肽聚糖识别蛋白1抗鼠衣原体生殖道感染的初步研究

目的探讨肽聚糖识别蛋白1(peptidoglycan recognition protein 1,PGLYRP-1)抗鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)生殖道感染作用,为衣原体感染性疾病的治疗提供实验依据。方法构建pET-28a(+)/PGLYRP-1原核表达重组体,IPTG诱导表达PGLYRP-1重组蛋白,重组蛋白经Ni~(2+)-NTA纯化后进行Western blot鉴定。将5×10~5包涵体形成单位(IFU)的Cm和不同剂量的PGLYRP-1(50、100、200μg)分别接种于BALB/c小鼠阴道后穹隆,PBS和Cm感染分别作为阴性和阳性对照。收集感染后不同时间(3、7、10、14、21、28、35 d)小鼠生殖道分泌物进行衣原体包涵体计数;第21 d处死小鼠,无菌分离小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,PGLYRP-1刺激后测定IFN-γ含量;第63 d分离小鼠生殖道组织,观察组织病理学变化。结果 PGLYRP-1可降低Cm在小鼠生殖道组织的定植并促进Cm的清除,Cm感染阳性对照组及50、100、200μg PGLYRP-1接种组小鼠生殖道Cm清除时间分别是第35、21、14、10 d; IFN-γ含量分别为(959.6±104.6)、(1 025.4±112.5)、(1 537.8±118.6)、(2131.2±196.7)pg/ml, PBS阴性对照组为(224.0±23.5)pg/ml; 83.3%的小鼠在Cm感染后第63 d存在单侧或双侧输卵管积水现象,PGLYRP-1接种组有22.2%的小鼠存在类似情况。与阳性对照组相比,PGLYRP-1接种组小鼠生殖道组织炎症反应程度显著减轻,且与PGLYRP-1蛋白剂量呈正比(P0.05)。结论 PGLYRP-1具有抗Cm生殖道感染的作用,其作用机制可能与促进IFN-γ表达上调有关。     

IFN-γ抗鹦鹉热衣原体急性感染保护作用研究

目的探讨IFN-γ对鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)的抗感染作用,为进一步阐明机体抗衣原体免疫机制提供参考数据。方法不同浓度的重组人IFN-γ(5ng/mL、25ng/mL和50ng/mL)作用于感染Cps 6BC的HeLa细胞,48h后计数包涵体数量,并观察包涵体形态的改变。2×10~6 IFUs Cps 6BC滴鼻感染C57BL/6J小鼠,于感染前、后24h腹腔内注射10μg重组鼠IFN-γ,观察小鼠体重、活动状态、生存率等一般指标,分别于感染后5d和10d处死小鼠,取肝、肺组织进行HE染色检测其病理变化;并取感染后5d的肺组织,匀浆,计数其中Cps包涵体数量。结果感染48h后,Cps 6BC在5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL重组人IFN-γ处理的HeLa细胞中包涵体数量低于对照组(包涵体数分别为(23.8±5.1)×10~6,(10±3.58)×10~6,(8.0±2.22)×10~6,(43.3±11.05)×10~6,衣原体包涵体形状不规则,体积变小。小鼠实验显示,腹腔注射IFN-γ可明显提高Cps 6BC感染小鼠生存率,并减轻急性临床表现及脏器病变。结论 IFN-γ可发挥早期抗Cps感染的保护作用。     

两种尘螨1类变应原嵌合基因的原核表达及生物活性鉴定

目的原核表达尘螨1类变应原(粉尘螨1类变应原Derf1和户尘螨1类变应原Derp1基因)的嵌合基因R8,并检测其生物活性。方法以含嵌合基因R8的pUCm-T重组质粒为模板,用Derf1的特异性引物进行PCR扩增,产物经酶切后与载体pET28a(+)连接,连接产物转入大肠埃希菌(E.coli)BL21感受态细胞,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测;纯化后的蛋白用ELISA检测其与粉尘螨过敏患者血清(IgE)的结合能力,同时以重组rDer f 1和rDer p 1蛋白作为对照。为检验嵌合蛋白R8的免疫原性,将75只BALB/c小鼠随机均分为5组,分别为PBS组(阴性对照组)、rDer f 1组、rDer p 1组、R8组和哮喘组(阳性对照组)。除PBS组外,其余各组分别于第0、7和14天每鼠腹腔注射(0.1μg/μl)粉尘螨注射液100μl,第21~27天每鼠每天雾化吸入0.5μg/ml粉尘螨注射液悬浊液,30 min/d。rDer f 1组、rDer p 1组和R8组于第25~27天雾化前30 min,分别腹腔注射100μg/ml的rDer f 1、rDer p 1和R8蛋白各200μl进行特异性免疫治疗,PBS组用等量PBS进行腹腔注射和雾化吸入。所有小鼠于第27天雾化吸入后24 h气管切开,用1 ml PBS进行肺泡灌洗,收集肺泡灌洗液(BALF),检测γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的水平。结果 SDS-PAGE结果显示,R8表达产物的蛋白相对分子质量(Mr)约为35 000。ELISA检测结果显示,嵌合蛋白R8与粉尘螨过敏患者血清IgE的结合力为(37.03±12.46)μg/ml,显著低于rDerf 1[(80.44±15.50)μg/ml]和rDer p 1[(90.79±10.38)μg/ml](P<0.01)。动物实验结果显示,R8组IFN-γ水平[(343.43±38.79)pg/ml]与rDerf1组[(322.98±30.36)pg/ml]和rDer p 1组[(314.97±33.89)pg/ml]的相比,差异均无统计学意义(P>0.05);与PBS组[(393.93±50.68)pg/ml]和哮喘组[(208.44±46.11)pg/ml]相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。R8组IL-4水平显著低于其他各组水平(P<0.05或0.01)。结论表达了具有低变应原性和高免疫原性的尘螨1类变应原嵌合基因R8。     

重组蛋白Blo t 21 T特异性免疫治疗哮喘小鼠效果研究

目的探讨热带无爪螨重组蛋白Blo t 21 T特异性免疫治疗哮喘小鼠的效果。方法将30只BALB/c雌性小鼠随机分为对照组、哮喘组和免疫治疗组3组,每组10只。哮喘组和免疫治疗组小鼠分别于第0、7、 14天腹腔注射200μl热带无爪螨变应原粗提液[含蛋白10μg, Al (OH)32 mg],第21天开始,在每天同一时间用热带无爪螨变应原粗提液(蛋白浓度为0.5μg/ml)雾化激发小鼠,连续雾化7 d,每次30 min。免疫治疗组在第25～27天雾化激发前30 min,腹腔注射重组蛋白Blo t 21 T 200μl (含蛋白10μg)。对照组用PBS替代。最后一次雾化24 h后,水合氯醛麻醉小鼠,眼球采血并收集肺泡灌洗液(BALF)和肺组织。刘氏染色法计数BALF中嗜酸粒细胞, ELISA检测BALF中细胞因子白细胞介素4 (IL-4)、 IL-13、 IL-17和γ干扰素(IFN-γ)水平,以及血清中的Ig E和IgG_(2a)抗体水平。制作肺组织病理切片, HE染色观察。多组数据的统计分析采用单因素F检验,两组数据的统计分析采用SNK检验。结果免疫治疗组小鼠BALF中嗜酸粒细胞数量为(1.23±0.35)×105/ml,低于哮喘组的(5.32±1.22)×105/ml (P 0.05); 3组小鼠BALF中嗜酸粒细胞数量差异有统计学意义(P 0.05)。ELISA检测结果显示,免疫治疗组小鼠BALF中IL-4、 IL-13和IL-17水平分别为(70.96±17.62)、(159.20±21.08)和(220.80±25.95) pg/ml,低于哮喘组的(111.96±13.62)、(321.40±31.88)和(425.40±34.83) pg/ml (P 0.05),高于对照组的(12.57±3.62)、(109.62±15.38)和(114.38±18.43) pg/ml (P 0.05);免疫治疗组IFN-γ水平为(316.80±29.12) pg/ml,高于哮喘组和对照组的(72.84±10.10)、(125.60±22.38) pg/ml (P 0.05)。免疫治疗组小鼠血清中IgG_(2a)、 IgE抗体水平分别为(49.73±10.95)、(316.80±29.12)μg/ml,高于哮喘组的(27.30±4.83)、(57.40±15.96)μg/ml (P 0.05)。肺组织HE染色观察显示,哮喘组可见较明显的气管壁增厚,血管黏膜和肺组织周围有较多的炎症细胞浸润;免疫治疗组与哮喘组相比,上述症状减轻,支气管壁增厚减少,炎症细胞和分泌物均较少。结论热带无爪螨重组蛋白Blo t 21 T特异性免疫治疗可以减轻哮喘小鼠症状。     

屋尘螨变应原Der p2 T细胞表位疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果

目的 探讨屋尘螨变应原Der p2的4个T细胞表位融合肽对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果。方法 30只雌性BALB/c小鼠随机分为3组,分别为阴性对照组(PBS组)、阳性对照组(哮喘组)以及Der p2 T细胞融合肽治疗组(Der p2 T组)。用屋尘螨粗提取液致敏小鼠建立哮喘模型,PBS组以PBS缓冲液代替,Der p2 T组分别于小鼠致敏第25~27天雾化致敏前30 min行背部皮下注射相应治疗蛋白。最后一次雾化激发24 h后,收集各组小鼠血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)。采用ELISA法检测小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-13以及血清中屋尘螨粗提取液致敏的特异性IgE、IgG2a抗体水平,并行肺组织切片HE染色。结果 哮喘组小鼠BALF中的嗜酸性粒细胞数量为(5.57±0.64)×10~5个/ml,高于PBS组[(0.50±0.30)×10~5个/ml](P0.01)和Der p2 T组[(3.45±0.36)×10~5个/ml](P0.01)。PBS组、哮喘组、Der p2 T组小鼠BALF中IFN-γ含量分别为(267.00±21.98)、(155.80±20.53)pg/ml和(234.40±24.46)pg/ml;与哮喘组比较,Der p2 T组小鼠BALF中产生了较高的IFN-γ水平(P0.01)。PBS组、哮喘组、Der p2 T组小鼠BALF中IL-4含量分别为(23.40±5.96)、(53.28±8.26)pg/ml和(30.00±5.50)pg/ml;与哮喘组比较,Der p2 T组小鼠BALF中IL-4含量显著降低(P0.01)。与哮喘组[(308.10±28.32)pg/ml]比较,Der p2 T组小鼠BALF中IL-13含量[(174.50±25.99)pg/ml]显著下降(P0.01);PBS组鼠BALF中IL-13含量为(95.99±31.14)pg/ml。肺组织切片显示,Der p2 T组小鼠肺部炎症较哮喘组明显减轻,且炎性细胞浸润显著减少、气道上皮结构重塑。结论 Der p2 T细胞表位融合肽可有效改善哮喘小鼠变态反应性气道及肺部炎症,可作为屋尘螨哮喘患者特异性免疫治疗的候选疫苗。     

粉尘螨Ⅲ类重组变应原致敏的小鼠哮喘模型致敏效果分析

目的 探讨粉尘螨Ⅲ类重组变应原（Der f3）诱导的小鼠哮喘模型的致敏效果。方法 30只6~8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠随机分为PBS组（阴性对照组）、卵清蛋白（OVA）组（阳性对照组）和Der f3组（实验组）,OVA组和Der f3组分别使用OVA和纯化Der f3蛋白于第0、7、14天进行腹腔注射致敏,于第21d开始雾化吸入,连续7d,PBS组则换成PBS进行腹腔注射和雾化吸入。最后一次雾化吸入24h后,分别观察肺组织病理变化、支气管肺泡灌洗液（BALF）中的白细胞计数,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定BALF和脾细胞培养上清中IL-4、IL-2、IL-17和IFN-γ的含量及血清中IgG1、IgE抗体水平变化;结果OVA组和Der f3组小鼠肺部支气管、血管粘膜下及周围肺组织有明显的炎性细胞浸润、支气管上皮细胞部分断裂及脱落,血管壁明显水肿等,而PBS组未见明显病理改变;Der f3组的BALF中白细胞总数[(19.99±1.03)×106个/ml]及嗜酸性粒细胞（EOS）[(1.81±0.07)×106个/ml]计数均明显高于PBS组（P<0.01）;与PBS组相比：BALF中IL-4 [(80.99±9.06) pg/ml]、IL-17 [(209.69±31.86) pg/ml]呈高水平表达（P<0.01）,而IL-2 [(8.29±1.27) pg/ml]和IFN-γ [(55.04±18.85) pg/ml]含量则显著下降（P<0.01）;上述指标在脾细胞培养上清中出现类似的变化。Der f3组血清中IgE [(31.92±2.68) U/ml]、IgG1 [(16.46±4.32) μg/ml]的含量表现为Th2型反应增强趋势;但OVA组和Der f3组间所有指标差异均无统计学意义（P>0.05）;结论 粉尘螨重组Der f3蛋白可成功建立小鼠变态反应性气道及肺部炎症动物模型。     

伯氏疟原虫ANKA株抗哌喹系小鼠模型免疫学分析

目的观察伯氏疟原虫(Plasmodium berghei,Pb)ANKA抗哌喹(PQR)系小鼠模型的免疫学特征方法64只昆明小鼠随机分为3组,A组和C组各16只,B组32只(其中16只用于观察存活天数)。A组B组小鼠分别经腹腔感染伯氏疟原虫ANKA株哌喹敏感系(PbPQS)和抗性系(PbPQR)红内期原虫1×10~7个(200μl血),C组(健康对照组)注射等量生理盐水。每组于感染后4、8、12和16d各取4只小鼠,取尾血制薄血膜镜检,计算红细胞原虫感染率(简称原虫率)。脱颈处死小鼠,无菌取脾制备脾淋巴细胞悬液,用CCK-8法测定各组小鼠脾淋巴细胞经刀豆球蛋白A(ConA)刺激后的增殖反应,用Griess法和ELISA分别测定脾淋巴细胞培养上清中N0含量和γ干扰素(IFN-γ)水平。另取10只昆明小鼠,每鼠腹腔接种PbPQR系原虫约1×10~7个,待原虫率上升后下降,典型的原虫转变为蓝染细胞时,腹腔感染PbPQS系原虫(1×10~6个)进行攻击感染,观察小鼠原虫率和小鼠存活情况。结果 A组小鼠平均存活(9.0±3.0)d,感染后6～12d原虫率均>50%,出现严重贫血。感染后16d,B组小鼠全部存活,原虫率为(26.66±2.54)%。A、B两组小鼠的脾淋巴细胞经Con A刺激后增殖显著,感染后12d,分别为0.65±0.08和0.86±0.20(P<0.01)。脾淋巴细胞培养上清中,N0含量随感染时间延长而上升,感染后12d,A、B和C组分别为(48.80+3.49)、(54.80±2.17)和(7.80±0.71)μmol/L,三者比较差异有统计学意义(P<0.01)、A组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平随感染时间延长而上升,感染后12d达到最高,为(752.20+39.49)pg/ml,B组于感染后8d升至峰值[(855.80±33.65)pg/ml],感染后12d降至(620.20±27.11)pg/ml;感染后8d和12d,A组和B组IFN-γ水平的差异有统计学意义(P<0.01)。用PbPQS系攻击感染PbPQR系小鼠模型后10d,原虫率为(2.44±2.07)%,随之逐渐消失,感染后40d未检出虫体,无小鼠死亡。结论伯氏疟原虫ANKA株哌喹抗性系感染小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、NO水平和IFN-γ含量均显著高于PbANKA株PQS系感染小鼠,可诱导小鼠产生一定保护性免疫反应。     

乳球菌分泌的白介素-12对哮喘小鼠的疗效观察

目的 将小鼠白介素-12基因(mIL-12)通过质粒载体pSEC导入乳酸乳球菌(NZ9000)中,观察mIL-12在细菌中的表达;通过鼻腔免疫来观察mIL-12对小鼠哮喘模型气道炎症及辅助T细胞亚群的影响.方法 将mIL-12连接到pSEC载体上并将其转化到NZ9000中,用乳链菌肽(Nisin)诱导其表达IL-12蛋白质并做鉴定,将菌液离心浓缩后给小鼠滴鼻.BALB/c小鼠50只,随机分为5组,即对照组(A组); PBS组(B组);野生菌组(C组);rIL-12组(D组);工程菌组(E组).除A组外,余各组每鼠在1、7、14 d腹腔注射卵白蛋白OVA(100μg/0.5ml ),在20～26 d雾化吸入2% OVA,每天1次.B、C、E组在1、2、3、14、19、20、21 d分别给予10μl 的PBS,不含质粒载体的野生乳酸菌(约5×108CFU),含IL-12的质粒载体的工程菌(约5×108CFU).D组20、21、22天给3 ng/只重组白介素-12,第28天杀小鼠测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸粒细胞(EOS)个数及白介素-4(IL-4)、干扰素(IFN-γ)水平,肺组织HE染色切片观察病变.结果 mIL-12能够在NZ9000中高效表达并释放到细胞外.A-E组BALF中EOS 的数量分别为(0.51±0.23)×104cell/ml、(21.32±5.71)×104cell/ml、(22.84±6.16)×104cell/ml、(2.15±0.63)×104cell/ml、(2.62±0.73)×104cell/ml;IL-4的含量分别为(68.43±9.08) pg/ml、(332.13±61.36) pg/ml、(324.65±57.27) pg/ml、(121.25±35.55) pg/ml、(114.22±15.70) pg/ml;IFN-γ的含量分别为(110.28±12.19) pg/ml、(56.25±12.08) pg/ml、(70.36±8.27) pg/ml、(166.11±57.12) pg/ml、(171.75±60.90) pg/ml.B和C组的EOS数、IL-4与IFN-γ含量与A组相比有统计学差异(P<0.01);D、E组与B、C组比较有统计学意义(P<0.01).工程菌组小鼠肺组织炎症细胞浸润明显减少,气道上皮损害减轻.结论 mIL-12在乳酸乳球菌中能高效表达;鼻腔应用mIL-12能减少全身应用的副作用,且经济实用并较好地调节Thl/Th2平衡,对小鼠哮喘气道炎症的保护较为理想.     

IL-21调节免疫平衡对大肠癌细胞生长的抑制作用

目的观察大肠癌患者和接种Colon26细胞小鼠的Th1/Th2平衡偏移情况,同时以IL-21调整小鼠Th1/Th2平衡,观察调节细胞免疫平衡对大肠癌的影响。方法随机选取30例大肠癌患者,采用流式细胞仪测定Th1/Th2细胞比值及血清中IFN-γ和IL-4浓度。另于小鼠爪垫内侧皮下接种高分泌IL-21的Colon26/IL-21细胞,对比观察小鼠肿瘤生长情况及对机体免疫平衡状态的影响。结果①30例大肠癌患者和30例正常人Th1/Th2比值分别为0.74±0.27和1.26±0.9;血清IFN-γ浓度的测定值分别为(6.26±1.43)和(9.18±2.31)pg/ml;IL-4浓度的测定值分别为(8.88±1.30)和(5.20±1.71)pg/ml;IFN-γ/IL-4比值的测定值分别为0.70±0.10和1.82±0.35,两者差异明显。②接种Colon26/IL-21细胞组小鼠肿瘤持续生长至16d后逐渐缩小,小鼠血清中IFN-γ浓度明显高于对照组;接种Colon26细胞组小鼠肿瘤持续生长增大,血清中IL-4浓度高于Co-lon26/IL-21细胞组;免疫平衡向细胞免疫方向转变。结论大肠癌患者与正常人相比细胞免疫功能下降,免疫平衡(Th1/Th2平衡)向Th2型偏移;IL-21可以增强Th1型细胞免疫功能,调节Th1/Th2细胞比例,纠正免疫失衡,有效发挥杀灭肿瘤细胞。     

MoPn沙眼衣原体致小鼠生殖道感染模型的初步研究

目的 探讨建立沙眼衣原体(Ct)生殖道感染小鼠模型的接种剂量，观察感染小鼠阴道的排菌规律和小鼠输卵管病交。方法 不同数量的鼠肺炎型沙眼衣原体(MoPn)阴道内接种雌性小鼠，每只小鼠感染后3d及每周取阴道拭子作细胞培养分离病原体，并进行包涵体形成单位(IFU)记数和统计小鼠培养阳性率。观察小鼠输卵管病交并用电镜检测。结果 阴道内接种MoPn可致小鼠感染，取阴道宫颈拭子可分离到Ct，5～6W后停止排菌。实验中发现用10^5 IFU以下Ct阴道内接种，不能使感染组小鼠出现明显发病，而用10^6和10^7 IFU接种小鼠，小鼠出现明显发病，电镜直接观察到Ct存在于输卵管病交组织。结论 阴道接种Ct可逆行感染上生殖道感染，导致小鼠输卵管阻塞和输卵管积水，10^6 IFU是建立上生殖道感染小鼠模型的适合感染IFU。     

自然杀伤细胞在小鼠脑型疟中对CD4~+T细胞亚群的免疫调节作用

目的探讨自然杀伤(NK)细胞在小鼠脑型疟中对CD4~+T细胞亚群的免疫调节作用。方法雌性C57BL/6小鼠随机分为健康对照组、感染组与NK消除组,每组14只。感染组与NK消除组小鼠经腹腔内注射伯氏疟原虫ANKA株(Pb A)感染红细胞1×106个;NK消除组小鼠在感染前1 d和感染后2 d腹腔内注射NK细胞封闭抗体anti-Asialo GM-1, 15μl/只,健康对照组和感染组注射等体积的PBS。感染后3 d起,采集小鼠尾静脉血,血涂片检测原虫血症,记录死亡情况。感染后3 d和5 d,各组剖杀小鼠3只,取脾脏,制备脾细胞悬液,流式细胞术检测脾细胞中Th1型细胞和调节性T细胞(Tregs);体外培养脾细胞,48 h后收集上清,ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10 (IL-10)的水平。感染后6 d,各组取3只小鼠,用伊文思蓝(EB)染液处理后,取脑,体外孵育脑组织,48 h后收集上清,酶标仪检测通过小鼠血脑屏障的EB含量。结果感染组感染后6 d开始出现死亡,并伴有神经症状,8 d全部死亡;NK消除组感染后7 d开始出现死亡,12 d全部死亡。感染后7 d, NK消除组原虫血症为5.2%～10.5%,高于感染组的2.4%～5.0%(P 0.05)。感染后5 d,感染组Th1型细胞的百分率和绝对计数分别为(2.65±0.06)%和(2.09～2.25)×10~6,高于健康对照组[(1.37±0.02)%和(0.41～0.47)×10~6](P 0.01); NK消除组分别为(1.82±0.07)%和(1.48～1.86)×10~6,低于感染组(P 0.01或P 0.05)。感染后3 d和5 d,感染组Tregs的百分率分别为(1.21±0.06)%和(1.70±0.13)%,高于健康对照组[(0.90±0.01)%和(0.91±0.02)%](P 0.01);感染组Tregs的绝对计数分别为(0.63～0.73)×10~6和(1.39～1.62)×10~6,高于健康对照组[(0.27～0.31)×10~6和(0.47～0.56)×10~6](P 0.01); NK消除组Tregs百分率分别为(1.86±0.07)%和(2.15±0.04)%,绝对计数分别为(0.77～0.90)×106和(1.68～2.15)×106,均高于感染组(P 0.01或P 0.05)。感染后3 d和5 d,感染组脾细胞培养上清中的IFN-γ分别为(790.75±84.80)和(989.58±199.59) pg/ml, TNF-α分别为(2 637.47±283.50)和(3 124.58±964.70) pg/ml,均高于健康对照组[(73.69±16.67)和(75.19±15.97) pg/ml、(290.01±187.46)和(290.51±186.76) pg/ml](P 0.01或P 0.05);NK消除组培养上清中的IFN-γ分别为(15.83±4.27)和(266.63±108.62) pg/ml, TNF-α分别为(165.89±71.02)和(842.77±311.94) pg/ml,均低于感染组(P 0.01或P 0.05)。感染后3 d, NK消除组IL-10为(3 588.20±1 436.38) pg/ml,高于感染组[(1 255.77±190.01) pg/ml](P 0.05)。感染后5 d,感染组IL-10为(4 991.36±1 030.89) pg/ml,高于健康对照组[(848.50±501.79) pg/ml](P 0.05); NK消除组为(9 317.95±1 077.89) pg/ml,高于感染组(P 0.05)。感染后6 d,感染组脑组织EB含量为(4.02±0.10)μg/ml,高于健康对照组[(2.09±0.06)μg/ml](P 0.05), NK消除组为(3.14±0.02)μg/ml,低于感染组(P 0.05)。结论NK细胞消除可减弱脑型疟小鼠Th1免疫应答,增强Tregs免疫应答,降低血脑屏障通透性,延长小鼠生存时间。     

白细胞介素-33在过敏性哮喘小鼠体内的变化及作用

目的探讨白细胞介素-33(IL-33)在粉尘螨1类变应原(Der f 1)诱导的过敏性哮喘小鼠中的变化及作用。方法将40只雌性BALB/c小鼠用随机数字表法分为哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和阴性对照组(PBS组),每组10只。哮喘组、免疫治疗组和抑制剂组分别在第0、7和14天腹腔注射100μl粉尘螨变应原提取液(含100μg/ml Der f 1),抑制剂组小鼠同时注射抑制剂(可溶性ST2 100μl,用于抑制IL-33),PBS组注射等量PBS。第21天起,各组小鼠雾化吸入粉尘螨变应原提取液(0.5μg/ml),30 min/次,1次/d,连续7 d。免疫治疗组小鼠第25天起于雾化前0.5 h,分别用200μl的Der f 1蛋白溶液(100μg/ml)腹腔注射进行免疫治疗,PBS组用PBS代替粉尘螨变应原。第27天雾化吸入后24 h处死小鼠,收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和眼球血,并对BALF中嗜酸粒细胞进行计数,制作肺组织病理切片。ELISA法检测BALF中IL-5、IL-13和γ干扰素(IFN-γ)的含量及血清中特异性Ig E和Ig G2a水平。结果除PBS组小鼠外,其他组小鼠自第21天开始出现不同程度的哮喘症状。自第25天开始,免疫治疗组小鼠的哮喘症状开始缓解。哮喘组和PBS组小鼠BALF中嗜酸粒细胞总数分别为(4.41±0.36)×10~5/ml和(0.37±0.08)×10~5/ml,两组差异有统计学意义(t=24.50,P0.01);免疫治疗组和抑制剂组小鼠的嗜酸粒细胞总数分别为(1.43±0.14)×10~5/ml和(2.73±0.33)×10~5/ml,均明显低于哮喘组(F=129.72,P0.01)。ELISA检测结果显示,哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组BALF中IFN-γ的水平分别为(83.06±11.38)、(277.97±22.46)、(175.13±13.41)和(224.77±19.97)pg/ml,免疫治疗组和抑制剂组均明显高于哮喘组(t=17.31,t=11.71,P0.01)。哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组小鼠BALF中IL-5水平分别为(208.64±11.55)、(106.87±11.39)、(140.71±14.58)和(90.15±9.49)pg/ml,哮喘组的水平明显高于其他各组(F=97.19,P0.01)。哮喘组和免疫治疗组BALF中IL-13水平分别为(308.37±13.67)pg/ml和(175.66±11.79)pg/ml,两者差异有统计学意义(P0.01);抑制剂组小鼠的为(221.12±21.08)pg/ml,明显低于哮喘组(t=16.44,P0.01);PBS组为(97.57±18.38)pg/ml。免疫治疗组与哮喘组相比,小鼠肺部炎性症状均减轻,几乎无炎症细胞。抑制剂组小鼠的支气管周围也有嗜酸粒细胞增多症、上皮细胞脱落和支气管上皮细胞肥大,但较哮喘组要减轻许多。血清Ig E抗体水平的检测结果显示,哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组分别为(31.97±3.48)、(12.86±2.22)、(18.43±2.30)和(9.68±1.27)IU/ml,免疫治疗组和抑制剂组均低于哮喘组(t=-7.77,P0.01)。Ig G2a抗体水平的变化和Ig E相反,哮喘组、免疫治疗组和PBS组分别为(26.94±2.96)、(35.06±2.57)和(10.31±1.48)μg/ml,免疫治疗组高于哮喘组(t=6.55,P0.01)。结论 ELISA检测结果表明IL-33/ST2信号通路在小鼠过敏性哮喘中发挥着重要的作用。     

Der p1 T细胞表位融合蛋白对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果

目的探讨重组变应原Der p1 T融合蛋白对屋尘螨粗提液诱导的哮喘小鼠特异性免疫治疗的效果。方法将30只雌性BALB/c小鼠随机均分为3组,分别为对照组、哮喘组和Der p1 T融合蛋白免疫治疗组(SIT组)。哮喘组和SIT组小鼠分别在第0、7、14天给予腹腔注射屋尘螨粗提液200μl/鼠(蛋白含量10μg/200μl),对照组小鼠注射等量PBS。哮喘组、SIT组小鼠于第21天采用屋尘螨粗提液雾化激发(蛋白浓度为0.5μg/ml),30 min/d,连续7 d,观察并记录小鼠哮喘发作情况,对照组使用等量PBS雾化激发。SIT组小鼠于第21天雾化前0.5 h,腹腔注射Der p1 T融合蛋白(100μg/ml) 200μl进行特异性免疫治疗,连续7d,对照组、哮喘组注射等量PBS。各组小鼠于末次雾化激发后24 h内取眼球血,收集血清,气管插管收集肺泡灌洗液(BALF),ELISA检测血清中特异性IgE和IgG2a抗体水平及BALF中细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4 (IL-4)、IL-10和IL-17A的含量;流式细胞仪检测脾组织中Th1/Th2和Th17/Treg细胞群落的改变;HE染色镜下观察小鼠肺组织病理形态。采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。结果各组小鼠雾化激发后,对照组小鼠仅出现短暂的轻微烦躁症状,哮喘组小鼠表现出明显的烦躁不安、喘息、呼吸加快加深,SIT组小鼠经免疫治疗后,有轻微的喘息症状,症状较哮喘组小鼠有所改善。ELISA检测结果显示,哮喘组小鼠血清中特异性IgE抗体含量为(31.49±4.32) IU/ml,高于对照组的(8.53±1.92) IU/ml和SIT组的(16.68±2.45) IU/ml (P<0.01);哮喘组小鼠血清中抗原特异性IgG2a抗体含量为(19.56±3.89)μg/ml,低于对照组的(42.43±2.07)μg/ml和SIT组的(36.96±5.04)μg/ml (P <0.01)。哮喘组小鼠IFN-γ和IL-10水平分别为(134.23±22.49)和(22.43±8.27) pg/ml,低于对照组的(212.36±33.21)和(72.84±21.42) pg/ml (P<0.05、0.01);SIT组小鼠IFN-γ和IL-10水平分别为(183.76±24.66)和(61.05±7.97) pg/ml,与哮喘组相比,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。哮喘组小鼠IL-4和IL-17A水平分别为(165.45±34.59)和(464.21±41.36) pg/ml,高于对照组的(21.31±5.26)和(115.74±30.82)μg/ml (P<0.01);SIT组小鼠IL-4和IL-17A水平分别为(64.15±17.33)和(271.61±27.07) pg/ml,与哮喘组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,哮喘组小鼠脾组织CD4^+T淋巴细胞中Th1和Treg细胞比例分别为2.8%和4.9%,较对照组的3.7%和10.3%显著降低(P<0.05、0.01);SIT组Th1和Treg细胞比例分别为3.1%和8.8%,较哮喘组小鼠的有所升高(P<0.05、0.01)。哮喘组Th2和Th17细胞比例分别为2.8%和2.2%,较对照组的1.0%和0.3%显著升高(P<0.01),SIT组Th2和Th17细胞比例分别为1.7%和0.6%,较哮喘组小鼠有所降低(P<0.01)。肺组织病理切片结果显示,哮喘组小鼠肺组织终末细支气管有明显炎性细胞浸润,支气管平滑肌纤维断裂,上皮细胞脱落;SIT组小鼠肺组织病理变化较哮喘组的有明显好转,支气管壁增厚减少,炎性细胞浸润情况得到改善。结论 Der p1T融合蛋白对哮喘小鼠的特异性免疫治疗有一定的效果。     

沙眼衣原体在肠道定殖中的作用机制

生殖道沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种最常见的细菌性传播病原体之一。最新研究表明68%的泌尿生殖道Ct核酸阳性的患者中，在其直肠中也能检测到Ct;由于小鼠生殖道感染鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)后与人类生殖道感染Ct产生相同的症状，Cm感染动物模型被广泛用于研究Ct的发病机制和免疫途径，研究发现Cm也可以长期定殖小鼠胃肠道。因此，Ct是否可以长期定殖于胃肠道及其作用机制引起众多学者的关注。本文拟对Ct生殖道感染可能播散到机体其他器官的传播途径、Ct主要致病因子及其作用机制作一综述。     

IL-10在约氏疟原虫感染过程中免疫调节作用的实验观察

目的探讨IL-10在疟原虫感染过程中的免疫调节效应。方法用约氏疟原虫感染DBA／2和BALB／c小鼠，取血，制薄血膜，染色后镜检疟原虫，计算红细胞感染率；用ELISA试剂盒检测小鼠血清IFN-γ和IL-10水平。结果DBA／2小鼠于感染后第21d自愈，血清IFN-γ在感染后第3d显著升高（6542pg／ml），之后逐渐下降，至感染后第12d仍高于未感染鼠；血清IL-10于感染后第6d显著升高（248pg／ml），并于感染后第15d达到峰值（980pg／ml）后下降。BALB／c小鼠感染后第6d红细胞感染率达57．5％，并于当日和次日全部死亡；血清IFN-γ仅于感染后第3d出现一过性升高，峰值为2225pg／ml而IL-10一直处于高水平状态，峰值为432pg／ml。结论小鼠感染约氏疟原虫后过早分泌的高水平IL-10对Th1反应具有明显的抑制效应，而IL-10适时的分泌可能与Th1向Th2反应的转换密切相关。     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠脾细胞淋巴因子变化的研究

目的 探讨细粒棘球绦虫（Eg）重组BCG-Eg95疫苗免疫后对受攻击小鼠的包囊减重率及脾细胞淋巴因子的影响。方法 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗分别采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径免疫BALB/C小鼠，免疫后8周用Eg原头节攻击感染，50个Eg原头节/每只小鼠，感染后18周剖杀小鼠，分离并称重细粒棘球蚴，计算包囊减重率；取脾，分离脾细胞，用Eg粗抗原（EgAg）或伴刀豆球蛋白A（ConA）刺激培养，收集脾细胞培养上清液，检测脾细胞培养上清液的白介素-2（IL-2）、γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-4（IL-4）水平。同时设卡介苗（BCG）和磷酸盐缓冲液（PBS）对照。 结果 以上4种疫苗接种组的包囊减重率分别为45.77%、18.20%、88.05%和92.46%；疫苗肌肉接种组的IL-2、IFN-γ和TNF-α均较PBS对照为高，分别为（30.0±0）pg/ml、（65.0±0）pg/ml和（425.0±10.7） pg/ml， IL-4低于PBS对照组， 为（10.0±0） pg/ml。 结论 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠产生辅助性T细胞1型（Th1）反应，从而对抗Eg原头节攻击感染。     

日本血吸虫感染对过敏性哮喘影响的实验研究

目的 建立日本血吸虫感染并发过敏性哮喘实验动物模型及探讨日本血吸虫感染对过敏性哮喘的作用. 方法 取25只BALB/c小鼠,随机分为3组,A组为日本血吸虫感染并发过敏性哮喘组,B组为单纯过敏性哮喘组,C组为健康对照组.A组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(23±3)条.8周后,以卵白蛋白(OVA)分别对A组、B组小鼠进行致敏激发,建立过敏性哮喘模型.12周后,取小鼠脾脏制成单细胞悬液并培养72 h,收集脾细胞上清液,检测细胞因子IL-4和IFN-γ水平;收集支气管肺泡灌洗液(BALF),观察嗜酸性粒细胞(EOS)所占的百分比;取小鼠肺组织作病理切片,观察小鼠肺组织的炎症变化. 结果 与B组比较,A组小鼠BALF涂片中EOS数减少(P＜0.05),A、B两组EOS百分比分别为(7.30±5.01)%和(43.60±2.53)%,而C组小鼠BALF中仅见少数气管上皮细胞,无炎细胞;ELISA法检测A、B、C组小鼠脾细胞培养上清IL-4水平分别为(96.02±38.54) pg/ml、(414.86±175.12) pg/ml和(13.55±1.66) pg/ml,IFN-γ水平分别为(11.60±4.18) pg/ml、(7.43±3.60)pg/ml和(7.55±1.57) pg/ml.与B组比较,A组小鼠IL-4水平降低(P＜0.05),IFN-γ水平无显著性变化(P＞0.05),IL-4/IFN-γ比值降低(P＜0.05).肺部病理改变A组小鼠较轻,B组较重,C组无炎症反应. 结论 日本血吸虫感染对过敏性哮喘的发生有抑制作用.     

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析

目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体p ET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白r Eg-01883。ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射r Eg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10μg,100μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理。分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血。用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性Ig G抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白r Eg-01883的免疫原性。结果筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白r Eg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性Ig G抗体,免疫组小鼠的血清Ig G抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到最高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1±0.006)和空白对照组(0.241±0.01)(P0.01)。首次免疫后6周,血清中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平,免疫组分别为43.23 pg/ml和24.88 pg/ml,均显著高于佐剂组(21.77 pg/ml,13.27 pg/ml)和空白对照组(17.40 pg/ml,12.25 pg/ml)(P0.05)。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白r Eg-01883抗原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别。结论筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫ICR小鼠具有较好的免疫原性。     

日本血吸虫表位肽-DNA颗粒性疫苗对小鼠免疫应答的影响

采用已构建的日本血吸虫Sj22.6抗原CTL、Th和B细胞表位肽-DNA颗粒性疫苗(PDDV)及其混合疫苗免疫C57BL/6小鼠。36只小鼠随机均分6组,即18K对照组([K]_(18)-空质粒PDDV)、PBS对照组、C组(C-PDDV)、T组(TPDDV)、B组(B-PDDV)和C-T-B组(C-PDDV、T-PDDV和B-PDDV等量混合),每鼠分别在第0、3和6周麻醉下经尾脊部皮下注射100μl PDDV(含10μg DNA和28μg肽),对照组注射等量的空质粒DNA和[K]_(18)肽或PBS。末次免疫后7d,脱颈处死,制备脾细胞悬液,经日本血吸虫成虫抗原(SWA)刺激后根据~3H标记的胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)检测脾细胞增殖反应,ELISA法检测脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的含量。ELISA结果显示,T组小鼠脾细胞中IFN-γ的含量[(76.0±11.2)pg/m1],高于PBS[(13.0±2.1)pg/ml]和18K对照组[(14.0±3.2)pg/ml](P<0.01),T组和C-T-B组小鼠脾细胞中IL-4的水平分别为(152.0±21.1)和(8...