乙脑/寨卡嵌合病毒感染性克隆构建及病毒拯救北大核心CSCD

目的构建乙脑/寨卡嵌合病毒感染性克隆并拯救嵌合病毒。方法通过分子克隆技术将寨卡病毒prM/E基因克隆到乙脑病毒疫苗株SA-14-14-2感染性克隆的KasI和BglⅡ位点,构建乙脑/寨卡嵌合病毒感染性克隆,体外转录嵌合病毒RNA,再将RNA电转染BHK21细胞拯救病毒,并用免疫荧光技术、测序和噬斑试验进行鉴定,通过动物试验初步鉴定嵌合病毒的神经毒力。结果感染性克隆质粒可被相应限制性内切酶切下与理论值相吻合的核酸片段(1.1、0.7、0.4bp);拯救的病毒可在BHK21细胞形成噬斑,能被寨卡病毒抗血清识别;测序表明嵌合病毒含有寨卡病毒的prM/E基因。用嵌合病毒攻击小鼠,显示具有神经毒力,接种后14d小鼠全部死亡。结论成功拯救乙脑/寨卡嵌合病毒。该嵌合病毒对小鼠有较强的神经毒力,为寨卡病毒疫苗研发提供一种新的思路。     

寨卡病毒包膜蛋白Y158H突变对乙脑/寨卡嵌合病毒感染小鼠脑内神经毒力的影响

目的研究乙脑/寨卡嵌合病毒(Japanese encephalitis/Zika chimeric virus, JE/ZIKV)包膜蛋白(envelope protein, E蛋白)第158位氨基酸Y158H突变对感染小鼠脑内神经毒力的影响。方法运用重叠延伸PCR技术和基因克隆技术构建含Y158H突变全长cDNA的质粒,单酶切形成线性化DNA分子后体外转录获得RNA,电转染BHK21细胞完成重组病毒包装。通过病毒基因测序、间接免疫荧光试验、生长曲线及蚀斑试验鉴定病毒,通过动物试验评价病毒的小鼠脑内神经毒力。结果基因测序和酶切证实,成功构建含突变位点Y158H全长cDNA质粒。蚀斑试验和病毒基因测序、间接免疫荧光试验证实成功完成病毒的拯救,JE/ZIKV蚀斑直径(1.7±0.2)mm, JE/ZIKV(Y158H)蚀斑直径(1.6±0.1)mm,两种病毒的蚀斑大小差异无统计学意义(P0.05)。两种病毒增殖规律相似,但整个过程中JE/ZIKV(Y158H)的增殖效率略低于母本病毒。分别用两种病毒进行动物试验,JE/ZIKV(Y158H)的LD_(50)为58.93 PFU/0.03 ml, JE/ZIKV为2.21 PFU/0.03 ml, JE/ZIKV(Y158H)的毒力低于JE/ZIKV。结论 ZIKV E蛋白Y158H位点突变可降低嵌合病毒对小鼠脑内神经毒力,E158是影响E蛋白神经毒力的重要氨基酸之一。     

寨卡病毒E蛋白及第三结构域的原核表达和多克隆抗体制备

目的 在大肠杆菌中克隆表达和纯化寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)包膜糖蛋白(Envelope Protein,E)及第三结构域(Envelope DomainⅢ,EDⅢ),并制备两种免疫原的鼠多克隆抗体。方法 通过Vero-E6细胞培养扩增ZIKV,提取病毒总RNA并反转录为cDNA,利用E和EDⅢ基因的cDNA序列构建原核表达载体pET32a/E和pET28a/EDⅢ,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni⁺柱亲和层析法纯化蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清,间接ELISA法测定效价,Western Blot检测特异性。结果 成功表达并纯化重组蛋白E和EDⅢ,获得的多克隆抗体效价均达到1:409 600,Western Blot检测多克隆抗体可特异性识别重组E蛋白和EDⅢ以及天然E蛋白。结论 成功制备出特异性抗寨卡病毒E蛋白和EDⅢ的鼠源多克隆抗体,为深入探索寨卡病毒致病机制、检测方法和免疫策略奠定了研究基础。     

猪源Pdm/09 H1N1甲流NA定点突变拯救毒株的生物特性研究北大核心CSCD

目的利用定点突变技术突变Pdm/09 H1N1流感病毒的NA基因119位点并拯救,研究其生物特性。方法利用重叠PCR的方法进行定点突变,再应用反向遗传学体系中的pBD-NA质粒后在293T细胞中转染拯救流感病毒,通过血凝试验和RT-PCR方法鉴定病毒拯救结果,通过细胞学和攻毒试验研究该位点变异的生物学意义。结果定点突变测序结果显示,突变的pBD-NA质粒核苷酸第336位由A突变为G,使氨基酸位点发生E(核苷酸:GAA)到G(核苷酸:GGA)的变化,而其他位置的氨基酸均未发生改变。拯救的病毒转染后的细胞悬液接种MDCK细胞连续传代3代后突变毒株(rMT)血凝效价为27,亲本毒株(rWT)为26。神经氨酸酶的二级结构预测结果显示,rMT与rWT相比,Alpha Helix分值明显下降,均值同比下降约为10.62%,经突变后的rMT Alpha Helix结构分值表现为下降趋势。用rWT和rMT病毒攻毒BABL/c小鼠后第3天的小鼠肺组织、鼻甲骨、脾和肾的病毒滴度,rMT攻毒组均比rWT攻毒组高,鼻甲组织与肺脏中的病毒滴度相比差异不显著,脾和肾的差异显著。结论NA119位点的定点突变对病毒的复制能力没有明显影响,突变株对BABL/c小鼠的致病力有一定增强,临床症状明显,神经氨酸酶活性下降。     

血细胞凝聚素和神经氨酸酶协同突变对甲型H1N1流行性感冒病毒特性的影响

甲型H1N1流行性感冒(以下简称流感)病毒为主要流行的流感病毒亚型,极易发生突变。血细胞凝聚素和神经氨酸酶是流感病毒表面两种重要的膜蛋白,相应的基因突变会导致这两种蛋白质发生变异,对流感病毒的复制能力、病毒毒力、神经氨酸酶活性、耐药性和免疫逃逸特性的改变起关键作用。甲型H1N1流感病毒特性的改变可能会对公共卫生产生重大...     

结核分枝杆菌H37Ra感染对小鼠T细胞及Th1/Th2反应的影响北大核心CSCD

目的探讨结核分枝杆菌H37Ra菌株(H37Ra)感染对BALB/c小鼠T细胞及Th1/Th2反应的影响。方法建立H37Ra菌株BALB/c小鼠感染模型,设生理盐水(NS)处理小鼠作为对照组。在感染早期(4周)和晚期(8周)分别取小鼠脾脏细胞及淋巴结细胞,或培养后的细胞,经荧光抗体染色后采用流式细胞术对不同感染时期小鼠的T细胞表型进行检测分析。结果实验组小鼠感染H37Ra 4周时与对照组比较,脾脏总T细胞(CD3^+)、CD4^+T细胞百分率(CD3^+CD4^+CD8^-)降低((43.03±5.57)%,t=5.804,P=0.000;(47.76±6.22)%,t=2.327,P=0.042),CD8^+T细胞百分率(CD3^+CD4^-CD8^+)增高((47.72±4.39)%,t=-3.698,P=0.004);与感染4周时比较,感染8周时脾脏总T细胞、CD4^+T细胞百分率增高((68.23±4.38)%,t=-8.712,P=0.000;(57.89±4.93)%,t=-3.125,P=0.011),CD8^+T细胞百分率降低((39.23±3.80)%,t=3.585,P=0.005),且晚期时恢复至正常。H37Ra感染4周和8周时与对照组比较,H37Ra感染对小鼠淋巴结总T细胞(CD90.2^+)及T细胞亚群(CD4^+T细胞及CD8^+T细胞)分布无显著影响(P>0.05)。H37Ra感染晚期,与对照组比较,IFN-γ表达升高(加培养液而无TB-PPD组:(7.50±1.60)%,t=-4.173,P=0.002;加入PPD组:(6.80±1.36)%,t=-5.014,P=0.001)。结论 H37Ra感染可影响T淋巴细胞及亚群的分布,并出现Th1反应而未见明显Th2反应,促进了机体的抗结核感染作用。     

丙戊酸钠对APP/PS1转基因小鼠脑内海马区老年斑形成的影响

目的研究丙戊酸钠(VPA)对APP/PS1转基因小鼠脑内海马区老年斑(SP)形成的影响。方法 APP/PS1转基因小鼠随机分为对照组和VPA治疗组,VPA治疗后应用免疫组化技术检测APP/PS1转基因小鼠脑内海马区SP的数量及大小。ELISA测定脑组织β淀粉样蛋白(Aβ)的含量变化。结果 VPA治疗组小鼠海马区域出现的阳性SP数目与对照组相比分别显著减少65%,斑块沉积也分别由0.65%降到0.22%(P0.01)。ELISA结果显示,VPA治疗组小鼠脑内可溶性Aβ的水平(75 pg/mg)较对照组明显下降(92 pg/ml,P0.05)。结论 VPA可以减少APP/PS1转基因小鼠脑内SP的形成,抑制Aβ的生成。     

链脲佐菌素诱导的胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化的影响

目的观察链脲佐菌素(STZ)诱导的胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化的影响。方法采用3月龄APP/PS1转基因小鼠,腹腔内注射STZ,诱导产生胰岛素缺乏的阿尔茨海默病(AD)小鼠动物模型。应用免疫组织化学和Western印迹技术检测AD小鼠脑内tau蛋白的磷酸化。结果 Western印迹结果显示,STZ诱导的胰岛素缺乏使AD小鼠脑内Thr231和Ser396位点上的tau蛋白磷酸化表达水平增高;免疫组化染色显示,胰岛素缺乏的AD小鼠大脑皮层神经元内Thr489位点上的tau蛋白磷酸化表达明显高于对照组。结论 STZ诱导的胰岛素缺乏可加剧APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白异常磷酸化。     

胰岛素样生长因子-1对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ_(1-40)沉积的影响

目的以SPF级APP/PS1双转基因小鼠(22周)为阿尔茨海默病(AD)动物模型,皮下注射胰岛素样生长因子-1(IGF-1),观察其对AD模型小鼠脑内淀粉样蛋白(Aβ1-40)表达的影响。方法将APP/PS1双转基因小鼠及隐性基因小鼠分为4组,设立隐性基因组、隐性基因治疗组、转基因组及转基因治疗组。隐性基因治疗组、转基因治疗组分别皮下注射IGF-1[50μg/(kg·d)],共8周。随后,各组行免疫组化方法观察小鼠脑内Aβ1-40的表达。结果转基因组及转基因治疗组可见神经元缺失。同转基因组比较,无论是皮质区还是海马区,转基因治疗组脑内Aβ1-40的表达均明显减少(P0.05)。结论 IGF-1有降低APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ1-40表达的作用,具有阻断和延缓AD模型脑内老年斑形成的作用,尤其是对皮质区的Aβ1-40表达的阻断更为明显。