%、(156.34±17.45)%和(160.59±31.41)%,不同刺激组细胞增殖率差异均有统计学意义(FHSC-T6=11.24、FLX-2=47.72,P均0.05);泡球蚴及其生发层细胞、原头节刺激后,HSC-T6细胞培养上清中Col1和α-SMA含量均增高;且以泡球蚴作用最为明显,Col1和α-SMA含量分别为(4.43±2.23)ng/mL和(285.20±90.67)pg/mL。泡球蚴感染后1～8个月,小鼠肝脏中胶原纤维沉积持续增加;小鼠血清中Col1水平在感染后6个月达最高,为(280.26±23.04)ng/mL;α-SMA水平在感染后8个月达最高,为(33.68±4.45)ng/mL。结论泡球蚴持续感染可促进肝星状细胞体外增殖及小鼠血清中Col1和α-SMA蛋白含量升高,引起小鼠肝脏中胶原纤维沉积增多。泡球蚴感染阶段是引起泡型棘球蚴病肝纤维化的关键期。     

MMP2与细粒棘球蚴感染小鼠肝纤维化研究

目的通过检测细粒棘球蚴感染小鼠肝脏中MMP2及其mRNA表达水平的变化,探讨其在肝纤维化过程中的作用。方法收集感染细粒棘球蚴病羊肝脏,取肝脏囊泡中的原头蚴处理后接种实验组小鼠肝脏,建立细粒棘球蚴病动物模型。于感染后2、8、30、90和180d各取8只小鼠处死,无菌收集肝脏,采用RT-PCR检测MMP2mRNA,采用免疫组织化学法检测MMP2在肝脏中的表达。实验设假手术对照组。结果与对照组比较,实验组小鼠肝脏MMP2mRNA水平在感染后2d达高峰(t2d=6.566,P0.01),总体呈现早期高表达,晚期下降的趋势。免疫组化检查实验小鼠肝脏MMP2表达趋势与RT-PCR的结果一致。结论小鼠感染细粒棘球蚴早期肝脏MMP2高表达,中、晚期低表达,这可能是导致细粒棘球蚴小鼠发生肝脏纤维化的机制之一。     

泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8+ T细胞免疫功能耗竭的影响

目的　观察不同时间、不同剂量泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8+ T细胞免疫功能耗竭的影响。方法　采集泡球蚴原头蚴虫体,经肝门静脉建立低（50个原头蚴）、中（500个原头蚴）和高剂量（2 000个原头蚴）泡球蚴感染小鼠模型,并设生理盐水对照组。于感染后早（2周）、中（12周）、晚期（24周）分别取小鼠脾脏,研磨分离淋巴细胞。流式细胞术检测不同实验组小鼠脾脏中记忆性CD8+ T细胞表型、免疫抑制性分子2B4表达水平,及其分泌γ?干扰素（IFN?γ）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、白细胞介素?17A（IL?17A）和IL?10的能力。结果　在感染早期,高剂量泡球蚴感染诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞以中心记忆性表型为主,其比例为（35.50 ± 2.00）%,显著高于对照组（25.90% ± 2.46%）（P < 0.01）;在感染晚期,中、高剂量泡球蚴感染均诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞以效应记忆性表型为主,其比例分别为（25.70 ± 4.12）%和（28.40 ± 4.12）%,均显著高于对照组（10.50% ± 6.45%）（P均 < 0.05）。高剂量泡球蚴感染中期和晚期,中心记忆性CD8+ T细胞比例显著低于感染早期（P均 < 0.01）;高剂量泡球蚴感染晚期,效应记忆性CD8+ T细胞比例显著高于感染早期和中期（P均< 0.05）。低、中剂量泡球蚴感染早期,脾脏CD8+ T细胞分泌IFN?γ和IL?17A能力显著增强,而高剂量泡球蚴感染虽然促进小鼠脾脏CD8+ T细胞分泌IFN?γ和TNF?α能力,但感染晚期其分泌IFN?γ和TNF?α能力显著低于早期和中期（P均< 0.05）。此外,中、高剂量泡球蚴感染晚期小鼠脾脏CD8+ T细胞表面免疫抑制性分子2B4呈高表达,其比例分别为（4.73 ± 1.56）%和（4.94 ± 1.90）%,均显著高于低剂量组（2.49% ± 0.58%）和对照组（2.92% ± 0.60%）（P 均< 0.05）。结论　在低、中剂量泡球蚴感染中期和晚期,机体利用自身免疫应答能力对虫体起到杀伤和清除;而高剂量泡球蚴感染晚期可诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞上调2B4分子表达,导致免疫耗竭,造成慢性寄生。     

泡球蚴感染对宿主肝细胞增殖影响的初步研究

目的 探讨泡球蚴感染对宿主肝细胞增殖和细胞周期的影响.方法 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和假手术组.分别于感染后2、8、30、60、90d采集小鼠肝脏标本.观察小鼠肝脏病理改变.检测泡球蚴感染不同阶段的增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白(cyclins)表达的动态变化及其定位.组间数据比较采用t检验.结果 随着泡球蚴持续感染,实验组病灶与肝细胞交界区出现炎性细胞浸润、脂肪变性和纤维结缔组织增生等病理变化,感染早期(2、8、30 d)病灶周围肝细胞存在细胞核增大、双核或多核细胞增多等现象.感染30、60、90 d,实验组PCNA表达呈上升趋势,阳性率明显高于假手术组(7.01％±1.89％与1.03％±0.52％、8.41％±2.80％与0.93％±0.31％、13.40％±4.43％与1.07％ ±0.94％,t值分别为-6.817,-5.931,-6.102,P值均＜0.05).感染30d和60d时,实验组cyclin D1表达上升,阳性率明显高于假手术组(6.73％±2.52％与0.48％±0.43％、8.22％±3.09％与0.55％±0.34％,t值分别为-5.479,-5.504,P值均＜ 0.05);感染90d时,cyclin D1呈下降的趋势(从“+++”降至“+”).感染30、60、90d时,实验组cyclin A阳性率明显高于假手术组(7.75％±3.05％与0.69％±0.36％、3.42％±1.80％与1.14％±0.42％、3.03％±1.50％与0.69％±0.31％,t值分别为-5.131,-2.774,-3.415,P值均＜ 0.05).感染2、8、30d时,实验组cyclin B1表达呈上升趋势(从“+”升至“++”),感染60、90 d时,cyclin B1表达呈下降趋势(从“++”降至“+”).结论 体内泡球蚴感染促进宿主肝细胞的增殖和抗凋亡,并对其细胞周期产生影响.     

细粒棘球绦虫微囊对小鼠腹腔巨噬细胞活化及炎症因子水平的影响

目的探索细粒棘球绦虫微囊感染对小鼠腹腔不同表型巨噬细胞活化及腹腔灌洗液中炎症因子水平的影响。方法体外培养细粒棘球绦虫原头蚴形成微囊,通过腹腔注射微囊和原头蚴,分别建立BALB/c小鼠细粒棘球蚴继发感染模型,对照组小鼠腹腔注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。于感染后的第8、30、60、90、180、240 d,收集各组小鼠的腹腔灌洗液和腹腔细胞,流式细胞术检测F4/80~+ CD16/32~+(M1型)与F4/80~+ CD206~+(M2型)巨噬细胞比例变化,流式细胞微球阵列法(Cytometric Bead Array, CBA)检测6种炎症因子IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-10、IL-6水平。结果感染后240 d,微囊感染组(微囊组)存活囊泡和囊团数分别为(237.67±4.5)、(10.33±1.21)个,与原头蚴感染组(原头蚴组)的囊泡和囊团数(70.33±3.5)、(7.17±1.17)个比较差异有统计学意义(均P0.01)。微囊组和原头蚴组小鼠腹腔M1型巨噬细胞比例均在感染早期开始升高,8～30 d逐渐升高达峰值,后逐渐下降,在240 d有一定程度回升。感染后30、60、90、180 d,微囊组M1型巨噬细胞比例分别为(78.6±7.52)、(72.95±3.07)、(63.33±3.89)、(28.7±4.84)%,与原头蚴组(66.30±3.47)、(64.03±2.67)、(47.42±2.46)、(18.00±6.77)%比较差异有统计学意义(均P0.05)。而微囊组和原头蚴组的M2型巨噬细胞细胞比例均在感染早期第8 d处于较高水平,8 d后下降但在感染晚期90～240 d持续升高。感染后8、30、180和240 d,微囊组M2型巨噬细胞比例分别为(60.24±1.35)、(78.6±7.52)、(28.7±4.84)、(51.93±9.49)%,与原头蚴组(56.70±4.25)、(66.30±3.47)、(18.00±6.77)、(43.92±2.66)%比较差异有统计学意义(均P0.05)。CBA显示,微囊组和原头蚴组腹腔灌洗液中促炎因子IL-12p70和TNF的水平均在8～90 d升高,90 d后下降,其中8、30、60和90 d,微囊组IL-12p70和TNF水平均与原头蚴组比较差异有统计学意义(均P0.01)。微囊组和原头蚴组促炎因子MCP-1、IL-6均在8～180 d升高,180 d后降低,其中8、30、60、90和180 d,微囊组MCP-1和IL-6水平与原头蚴组比较差异均有统计学意义(均P0.01)。微囊组IL-6水平在感染晚期240 d下降为(503.89±97.62)pg/ml,但仍与原头蚴组比较差异有统计学意义(179.34±30.31)pg/ml(P0.01)。微囊组IFN-γ水平在感染早期在8、30 d分别为(25.34±1.94)、(25.90±1.71)pg/mL,与原头蚴组(21.32±3.15)、(21.22±2.46)pg/ml比较差异有统计学意义(均P0.05),但在30 d后下降,而原头蚴组IFN-γ水平升高至90 d出现峰值为(38.16±3.13)pg/ml,与微囊组(20.22±2.08)pg/ml比较差异有统计学意义(P0.01)。抑炎因子IL-10水平变化缓慢,增长至90 d达峰值后下降,其中8、30、60、90、240 d时两感染组比较差异无统计学意义(均P0.05)。结论微囊感染在棘球蚴继发感染寄生虫免疫逃避及宿主早期腹膜炎症反应中发挥重要作用,导致M1型巨噬细胞比例及促炎细胞因子水平表达较原头蚴感染更显著。