表达荧光蛋白卡介苗菌株的构建与应用及其qPCR定量方法的建立

目的构建稳定表达红、绿色荧光蛋白的卡介苗(Bacille Calmette-Guérin, BCG)菌株,并建立快速定量BCG细菌数的qPCR方法。方法电转化构建稳定表达红、绿色荧光蛋白的BCG菌株,比较其与野生菌株的生长曲线。将此荧光蛋白标记的BCG感染人源单核巨噬细胞系THP1细胞,用共聚焦显微镜观察感染吞噬效果。基于BCG 16SrRNA序列设计特异性引物,应用qPCR定量检测BCG细菌基因组DNA,根据细菌平板计数菌落数与qPCR循环数绘制标准曲线,建立qPCR定量BCG细菌数的方法。结果构建的荧光蛋白标记BCG菌株荧光信号强,生长曲线与野生菌株基本一致,共聚焦显微镜观察细菌感染细胞后呈现良好荧光效果。建立的qPCR检测方法能定量检测BCG细菌数量,重复试验中组内和组间的变异系数均小于3%。结论构建的卡介苗菌株稳定表达荧光蛋白。建立的qPCR方法重复性好,可用于对BCG菌株的快速计数。     

结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性研究

目的建立结核分枝杆菌感染RAW264.7株巨噬细胞模型,研究结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性。方法分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株感染RAW264.7巨噬细胞株,于感染后1、3、6及12h,利用激光共聚焦显微镜鉴定卡介苗及结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染RAW264.7巨噬细胞模型;同时利用流式细胞技术于上述各时间点检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其时相性变化;利用PCR技术扩增模型目的基因,利用Western blot检测上述各个时间点Hsp16.3蛋白表达水平的时相性变化。结果激光共聚焦显微镜下观察到RAW264.7巨噬细胞内有标记MTB16KD的绿色荧光,证实结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型构建成功。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中感染后1、3和12h凋亡率H37Rv感染组与BCG感染组比较差异有统计学意义(P<0.05);巨噬细胞感染结核分枝杆菌后的PCR产物大小为435bp;感染细胞Hsp16.3蛋白表达升高,其中感染后1h和3h升高更显著。结论结核分枝杆菌感染可导致巨噬细胞凋亡,感染巨噬细胞的凋亡率与菌株毒力强弱有关,弱毒力结核分枝杆菌感染的巨噬细胞早期凋亡更显著;结核分枝杆菌感染巨噬细胞的凋亡与结核分枝杆菌表达Hsp16.3水平高低有关,在感染早期强毒力结核分枝杆菌Hsp16.3表达水平较高。     

稳定表达烟酸受体GPR109A的中国仓鼠卵巢细胞株的建立

目的 将GPR109A基因插入pEGFP-N3载体中构建重组质粒pEGFP-GPR109A,并建立稳定表达烟酸受体GPR109A的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞株.方法 构建重组质粒pEGFP-GPR109A,重组质粒转化大肠杆茵DH5a,重组质粒经PCR、酶切、测序验证正确后,应用脂质体转染技术将该质粒导入CHO细胞,用抗生素G418筛选稳定表达的细胞.倒置荧光显微镜观察克隆细胞株荧光信号,RT-PCR检测GPR109A基因mRNA表达,Westem Blotting检测绿色荧光蛋白与烟酸受体GPR109A的融合蛋白(GFP-GPR109A)的表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位.结果 pEGFP-GPR109A真核表达质粒构建正确,融合蛋白GFP-GPR109A在CHO细胞中稳定表达,表达的融合蛋白主要定位于细胞膜.结论 成功构建pEGFP-GPR109A真核表达载体并建立其稳定表达的CHO细胞株;该细胞株的建立有助于GPR109A的更多生理病理功能研究,也为下一步抗动脉粥样硬化的药物筛选奠定了基础.     

人醛糖还原酶基因在酿酒酵母中的诱导表达及活性分析

目的 建立人醛糖还原酶（AR）及其与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达的酿酒酵母细胞表达株,检测细胞中目的基因的表达及蛋白活性。方法将含目的基因AR及融合基因AR：：GFP的重组质粒pYEX—BX转化酵母细胞INVScl,得到宿主菌株XAR,XAG及对照菌株YEX。观察酵母细胞生长曲线及GFP荧光信号;Northemblot检测细胞中ARmRNA转录;Westernblot检测AR蛋白表达;荧光法测定AR活性。结果三菌株生长速率无明显差异;XAG菌株相对荧光强度与生长时间成线性关系;XAR,XAG菌株分别有持续、稳定的目的基因mRNA转录及目的蛋白表达,并具有AR活性。结论成功构建了AR基因的酵母表达株,为进一步将此细胞株应用于研究AR的致病机制及AR抑制剂的初步筛选打下基础。     

人FUT3基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-C1-FUT3真核表达载体,分析其在细胞系MDA-MB-231中的表达.方法:采用RT-PCR扩增FUT3全长基因片段,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FUT3亚克隆至pEGFP-C1表达载体并酶切鉴定.利用脂质体将重组真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光显微镜观察及RT-PCR检测FUT3的表选.结果:成功获得人全长FUT3基因并构建了真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3,体外转染MDA-MB-231细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检出高水平表达的FUT3.结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白为报告基因的FUT3真核表达载体,并在MDA-MB-231中稳定表达,为进一步研究FUT3的生物学功能提供基础.     

Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建重组tumstatin-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体质粒,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1).方法 利用重叠多聚酶链反应(PCR)技术从pGEM-T/STL质粒和pEGFP-C2质粒中扩增出STL-EGFP,用DNA重组技术将片段定向插入pIRESneo3质粒中,经酶切和序列验证正确后,用lipofectamine 2000转染CHO-K1细胞,通过G418筛选建立稳定转染的CHO细胞系,用逆转录-PCR、Western blot检测tumstatin-EGFP的表达,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果 重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞获得稳定表达,tumstatin-EGFP基因整合入细胞基因组DNA,培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,绿色荧光蛋白的表达高达95%以上.结论 成功构建了质粒PIRESneo3-STL-EGFP,获得稳定表达tumstatin-EGFP的细胞系.     

绿色荧光蛋白/PAP-a融合表达载体的构建及其在SMMG-7721细胞中的表达

目的构建绿色荧光蛋白/PAPa融合表达载体,并检则其在肝癌细胞SMMC7721细胞中的表达。方法采用PCR方法获得PAPa基因;将该基因片段克隆入带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,CFP)报告基因的真核表达载体pEGPN1中,构建融合表达载体pEGFPPAPa;通过脂质体介导的方法将该载体转染到SMMC7721中,Westernblot检测PAPa的瞬时表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果pEGFPPAPa转染SMMC7721细胞后,在细胞中检测到PAPa基因片段,Westernblot可以检测到PAPa在SMMC7721细胞表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论pEGFPPAPa在SMMC7721细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有PAPa和绿色光蛋白的双重活性,该载体的成功表达是研究PAPa抗肿瘤或抗病毒活民生的基础。     

PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在结肠癌SW480细胞中的表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染大肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR检测PRL-3基因表达.结果:获得522 bp的PRL-3基因编码序列并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3和建立PRL-3稳定表达SW480细胞,为进一步深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定基础.     

荧光蛋白标记逆转录病毒整合酶及Brd2真核表达载体的构建

目的构建绿色荧光蛋白标记的莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)整合酶及红色荧光蛋白标记的Brd2的真核表达质粒,为研究整合酶与Brd2相互作用打下基础。方法以Prr88-MLV、HIV质粒pNL4-3及含有Brd2的质粒为模板,采用PCR技术扩增MLV-IN、HIV-IN、Brd2片段;利用酶切反应体系构建psectag2A-GFP-mIN、psectag2A-GFP-hIN、pDsred2-N1-Brd2质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳后进行测序分析;用重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜观察目的蛋白表达情况,并进行WB鉴定。结果构建psectag2A-GFP-hIN、psectag2AGFP-mIN、pDsred2-N1-Brd2的真核表达质粒,酶切以及测序结果与预期相符。将上述质粒分别转染293T细胞,WB及荧光显微镜均检测到目的蛋白的表达。结论成功构建了绿色荧光标记的HIV、MLV整合酶真核表达质粒和红色荧光蛋白标记的Brd2真核表达质粒,尽管Brd2真核表达质粒荧光相对较弱,但这对整合酶与Brd2相互作用研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌中基因过表达体系的构建及应用北大核心CSCD

目的 在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)体内构建外源基因以及自身基因的过表达系统。方法 以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,通过同源重组基因敲入和穿梭质粒两种方法构建Hp中基因过表达体系。同源重组法:以预先构建的基因敲除载体pSJHK的衍生质粒pSJHK4为载体,构建gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,使用Hp鞭毛高表达基因flaA的启动子调控gfp的表达;以hp0547基因区域为插入位点,通过自然转化的方式将质粒转入细菌,胞内通过同源重组将gfp插入到Hp基因组中,荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。穿梭质粒法:将含有鞭毛基因flaA启动子和gfp基因的表达盒连入H.pylori-E.coli穿梭质粒pCHFHP中,构建表达质粒pCHFHP-gfp,自然转化到Hp中,荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。用同样方法构建Hp CagA蛋白(融合有His-tag)的表达质粒pCHFHP-CagA,转入预先构建的Hp CagA敲除株,通过亲和层析纯化重组蛋白,Western blot检测CagA的表达情况。结果 构建了gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,转入Hp后细菌发出绿色荧光;基于穿梭质粒构建了gfp基因表达质粒pCHFHP-gfp,转入Hp中细菌同样发出荧光;进一步构建了CagA的表达质粒并转入Hp CagA敲除株中,Western blot检测到CagA蛋白,并体外纯化获得一定量蛋白。结论 基于同源重组基因敲入和穿梭质粒的方法可在Hp中构建外源基因及Hp自体基因的过表达体系,该方法能够为Hp的基因功能研究和致病因子的发掘提供基因操作工具。     

YAP干扰质粒的构建及转染肺腺癌细胞A549的筛选鉴定

目的构建YAP基因小发卡RNA(shRNA),并转染人肺癌A549细胞株,建立稳定低表达YAP基因的肺癌细胞系。方法根据信息检索,分别构建4个shRNA(shRNA1,shRNA2,shRNA3,shRNA4)质粒表达载体和一个阴性对照表达载体(NCRNA),脂质体法转染人肺癌A549细胞株,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,有限稀释法建立稳定低表达YAP基因的A549细胞系,RT-PCR和Western印迹检测YAP在该细胞中的表达。结果转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western印迹检测到目的基因YAP在转染细胞中为低表达。RT-PCR检测YAP mRNA示shRNA1,shRNA2,shRNA3,shRNA4,NCRNA组和空白对照组的2-ΔΔct值分别为2.775,0.498,0.432,2.834,3.289,3.320。Western印迹检测示shRNA1组,shRNA2组,shRNA3组,shRNA4,NCRNA组,空白对照组的蛋白相对灰度值分别为0.690,0.411,0.354,0.688,0.699,0.712。结论成功构建了靶向YAP基因的shRNA,筛选出了干扰作用最为明显的shRNA,并建立了稳定低表达YAP基因的A549细胞系。     

烟曲霉Bem46基因荧光定位菌株构建及对极性生长相关基因影响作用初探

目的 构建以eGFP作为荧光标记的烟曲霉Bem46基因定位菌株,观察其在烟曲霉不同形态中的定位情况,初步明确该基因对极性生长相关基因Bem1、Bud5表达的影响。方法 运用分子生物学方法将烟曲霉Bem46基因克隆入质粒pUCGH,构建荧光定位载体。原生质体法转化烟曲霉获得该基因定位菌株并验证。激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在烟曲霉孢子、芽管以及菌丝状态下分布情况。RT-PCR观察对照菌株Ku80和ΔBem46中极性生长相关基因Bem1、Bud5的表达量。结果 通过全基因克隆成功获得烟曲霉Bem46基因定位菌株并经PCR验证。激光共聚焦显微镜下绿色荧光在孢子中弥散分布,在孢子即将发芽时荧光在孢子一侧聚集,并随着芽管形成,荧光在极性生长的一侧延伸分布于整个菌丝中,在菌丝形成侧枝膨大处可见荧光明显聚集。RT-PCR结果表明ΔBem46中基因Bem1、Bud5表达量均较对照菌株有所下降。结论 烟曲霉Bem46基因可能同孢子发芽、菌丝发生侧枝的极性生长相关;且该基因缺陷可影响极性生长相关基因Bem1、Bud5表达。     

人LIMK1基因荧光真核表达载体的构建及在人成骨肉瘤MG63细胞中的表达

目的 构建并表达人LIMK1与绿色荧光蛋白(EGFP-C1)的融合蛋白EGFP-LIMK1,并监测其在人成骨肉瘤MG63细胞内的表达及活性.方法 利用基因重组技术将LIMK1与绿色荧光蛋白融合并构建真核细胞表达质粒,通过脂质体介导法导人人成骨肉瘤MG63细胞内,用荧光显微镜观察LIMK1基因表达情况,通过Westernblot检测其在MG63细胞中的活性.结果 双酶切鉴定证实LIMK1片段已克隆到pEGFP-C1载体的Kpn Ⅰ和Not Ⅰ位点之间,测序结果证实了插入片段的正确性,转染MG63细胞后,利用荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测证实LIMK1在MG63细胞中活性上调.结论 成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的LIMK1真核表达载体并检测到其在真核细胞MG63中的表达及活性.     

人α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅳ荧光真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-N1-FUT4真核表达载体.方法:采用RT-PCR方法获得α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅳ(FUT4)全长基因,克隆至pEGFP-N1- FUT4表达载体并进行鉴定.通过脂质体转染到人表皮癌细胞系A431中,荧光显微镜下观察并经逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测FUT4的表达. 结果:测序及酶切鉴定证明获得人全长FUT4基因,FUT4基因正确插入pEGFP-N1中,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在A431细胞中的表达,RT-PCR和Western blot检测结果显示FUT4的表达明显增加.结论:成功构建绿色荧光蛋白为报告基因的FUT4真核表达载体,并检测到在A431细胞中的表达.     

一种不溶血红细胞免疫荧光细胞化学检测方法的建立

目的 以氯通道蛋白ClC-3为靶蛋白,建立一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法.方法 采集大鼠红细胞,涂片,0.5％丙烯醛/PBS固定,以不同浓度的Triton X-100/PBS（含0.1mol/L甘氨酸）溶液透膜,用含0.05 mmol/L甘氨酸、2％ BSA、0.05％ NaN3的PBS溶液封闭抗原,随后孵育ClC-3的一抗和荧光标记的二抗,最后在共聚焦荧光显微镜下观察结果.结果 0.1％ Triton X-100/PBS结合其他优化液处理的红细胞未出现溶血现象,共聚焦显微镜下清晰地观察到目的蛋白及其亚细胞分布情况.结论 通过优化固定液、透膜液、封闭液和洗涤液,解决了常规免疫细胞化学法导致红细胞易溶血的缺点,在确保红细胞不溶血的同时成功检测到红细胞氯通道ClC-3蛋白,即成功建立了一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法.     

刚地弓形虫绿色荧光蛋白突变株的构建

目的构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的弓形虫突变株,探讨以其检测宿主细胞感染率的效果。方法在人子宫颈癌(HeLa)细胞中培养弓形虫RH株速殖子,电穿孔法向虫体导入质粒ptubP30-GFP/sag-CAT,氯霉素和极限稀释法筛选稳定表达P30-GFP融合蛋白的突变株,RT-PCR法和荧光显微镜检测GFP蛋白在虫体内的表达。HeLa细胞分别感染1×104～1×107个突变株虫体,24 h后,显微镜计数各孔10个高倍镜视野下具有GFP荧光的HeLa细胞数。流式细胞仪检测纳虫泡,评估HeLa细胞感染率。结果导入ptubP30-GFP/sag-CAT质粒后,经氯霉素筛选获得阳性克隆。RT-PCR检出虫体GFP基因表达,镜下可见GFP荧光聚集于虫体外膜。HeLa细胞感染率随虫体接种量的增多而增加,接种1×104～1×107个虫体24 h后,具有GFP荧光的HeLa细胞数分别为(14±6)、(133±45)、(332±93)和(443±90)个;流式细胞仪检测HeLa细胞感染率分别为(0.49±0.09)%、(8.76±0.50)%、(21.02±1.49)%和(39...     

AT2R基因转染对血管平滑肌细胞增殖核抗原表达的影响

目的:探讨血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因体外及体内转染对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖核抗原(PCNA)表达的影响。方法:细胞爬片及大鼠颈动脉球囊损伤后,局部转染带有绿色荧光蛋白报告基因的AT2R重组腺病毒载体(pAd-AT2R)或病毒载体(pAd-GFP),于细胞转染后48h及术后14d取材,应用免疫组织化学染色、免疫荧光双标染色和激光共聚焦技术检测了VSMC及血管中AT2R与PCNA的表达关系。结果:pAd-AT2R转染VSMC后,在激光共聚焦显微镜下胞质及胞核有绿色荧光蛋白表达;同时在胞质有红色荧光AT2R表达,胞核无蓝色荧光,PCNA表达阴性,无红色荧光AT2R表达的VSMC胞核有蓝色荧光,PCNA表达阳性。pAd-AT2R在体转染大鼠颈动脉后,新生内膜及中膜中PCNA阳性表达率显著低于未转染组和pAd-GFP组[(27.29±5.81)%∶(72.25±4.47)%,(68.43±9.12)%,P<0.01];在激光共聚焦显微镜下,绿色荧光及红色荧光AT2R主要分布于新生内膜、中膜、外膜,内膜散在蓝色荧光PCNA表达,在红、绿色荧光处无蓝色荧光,PCNA表达阴性,无红、绿色荧光处,有蓝色荧光,PCNA表达阳性。结论:AT2R基因体外及体内转染可抑制VSMCPCNA表达,ATR基因转染能抑制新生内膜增生。     

人骨诱导因子和绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体的构建和鉴定及在HT-29细胞中的表达

目的构建和鉴定人骨诱导因子基因(hOGN)和绿色荧光蛋白(GFP)共表达慢病毒载体,并检测其在人大肠癌细胞株HT-29中的表达水平。方法采用PCR方法克隆hOGN基因;将hOGN基因连接到带有GFP的慢病毒表达载体pEZ-Lv201中构建慢病毒载体;将构建的慢病毒载体质粒pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro(pEZ-hOGN)与慢病毒包装质粒混合物Lenti-PacHIVmix共转染293T细胞,收集慢病毒悬液;重组病毒转染H1299细胞,定量PCR法检测重组病毒滴度;将构建的pEZ-hOGN感染HT-29细胞,荧光显微镜观察和Western印迹检测感染后HT-29细胞中GFP表达情况和目的基因hOGN的表达情况。结果基因测序分析证实克隆的hOGN基因与GenBank提供的序列完全一致;构建的重组慢病毒载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定证实OGN正确插入pEZ-Lv201;定量PCR测定慢病毒滴度为0.1×10~9~1×10~9TU/ml。在HT-29细胞中重组病毒感染96h后在荧光显微镜下可检测到较强的绿色荧光蛋白表达,Western印迹检测到在HT-29细胞中hOGN蛋白过表达。结论成功构建携带hOGN基因的重组慢病毒载体,在HT-29细胞中有效表达。     

人pEGFP-GEF-H1载体的构建及其表达

背景:研究表明GEF-H1能激活Rho蛋白,与肿瘤发生、发展、浸润、迁移等密切相关。目的:构建人pEGFPGEF-H1载体并稳定转染结肠癌HCT116细胞后检测GEF-H1表达。方法:在线合成引物软件设计人GEF-H1基因引物,构建重组质粒pEGFP-GEF-H1,并转染结肠癌HCT116细胞,以转染空质粒和未转染的细胞分别作为空质粒组和空白对照组。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测GEF-H1 mRNA和蛋白表达水平。结果:成功构建了人pEGFP-GEF-H1载体,测序结果表明序列正确。转染重组质粒pEGFP-GEF-H1后,荧光显微镜下可见较强的绿色荧光,GEF-H1 mRNA和蛋白表达水平均较空质粒组和空白对照组明显上调。结论:体外成功构建了人pEGFP-GEF-H1载体,且转染结肠癌HCT116细胞后高表达GEF-H1,为进一步探讨结肠癌与GEF-H1的关系提供了必要的实验材料。     

华支睾吸虫ATP合酶b亚基模拟亚细胞定位与细胞周期的关系

目的了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基(CsATP-synt_B)核定位序列(NLS)介导该蛋白进入细胞核与细胞周期的关系,及该蛋白对自身和宿主同源基因表达的影响。方法将已构建的CsATP-synt_B与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒(pEGFP-N1-CsATP-synt_B)转染Hela细胞,转染细胞经同步化处理后,在激光共聚焦显微镜下观察在不同细胞周期相,细胞不同部位的荧光分布。流式细胞技术检测该融合蛋白表达量的变化,并通过半定量RT-PCR分析不同细胞周期相CsATP-synt_B和Hela细胞同源基因的表达。结果转染细胞经同步化处理后,流式细胞检测结果显示,空载体pEGFP-N1在G0/G1期Hela细胞中的表达量明显下降,而pEGFP-N1-CsATP-synt_B在该时期表达量呈上升趋势;在其他细胞周期时相,两者的荧光表达量的变化趋势相似。显微镜观察发现,在G0/G1期、S期和G2/M期CsATP-synt_B集中在线粒体表达,G1/S期细胞核内见绿色荧光,且多数细胞的绿色荧光集中见于核仁。在不同的细胞周期,半定量RT-PCR分析结果显示,该重组蛋白进入细胞核后,目的基因CsATP-synt_B和人源性ATP-synt_B(Ho-moATP-synt_B)mRNA的表达均呈上升趋势,CsATP-synt_B上升幅度较大,但两者的表达变化趋势一致。结论 CsATP-synt_B在G1/S期进入细胞核,受细胞能量需求和细胞周期的调控。