SSc患者外周血外泌体通过microRNA-21介导成纤维细胞活化

目的比较系统性硬皮病患者(systemic sclerosis,SSc)与正常人外周血外泌体(exosome)中microRNA-21-5p(miR-21-5p)的表达差异,评估外周血中外泌体对人皮肤成纤维细胞功能状态的影响。方法提取SSc患者及正常人外周血外泌体,荧光定量PCR法检测miR-21-5p表达情况;外泌体刺激人皮肤成纤维细胞,CCK-8法检测细胞增殖能力,免疫印迹检测CollagenⅠ,Ⅲ及平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平。结果 SSc患者外周血外泌体中miR-21-5p显著高于正常人。与正常人相比,患者外泌体可明显增强人皮肤成纤维细胞的增殖能力及上调CollagenⅠ,Ⅲ,α-SMA的水平,上述作用可被转染miR-21-5p抑制剂阻断。结论 SSc患者循环外泌体通过转运miR-21-5p介导人皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。miR-21-5p可能是SSc潜在的生物标记物。     

低氧对系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的 研究低氧对系统性硬化病(SSc)患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成及胶原基因表达的影响。方法 分别以5例SSc患者和5例正常人皮肤成纤维细胞系作为实验对象。将成纤维细胞分别放入20%正常氧和2%低氧分压环境中培养,用分光光度仪测定细胞培养基上清液中羟脯氨酸含量,并折算成胶原蛋白含量。用Trizol提取细胞总RNA,用RT-PCR方法测定其中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果 培养至第6天,低氧分压条件下,SSc患者皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量比正常氧分压条件下显著增加(t=3.97,P=0.0041);正常人皮肤成纤维细胞培养基中胶原蛋白含量此时也显著增加(t=2.63,P=0.0302)。培养至第3天,低氧分压条件下,SSc成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=5.81,P=0.0004;Ⅲ型:t=6.44,P=0.0002);正常人皮肤成纤维细胞此时的Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达量与SSc患者相似,低氧分压条件下比正常氧分压条件下均有显著增加(Ⅰ型:t=4.40,P=0.0023;Ⅲ型:t=2.24,P=0.0453)。结论 低氧状态下,SSc患者和正常人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成均有增加,Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达也均增加.低氧可能是皮肤硬化的一个相关因素。     

系统性硬皮病患者皮肤克隆成纤维细胞胶原代谢的异质性

目的在克隆水平上研究系统性硬皮病(SSc)和正常皮肤成纤维细胞(FB)胶原代谢异质性的特点。方法以皮肤克隆FB作为研究对象,采用实时荧光定量RT-PCR法检测其Ⅰ,Ⅲ型前胶原和基质金属蛋白酶(MMP-1,MMP-3)mRNA水平;采用酶联免疫吸附法检测其细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白的表达,筛选出具有不同胶原合成能力的异质性克隆,分析其胶原代谢的特点。结果 SSc和正常皮肤克隆FB的胶原代谢均具有异质性,SSc患者克隆FBⅠ,Ⅲ型前胶原mRNA水平的异质性较正常人大(F=20.540,P=0.000;F=6.822,P=0.012),SSc患者Ⅰ型前胶原mRNA高表达克隆的比例高于正常人(48.0%vs14.3%);SSc和正常皮肤克隆FB细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白水平与其mRNA水平均存在正相关关系(r=0.873,P=0.000;r=0.538,P=0.039)。结论 SSc和正常皮肤克隆FB的胶原代谢均具有异质性。     

人真皮网状层成纤维细胞在瘢痕疙瘩皮损组织中的表达与分布

【摘要】 目的 探讨人真皮乳头层成纤维细胞（Fp）、网状层成纤维细胞（Fr）和肌成纤维细胞（MFB）在瘢痕疙瘩皮损组织中的表达与分布。方法 2019年5 - 12月在武汉大学人民医院皮肤科门诊确诊的15例瘢痕疙瘩患者,男8例,女7例,年龄20 ~ 50岁,取皮损组织,以15例年龄匹配的女性乳房整形术正常皮肤组织为对照。采用双重免疫荧光染色法检测成纤维细胞活化蛋白（FAP）、CD90和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的分布。从3例正常皮肤和3例瘢痕疙瘩组织中分离成纤维细胞原代培养,采用10 ng/ml 转化生长因子β1（TGF-β1）体外处理两组细胞0 ~ 48 h,观察细胞表型的变化,荧光定量RT-PCR和Western印迹检测FAP、CD90和α-SMA mRNA和蛋白表达。两组间差异比较采用t检验。结果 免疫荧光结果显示,正常皮肤组织中,FAP+/CD90-细胞主要分布在真皮浅层,FAP-/CD90+细胞集中在真皮深层,CD90+细胞几乎不表达α-SMA;瘢痕疙瘩组织深层可见大量FAP+和CD90+细胞,大量CD90+细胞同时表达α-SMA。双重免疫荧光染色显示,正常皮肤成纤维细胞几乎不表达α-SMA,瘢痕疙瘩成纤维细胞表达α-SMA;TGF-β1处理24 h时,正常成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞α-SMA+细胞荧光强度（21.058 ± 0.709、27.112 ± 0.097）均高于未处理组（11.312 ± 0.636、21.306 ± 0.464）,t值为22.430、13.370,P < 0.05。RT-PCR和Western印迹显示,TGF-β1处理48 h时,瘢痕疙瘩成纤维细胞FAP、CD90、α-SMA mRNA相对表达水平（92.610 ± 3.667、1.366 ± 0.105、3.240 ± 0.141）与蛋白表达水平（0.652 ± 0.073、1.046 ± 0.119、0.946 ± 0.117）均高于处理前（均P < 0.05）。结论 瘢痕疙瘩组织真皮深层的CD90+（Fr）细胞异常增生,提示针对真皮深层异常增殖活跃的FAP-/CD90+（Fr）细胞群进行定向干预可能提高瘢痕疙瘩治疗疗效。     

活血化瘀中药对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞胶原合成的影响

目的研究活血化瘀中药对系统性硬皮病(SSc)患者皮肤成纤维细胞胶原合成的影响.方法以组织块培养法建立3个SSc患者皮肤成纤维细胞株.将活血化瘀中药加入成纤维细胞培养液,其浓度分别为5g/L、2.5g/L和1.25g/L,于加药后第3、6 d,以分光光度法测定细胞培养上清液中羟脯氨酸浓度并折算成胶原浓度.结果积雪草和丹参在5g/L、2.5g/L及1.25g/L浓度下于作用第3 d和第6 d时能显著抑制SSc患者皮肤成纤维细胞的胶原合成(P＜0.05～0.01),红花在5 g/L、2.5g/L及1.25 g/L浓度下于作用第3 d和第6 d时能显著促进SSc患者皮肤成纤维细胞的胶原合成(P＜0.05).此外,当归在5g/L、茜草在2.5g/L浓度下于作用第6 d时也能显著抑制SSc患者皮肤成纤维细胞合成胶原(P＜0.05).结论不同的活血化瘀中药对皮肤成纤维细胞胶原合成的作用不一,该结果可为临床制定治疗SSc及其他相关疾病的中药方剂提供参考.     

阿维A对系统性硬皮病成纤维细胞胶原合成及Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响

目的:明确阿维A对系统性硬皮病成纤维细胞胶原合成及Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响。方法:原代培养系统性硬皮病(SSc)患者皮肤成纤维细胞(FB),使用不同浓度的阿维A(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)mol/L)作用48 h,用羟脯氨酸法测定胶原的质量浓度,RT-PCR法Ⅰ型前胶原mRNA的表达。结果:阿维A实验组FB胶原合成及I型前胶原mRNA的表达较对照组减少,且均与阿维A呈浓度依赖性关系。结论:阿维A可能通过抑制FBⅠ型前胶原基因的表达减少胶原合成。     

MicroRNA-21对瘢痕疙瘩成纤维细胞mTOR信号通路的调控作用研究

目的:探讨MicroRNA(miR)-21对瘢痕疙瘩成纤维细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的调控作用及机制。方法:应用miR-21抑制物(inhibitor)及阴性对照(NC)序列转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后,反转录(RT)-PCR检测miR-21及10号染色体张力缺失蛋白磷酸酶(PTEN)mRNA表达水平;western blot检测m TOR信号通路关键分子PTEN、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶BPKB(p-Akt,又称Akt)及p-mTOR蛋白的表达。生物信息学方法预测miR-21与PTEN mRNA 3′-UTR结合位点,并用双萤光素酶报告基因验证miR-21对PTEN m RNA的靶向作用;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。结果:miR-21能够靶向调控PTEN m RNA表达,抑制miR-21表达可导致PTEN的m RNA和蛋白表达增加,进而抑制p-Akt及p-mTOR蛋白的表达,从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。结论:miR-21可通过靶基因PTEN调控瘢痕疙瘩成纤维细胞mTOR信号通路关键分子p-Akt和p-mTOR的表达。     

半边旗5F对系统性硬皮病患者成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的 研究中草药半边旗5F对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞的作用,以期找到治疗该病的新的有效药物。方法 用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法和光度检测法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定半边旗5F对成纤维细胞增殖和培养基中的胶原含量以及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响。结果 半边旗5F对患者皮肤成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用,还能显著降低该细胞培养基中可溶性胶原的含量(P<0.01)。上述抑制作用随着药物浓度的增高和作用时间的延长而增强。采用RT-PCR法对Ⅰ、Ⅲ型前胶原的mRNA检测显示随着药物浓度的增高二者的表达量降低。结论 半边旗5F对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞的增殖和胶原合成具有显著的抑制作用,为寻找有效治疗该病的药物提供了新的启示。     

脐带间充质干细胞外泌体对急性皮肤创面愈合的初步研究

目的:探讨脐带间充质干细胞（ucMSC）外泌体对急性皮肤创面愈合的影响。方法:用超高速离心法提取ucMSC外泌体,经透射电镜观察、Western印迹检测外泌体表面标志物CD63和TSG101和粒径分析鉴定外泌体。体外培养3~5代人皮肤成纤维细胞（HSF）,分别用含0（阴性对照组）、1、2 μg/ml外泌体的高糖DMEM...     

辛伐他汀对体外培养系统性硬皮病患者的成纤维细胞增殖和胶原表达的影响

目的探讨辛伐他汀对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞增殖、胶原分泌和Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响。方法原代培养系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞,检测不同浓度的辛伐他汀作用于体外培养的成纤维细胞48h后细胞的存活力;观察不同浓度的辛伐他汀对细胞胶原分泌和Ⅰ型前胶原mRNA合成的影响。结果1.0×10-7,10-6,10-5和10-4mol/L浓度的辛伐他汀可以抑制患者皮肤成纤维细胞的增殖(P<0.05),并能显著减少成纤维细胞培养液中可溶性胶原的含量,与空白对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05),且抑制作用随着药物浓度的增高而增强,具有明显的浓度依赖性。1.0×10-7～10-4mol/L的辛伐他汀可以显著的减少Ⅰ型前胶原蛋白mRNA的表达(P<0.05)。结论辛伐他汀对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞的增殖及胶原的分泌均有显著的抑制作用,对细胞Ⅰ型前胶原蛋白mRNA的合成具有抑制作用,其为治疗硬皮病提供了理论基础。     

miR-186-5p通过抑制Twist1诱导人皮肤成纤维细胞衰老

目的 探讨miR-186-5p对人皮肤成纤维细胞衰老的影响及其机制.方法 采用实时定量PCR方法检测miR-186-5p的表达,应用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色、CCK-8和EdU等方法研究miR-186-5p对人真皮成纤维细胞(HDFs)衰老的作用.通过生物信息学分析、荧光素酶报告试验、实时定量PC...     

4种microRNAs在寻常型银屑病患者外周血中的表达

目的:研究寻常型银屑病患者外周血中miR-30e-5p、miR-192-5p、miR-17-3p、miR-1227-5p的表达情况。方法:采用实时荧光定量PCR技术检测60例寻常型银屑病患者和6例正常人外周血中的4种miRNAs表达,并对患者进行PASI评分,采用spearman检验分析4种miRNAs表达量与银屑病PASI评分的相关性。结果:与正常人比较,寻常型银屑病患者外周血中miR-30e-5p、miR-192-5p、miR-17-3p、miR-1227-5p表达下调,下调程度与PASI评分呈负相关(r值均0,P值均0.05)。结论:4种miRNAs可能可作为银屑病患者潜在外周血生物标志物,其表达量可用于评价银屑病病情严重程度。     

SLE肾脏细胞转分化为肌成纤维细胞在LN肾损伤中的病理作用

目的通过免疫组化的方法研究狼疮肾炎肾活检组织中α-SMA（α-平滑肌动蛋白）的表达，从而探讨细胞转分化为肌成纤维细胞，表达α-SMA在LN肾组织损伤中的作用。方法采用免疫组化的方法对26例狼疮肾炎患者肾活检组织中α-SMA的表达水平，并与5例正常肾组织比较。结论细胞转分化为肌成纤维细胞，表达α-SMA在狼疮肾炎的发展及肾损伤进入慢性化、纤维化阶段起重要作用。     

Nrf2信号通路调控自噬对UVA诱导人真皮成纤维细胞凋亡的作用

目的 探讨Nrf2信号通路介导的细胞自噬在UVA诱导人皮肤成纤维细胞凋亡过程中的作用。方法 体外培养正常人皮肤成纤维细胞，分为对照组、UVA组、自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin, RAPA)组、自噬抑制3-甲基嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)组、核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)组及干涉(siRNA)组；各实验组经8 J/cm²的UVA照射；采用流式细胞术检测成纤维细胞凋亡；CCK-8检测细胞活性变化；Western blot检测细胞自噬及凋亡关键分子、p62及Nrf2蛋白表达水平。结果 经8 J/cm²的UVA照射后成纤维细胞凋亡比例增加、胞内自噬水平显著升高；自噬抑制剂3-MA处理后可显著促进UVA照射引起的成纤维细胞凋亡；而自噬促进剂RAPA处理细胞后，细胞凋亡率较UVA组相比显著降低(P<0.01);与对照组相比，UVA照射后胞核Nrf2表达显著增高；ML385阻断Nrf2入核及使用siRNA干涉Nrf2表达后，自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ降低(P<0.01),p62表达显著减少(P&...     

整合素表达对硬皮病成纤维细胞合成原胶原的影响

目的　研究硬皮病成纤维细胞整合素表达对成纤维细胞合成原胶原的影响。方法　运用硫代修饰的整合素反义寡核苷酸阻断硬皮病成纤维细胞表面相应整合素亚基的表达 ,RT PCR检测整合素表达抑制后硬皮病成纤维细胞原胶原mRNA量的变化。结果　反义寡核苷酸能特异抑制硬皮病成纤维细胞相应整合素亚基的表达 ;整合素α5或 β1 亚基表达减少的成纤维细胞 ,原胶原proα1(Ⅰ )、proα1(Ⅲ )mRNA均显著降低。结论　降低硬皮病成纤维细胞整合素的表达 ,可从转录水平抑制成纤维细胞合成原胶原     

人皮肤慢性光老化成纤维细胞环状RNA的差异表达

目的:构建人皮肤慢性光老化成纤维细胞模型,筛查与光老化相关的环状RNA(circRNA)。方法:分离培养成纤维细胞,利用UVA多次照射,制作人皮肤慢性光老化成纤维细胞模型,采用β-半乳糖苷酶染色及Western印迹法检验p21蛋白验证,以给予与照光时长等同的避光处理的成纤维细胞作为对照。采用RNAseq高通量转录组测序技术检测光老化成纤维细胞中circRNA表达,并分析其差异表达的circRNA。结果:与对照组比较,光老化模型组成纤维细胞中表达显著上调的circRNAs共有7个(P0.05);表达显著下调的circRNAs共有4个(P0.05)。经生物信息学分析,差异表达的circRNA可能与胶原蛋白合成等基因有关。结论:光老化模型组成纤维细胞存在多个差异表达的circRNAs,说明circRNA可能参与光老化的基因调控。     

视蛋白3调控人真皮成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白生成

目的 研究视蛋白3在正常人真皮成纤维细胞中对Ⅰ型胶原蛋白生成的影响及其可能的机制。方法 取小儿包皮真皮成纤维细胞分离、培养、传代，至3～5代，用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别检测视蛋白1～5的表达，细胞免疫荧光检测视蛋白3及Ⅰ型胶原蛋白表达及定位。设计针对人视蛋白3的小干扰RNA,利用脂质体转染入正常人真皮成纤维细胞，分别用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹检验视蛋白3抑制效率。成功下调视蛋白3后，用荧光定量PCR、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定及细胞免疫荧光检测Ⅰ型胶原蛋白表达变化；通过CCK-8及EDU检测细胞增殖活力，流式细胞仪检测细胞周期，Transwell检测细胞迁移能力；通过蛋白免疫印迹法检测PI3K、AKT及磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT的表达情况。最后抑制通道蛋白AKT的磷酸化，通过蛋白免疫印迹法检测Ⅰ型胶原蛋白表达变化。结果 视蛋白1～5均在正常人真皮成纤维细胞中表达，其中视蛋白3基因及蛋白表达水平较其他视蛋白表达高，差异有统计学意义(P<0.05)。下调正常人真皮成纤维细胞中视蛋白3后，细胞合成及分泌Ⅰ型胶原蛋白水平降低，差异有统计学意义(P<0.05);...     

跨膜蛋白45A对瘢痕疙瘩成纤维细胞合成细胞外基质的影响

目的研究跨膜蛋白45A(TMEM45A)在瘢痕疙瘩组织及成纤维细胞中的表达, 探讨其对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)细胞外基质(ECM)的影响。方法收集2019年1月至2020年12月期间在延边大学附属医院皮肤科及泌尿外科手术切除的瘢痕疙瘩和正常包皮组织标本, 采用Western印迹法检测瘢痕疙瘩组织及KF中TMEM45A蛋白表达情况。将KF分成两组, 分别通过特异性TMEM45A小干扰RNA(siRNA)和对照siRNA转染, 进而采用Western印迹法检测TMEM45A基因的下调对肌成纤维细胞标志性蛋白(α平滑肌肌动蛋白)及ECM相关蛋白表达的影响。结果与正常皮肤组织(1.00 ± 0.11)及成纤维细胞(1.00 ± 0.20)相比, TMEM45A在瘢痕疙瘩(0.26 ± 0.05)及KF(0.41 ± 0.09)中的表达显著降低(t值分别为10.76、4.75, P值分别<0.001, = 0.009)。TMEM45A特异性siRNA组中α-平滑肌肌动蛋白(t = -5.98, P = 0.004)及ECM蛋白Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白(t值分别为-4.57、-4.90, P值分...     

槌果藤乙醇提取物对体外培养的人皮肤成纤维细胞生长的影响

目的研究槌果藤乙醇提取物对体外培养的人皮肤成纤维细胞生长的影响。方法用四甲基偶氮唑盐比色试验和生长曲线测定法,比较槌果藤乙醇提取物不同作用浓度下对正常人皮肤成纤维细胞体外生长活力和生长状态的影响。结果槌果藤提取物可明显抑制皮肤成纤维细胞的体外增殖,槌果藤乙醇提取物浓度为40μg/mL时,对人成纤维细胞增殖率的抑制作用与药物剂量呈明显的正相关,对正常人皮肤成纤维细胞的生长抑制率与药物的作用时间相依赖。结论中药槌果藤乙醇提取物可抑制体外正常人皮肤成纤维细胞的增殖。     

槲皮素对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响

目的研究槲皮素对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响,探讨其作用机理。方法体外培养瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞,应用羟脯氨酸比色法对不同药物浓度处理后成纤维细胞胶原合成量进行分析;RT-PCR及Real-timePCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ-1基因表达水平。结果槲皮素可抑制体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成,该作用呈剂量依赖效应;槲皮素可降低Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGFβ-1基因mRNA水平。结论槲皮素对于瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成有显著抑制效应,其作用机制之一为通过抑制TGFβ-1基因在转录水平降低了前胶原mRNA水平,因而使成纤维细胞胶原合成减少。