细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2诱导表达条件探索

目的 探索细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2的最佳诱导表达条件,并对其蛋白结构进行预测。方法 构建p ET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2重组质粒,将其转化至Ecoli.BL21(DE3)细菌中,选择不同的时间段和温度,用不同浓度的IPTG进行诱导蛋白表达。将得到的菌液通过超声破碎,经离心后用SDS-PAGE分别分析上清和沉淀中重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2的表达情况。Western Blot鉴定重组蛋白表达。鉴定成功后进行大量诱导表达。采用生物信息学的方法,使用在线软件SWISS MODEL对HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白三维结构进行预测。结果 HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2重组蛋白在28℃条件下,诱导4 h,IPTG的浓度为0.2 mmol/L时可溶性蛋白表达量达到最大。蛋白的相对分子量约为29 kD,结果与预期相符。其蛋白三维结构的预测与2×44.1.A结构的相似程度为78.13%。结论 探索出HIS-4IgV-EgG1Y162-2重组蛋白最佳诱导表达条件,并成功预测...     

pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒的构建及表达产物的纯化与鉴定北大核心CSCD

目的 构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)原核表达质粒,诱导表达后纯化,获得重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),并对其免疫学特性进行初步鉴定,对其空间结构进行预测。方法 利用DNA重组技术构建重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE)菌株中,分别采用不同浓度的IPTG在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白。取菌液超声破碎,SDS-PAGE分析上清及沉淀中蛋白的表达;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行Western blot鉴定。通过生物信息学技术,利用SOPMA、I-TASSER在线数据库预测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)的空间结构。结果 成功构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒,转化至E.coli BL21(DE)后诱导表达相对分子质量为53×10^(3)的重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)。SDS-PAGE分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白在IPTG浓度为0.7 mmol/L,37℃、4 h条件下上清中表达量较高。镍柱层析纯化用20 mmol/L咪唑浓度洗脱的蛋白浓度及纯度较高。Western blot检测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)能被相应抗体识别,反应条带位于53×10^(3)处,与预期相符。生物信息学在线软件分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)中各蛋白均能正常折叠,未对优势表位产生影响。结论 利用原核表达成功获得CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白,并预测出该蛋白的三维结构模型,为细粒棘球蚴重组疫苗的研制提供了重要的实验依据。     

细粒棘球绦虫Calpain蛋白的生物信息学分析北大核心CSCD

目的采用生物信息学软件分析细粒棘球绦虫Calpain蛋白(EgCalpain)的结构与抗原表位,为研制基于Calpain的棘球蚴病疫苗提供依据。方法从NCBI核苷酸和蛋白质数据库下载EgCalpain的核苷酸和氨基酸序列,采用ProtParam、SignalP、TMHMM、Cell-Ploc等在线分析程序,结合DNAStar、DNAMAN等生物信息学软件分析、预测EgCalpain蛋白的理化性质、信号肽序列、跨膜结构域、亚细胞定位及抗原表位;采用Clustal omega程序对不同物种来源的Calpain蛋白进行多序列比对,并通过MEGA 6.06程序构建邻接树。结果 EgCalpain基因全长7 734 bp,包含15个外显子和14个内含子;EgCalpain基因编码蛋白由707个氨基酸组成,是一种稳定蛋白,不含有信号肽序列和跨膜区域,可能定位于细胞质。EgCalpain蛋白含有5个T、B细胞联合表位,分别为267-299 aa、328-356 aa、486-507 aa、546-567 aa、648-662 aa。EgCalpain蛋白与曼氏血吸虫Calpain的亲缘关系较近,与人、牛、羊Calpain的亲缘关系较远。结论 EgCalpain蛋白含有5个T、B细胞联合表位且与人、牛、羊Calpain的亲缘关系较远,作为棘球蚴病疫苗进行免疫时,可能具有良好的免疫保护作用。     

细粒棘球绦虫抗原Fis1的生物信息学分析北大核心CSCD

目的利用生物信息学的方法分析细粒棘球绦虫Fis1(EgFis1)蛋白的抗原表位,为分子肽疫苗的研发奠定理论基础。方法在NCBI数据库中检所并下载EgFis1蛋白的氨基酸序列;利用EXpasy软件预测蛋白的理化性质;采用SignalP5.0和TMHMM sever 2.0软件预测EgFis1蛋白的信号肽和跨膜结构域;利用SOPMA和SWISS-MODLE预测EgFis1蛋白的二级结构和三级结构;采用IEDB、ABCpred和SYFPEITHI数据库预测EgFis1蛋白的T、B细胞表位。结果细粒棘球绦虫EgFis1是由157个氨基酸组成的等电点为5.86,分子质量单位为16.93ku的蛋白质;不含有信号肽序列,但具有一个跨膜结构域;其二级结构中α-螺旋占比例为48.41%,延伸连占19.11%,β-转角占7.01%,无规则卷曲占25.48%。亲水性较强的区域主要位于12aa-24aa,42aa-52aa,64aa-69aa,81aa-90aa,97aa-105aa,126aa-150aa。Eg-Fis1含有3个优势B细胞表位,7个T细胞表位以及2个T、B联合表位。结论生物信息学方法预测EgFis1蛋白含有4个优势B细胞表位、7个T细胞表位以及2个T、B联合表位,可作为免疫治疗和药物治疗的靶点。     

基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162⁃2（4）的制备及鉴定

目的　对细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162⁃2（4）进行原核表达并初步鉴定。方法　利用免疫信息学方法对基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162⁃2（4）进行三维结构建模,分析其结构变化并评估该疫苗抗原性。通过EcoR I和Sal Ⅰ双酶切构建pET30a⁃EgG1Y162⁃2（4）重组质粒,将重组质粒转化入感受态细胞,利用异丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷（isopropyl⁃β⁃D⁃thiogalactoside, IPTG）诱导蛋白表达, Western blotting鉴定原核表达蛋白产物,并应用细粒棘球蚴病患者及健康人血清分析重组蛋白抗原性。 结果　构建的重组疫苗EgG1Y162⁃2（4）三维结构串联的4个EgG1Y162⁃2蛋白均能独立、有效表达且具有良好抗原性。重组质粒pET30a⁃EgG1Y162⁃2（4）在0.2 mmol/L IPTG 37 ℃诱导4 h条件下,上清中目的蛋白表达量最高,使用60 mmol/L咪唑洗脱的蛋白成分较纯。Western blotting分析发现,重组多表位蛋白HIS⁃EgG1Y162⁃2（4）在约39 kDa位置处出现条带,且该蛋白可被细粒棘球蚴病患者血清识别。结论　成功构建了细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162⁃2（4）,为研究细粒棘球蚴病重组多表位疫苗奠定了基础。     

细粒棘球绦虫肌醇多磷酸2-激酶的生物信息学分析北大核心CSCD

目的利用生物信息学方法分析并预测细粒棘球绦虫肌醇多磷酸2-激酶(EgIP2K)的结构及抗原表位,为研究细粒棘球绦虫的药物靶点和疫苗开发提供理论依据。方法通过NCBI获取细粒棘球绦虫肌醇多磷酸2-激酶(EgIP2K)的氨基酸序列,采用Protparam预测EgIP2K的理化特性;采用SOPMA预测其二级结构;采用SignalP 4.1 server工具预测信号肽;采用NetPhos预测其磷酸化位点;采用DNAStar软件中的protean程序分析其抗原性指数、亲水性指数及表面可及性指数;采用ABCPred预测潜在的B细胞抗原表位;采用SYFPEITHI和IEDB工具预测蛋白的T细胞抗原表位。结果EgIP2K由492个氨基酸残基组成,相对分子质量为54.8×10^(3),分子式是C_(2397)H_(3791)N_(683)O_(730)S_(29),理论等电点为6.41,不稳定指数值为52.20,为不稳定蛋白;二级结构中α螺旋占36.10%,β折叠占16.46%,β转角占5.89%,无规则卷曲占46.54%;EgIP2K无信号肽序列,可能为非分泌蛋白;EgIP2K含有51个磷酸化位点,其中3个酪氨酸位点、13个苏氨酸位点、35个丝氨酸位点;预测EgIP2K具有B细胞和T细胞抗原表位,并且有3个抗原表位是B、T细胞联合抗原表位,分别位于90-94、411-422、424-438氨基酸区段。结论EgIP2K含有多个潜在的B细胞、T细胞抗原表位,可作为细粒棘球绦虫疫苗候选基因。     

细粒棘球绦虫Calmodulin蛋白的生物信息学分析北大核心CSCD

目的预测细粒棘球绦虫钙调蛋白(Echinococcus granulosus calmodulin, EgCalmodulin)的生化特性、结构和抗原表位,为包虫病分子肽疫苗的筛选奠定基础。方法利用在线数据库以及生物信息学相关软件分析EgCalmodulin蛋白的理化性质、二级和三级结构、亲/疏水性、表面可及性、抗原指数和柔性区域以及该蛋白的抗原表位。结果细粒棘球绦虫Calmodulin蛋白是由118个氨基酸组成,相对分子质量为13.48×10^(3),属于较稳定蛋白质;不含信号肽序列和跨膜结构域;二级结构中α-螺旋占47.46%,β-转角占13.56%,延伸连占15.25%,无规则卷曲占23.73%;亲水区域明显,评分较高的抗原指数所在区域与柔性区域相对应;优势B细胞表位位于10-20、32-37、47-55、65-74、81-91、100-110氨基酸区段;优势T细胞表位位于99-105、33-41、87-95,45-56、99-110、9-21氨基酸区段。结论利用生物信息学方法预测EgCalmodulin蛋白含有优势B、T细胞表位,可为包虫病分子肽疫苗的筛选提供参考。     

细粒棘球绦虫EgA31重组蛋白的抗原表位分析预测

根据GenBank中细粒棘球绦虫EgA31序列(GenBank登录号为AF067807)设计引物,以细粒棘球绦虫mRNA为模板,RT-PCR扩增EgA31基因,将其克隆入pUCm-T载体,转化大肠埃希菌(E coli)DH5α,筛选阳性克隆,经BamH I、Sac I双酶切和PCR鉴定,获得阳性重组质粒pUCm-T/EgA31,并将测序正确的片段连接表达载体,成功构建重组质粒pET30a-EgA31。经序列分析和同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞和T细胞表位分析,结果表明PCR扩增的特异条带为636 bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为100%。编码产物B细胞和T细胞联合表位预测,氨基酸区域可能在32～79、79～95、105～124和141～154位。     

细粒棘球绦虫egG1Y162抗原基因的克隆及序列分析

根据多房棘球绦虫emY162基因序列设计引物,利用PCR以细粒棘球绦虫原头蚴和成虫的基因组DNA和cDNA为模板扩增egG1Y162基因,构建PUCm-T/egG1Y162和PUCm-T/egG1Y162 cDNA重组质粒,经PCR、酶切及测序后,进行序列分析。细粒棘球绦虫2个不同发育阶段均克隆出egG1Y162基因,从基因组DNA和cDNA克隆得到的片段长度分别为1 680 bp和459 bp,登录号分别为AB458258和AB458259。     

细粒棘球蚴EgG1Y162-2与CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白结构预测及表位分析比较

目的采用生物信息学的方法,应用相关软件对EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的氨基酸序列进行分析,了解其理化性质及结构特点,预测并比较其抗原表位,为CTLA-4IgV-EgG1Y62-2蛋白作为包虫病表位疫苗的研究奠定基础。方法利用ProtParam在线软件分析EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的理化性质;运用DNAstar中的protean软件与在线SOPMA软件预测EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的二级结构;应用I-TASSER在线软件预测并比较EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的三级结构,并使用BepiPred1.0,IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测与分析。结果预测EgG1Y162-2蛋白由69个氨基酸组成,为稳定蛋白,具有亲水性。二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占7.69%、30.77%、15.38%和46.15%。预测的3条T细胞优势表位分别是1-18、21-43和47-62位氨基酸,2条B细胞优势抗原表位分别是9-28与57-69位氨基酸;CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白由208个氨基酸组成,稳定蛋白,具有亲水性。二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占13.46%、32.21%、7.69%和46.63%。预测的3条优势T细胞表位分别是143-154、165-177和183-199位氨基酸。2条B细胞优势抗原表位分别为151-167和197-205位氨基酸。结论 EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白均存在优势T抗原表位与B抗原表位,且T/B联合表位存在高度重合。说明CTLA-4IgV与EgG1Y162-2蛋白通过Linker序列连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白的优势表位产生影响。因此,将CTLA-4IgV基因与特异性抗原EgG1Y162-2基因进行融合表达可能会增强疫苗的免疫效果,这对囊型包虫病多价复合疫苗的研究具有重大意义。     

细粒棘球绦虫原头节抗原Eg-00512的生物信息学分析北大核心CSCD

目的分析细粒棘球绦虫原头节特异性抗原Eg-00512的生物信息学特征。方法通过NCBI数据库获取Eg-00512蛋白的氨基酸序列;使用ProtParam在线软件分析Eg-00512蛋白的理化性质;采用SOMPA在线软件分析蛋白的二级结构;使用IEDB在线软件预测Eg-00512蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性、β-转角;应用SWISS-MODEL在线服务器分析蛋白氨基酸序列并组合模板和Eg-00512蛋白的三级结构;B细胞表位采用在线软件IEDB及BcePred综合预测,T细胞表位采用在线预测软件SYFPEITHI分析确定。结果Eg-00512蛋白由1254个氨基酸组成,理论pI值6.15;归类于稳定蛋白质,属于亲水性蛋白。Eg-00512蛋白的二级结构中α螺旋占51.28%,延伸链占17.22%,β-转角占4.78%,无规卷曲占26.71%。Eg-00512蛋白B细胞表位数量各为8个;有13个CTL和14个Th细胞优势表位。结论生物信息学方法预测细粒棘球绦虫原头节含有多个优势B、T细胞抗原表位,为包虫病的诊断和疫苗的研究奠定了理论基础。     

细粒棘球蚴抗原B表位结构的预测分析和多表位重组抗原的构建

目的对细粒棘球蚴抗原B(EgAgB)的3个亚单位(EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4)的反应性表位的结构进行预测分析并进行基因重组,鉴定构建的多表位重组抗原的反应性。方法用Bioedit和Discovery Studio Visualizer分析软件和I-TASSER在线服务器对EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位抗原序列及其不同组合方式的组合序列进行分析和结构预测。选择结构预测评分较高的表位或亚单位组合方式进行基因重组。设计特异性重叠引物,用重叠延伸PCR技术扩增目标序列。将目标序列克隆至pET32a(+)载体中构建表达质粒表达重组蛋白,表达产物经纯化后即为多表位重组抗原。采用蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定多表位重组抗原的反应性。结果结构预测显示,EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位的主要表位均呈"Z"字型结构,且主要表位区域亦均位于序列的中部;对拟进行组合的3个EgAgB亚单位和4个主要表位(KK36、RK30、B4-2和B4-3)的57种不同的组合方式进行了结构预测,选择6种组合方式进行重组表达。对6个多表位重组抗原(MEA-8、MEA-20、MEA-26、MEA-36、MEA-49和MEA-52)进行的Western blotting分析显示,多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应条带明显强于AgB亚单位抗原。结论构建的6个多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应性明显强于EgAgB亚单位抗原。     

细粒棘球绦虫CD151蛋白的生物信息学分析及其编码基因在不同发育阶段的表达北大核心CSCD

目的分析细粒棘球绦虫四跨膜蛋白家族成员CD151(Eg-CD151)分子特性和各发育阶段表达水平,为研发包虫病疫苗奠定基础。方法从NCBI数据库下载Eg-CD151氨基酸序列,利用ProtParam、NetPhos 3.1 Server、GPS-SUMO 2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA、SWISS MODEL、SignalP 4.1 Server、TMHMM、SMART、Antibody Epitope Prediction在线生物信息学软件预测Eg-CD151蛋白的理化性质、磷酸化位点、棕榈酰化修饰位点、亚细胞定位、二级结构、三维结构、跨膜区域、结构域、B细胞抗原表位;利用DNAMAN和MEGA进行同源序列分析并建立系统发育进化树。利用实时荧光定量PCR检测不同发育阶段Eg-CD151 mRNA相对表达量。结果Eg-CD151蛋白由170 aa组成,为一种不稳定的跨膜蛋白,无信号肽,含2个跨膜区,分别位于6-28、136-158 aa,3个B细胞抗原表位位于非跨膜区域;存在14个磷酸化位点,包含3个酪氨酸磷酸化位点、5个苏氨酸磷酸化位点、6个丝氨酸磷酸化位点;含一个棕榈酰化位点(139-143 aa);二级结构主要为α-螺旋,占60.00%。同源序列比对显示,Eg-CD151与其终末宿主犬、赤狐及中间宿主牛的CD151进化关系较远。实时荧光定量PCR检测原头蚴、成虫两个发育阶段Eg-CD151 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论生物信息学分析Eg-CD151存在多个B细胞抗原表位,可作为包虫病诊断及疫苗候选抗原。     

新疆株细粒棘球蚴Innexin-unc9ORF的克隆鉴定及蛋白生物信息学分析北大核心CSCD

目的分子克隆新疆株细粒棘球绦虫缝隙连接通道蛋白(也称内联蛋白,EgInnexin unc9,EgInx)的完整开放阅读框(ORF)并鉴定,利用生物信息学软件分析该蛋白的分子特性,为进一步研究EgInx的功能和研制犬抗细粒棘球绦虫疫苗奠定基础。方法从新疆株细粒棘球蚴中扩增EgInx-ORF全长,克隆到pMD20-T上并测序;利用Expasy ProtParam、ProtScale、SignalP-5.0、TMHMM2.0、NetPhos3.1、ProtCompv9.0、NetSurfP-2.0和SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学分析软件分析EgInx的理化特性、信号肽序列、跨膜结构域、磷酸化位点、蛋白翻译后修饰位点及亚细胞定位、二级结构及三级结构;采用BLAST进行蛋白序列的同源性分析,采用Mega7进行系统进化分析。结果EgInx-ORF全长约1317 bp,编码438个氨基酸残基的EgInx蛋白;该蛋白等电点7.19,不稳定系数48.05,为不稳定蛋白;亲水性平均系数0.086,为疏水性蛋白,存在4个跨膜结构域;该蛋白不含信号肽序列,可能是非分泌跨膜蛋白。EgInx具有42个丝氨酸(Ser)磷酸化位点,29个苏氨酸(Thr)磷酸化位点,10个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点;该蛋白有多个翻译后修饰位点,主要定位于细胞膜、高尔基体和线粒体。预测其二级结构以α-螺旋为主,占53.42%;三维结构以八聚体形式组装。EgInx与扁形动物门绦虫纲的多房棘球绦虫(Em)、小口膜壳绦虫(Hm),涡虫纲的东亚三角头涡虫(Dj),吸虫纲的中华枝睾吸虫(Cs)、日本血吸虫(Sj)的Innexin unc 9的氨基酸序列一致性分别为98.14%、58.97%、33.66%、33.11%、33.69%。进化树分析显示,EgInx与Em、Hm的Inx在一个分支上。结论成功克隆了EgInx-ORF,预测EgInx蛋白为疏水性跨膜蛋白,且含有多个磷酸化位点,可为EgInx的功能研究提供参考。     

细粒棘球绦虫原头节抗原Eg-01883的B细胞表位预测、筛选及其血清学诊断价值北大核心CSCD

目的应用计算机软件分析细粒棘球绦虫原头节特异性抗原分子Eg-01883,预测其可能形成的B细胞表位,并探讨其B细胞表位的免疫反应性及诊断价值。方法使用在线软件SOPMA及DNAStar分析Eg-01883的二级结构,采用SWISS-Model预测该蛋白的三级结构。应用在线软件ABCPred和IEDB结合其亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原性等二级结构和三级结构对其B细胞表位进行分析预测、并人工合成表位肽段;以完整蛋白rEg-01883免疫小鼠产生的抗血清为一抗,采用间接ELISA方法筛选免疫反应性较强的表位,然后再以感染细粒棘球绦虫的小鼠血清为一抗,ELISA检测其免疫反应性,评价其诊断价值。结果初步筛选出7条抗原指数较高的Eg-01883表位,B细胞表位区域位于1-15、19-34、155-169、180-196、216-232、236-248、271-287位氨基酸。合成上述表位,纯度为99.99%。使用完整蛋白免疫血清筛选出2条反应原性较强的优势表位19-34和180-196,细粒棘球蚴感染小鼠血清能识别这两条B细胞表位,A450值结果分别为0.8218±0.0406和0.6398±0.0447,与对照组A_(450)值0.3312±0.0267和0.2961±0.0284比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论成功筛选到两个潜在的B细胞表位诊断抗原肽,对进一步开发细粒棘球绦虫早期诊断抗原和研究优势表位疫苗具有重要意义。     

细粒棘球绦虫丙酮酸激酶生物信息学及系统发育分析北大核心CSCD

目的运用生物信息学方法分析细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus sensu lato,Eg)丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因序列的结构与功能。方法通过NCBI蛋白数据库获取EgPK基因序列,利用ProtParam、ProtScale、SignalP 5.0、TMHMM、Motif Scan、ProtComp 9.0、CDD数据库、SOPMA、DNAStar、Swiss-Model Verify 3D、DNAMAN、VMD和MEGA等工具预测分析EgPK基因的相关生物学信息,并构建系统进化树,进行系统发育分析。结果生物信息学预测EgPK具有亲水性,分子质量62.05622 ku,无信号肽裂解位点,无跨膜区域。该蛋白含有3个N-糖基化位点,6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,6个N-肉豆蔻酰化位点,9个蛋白激酶C磷酸化位点。3D结构分析与序列比对显示,EgPK的桶状结构域和盖结构域之间存在特征性催化位点以及丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化位点。EgPK基因序列与多房棘球绦虫PK基因相似性为94.67%,与人的PK基因相似性为54.77%,EgPK与多房棘球绦虫PK蛋白亲缘关系较近,与人、小鼠、家兔等哺乳动物亲缘关系较远。结论EgPK具有PK的特征性结构域,可能参与细粒棘球蚴能量代谢相关活动。RNDFKEDT为EgPK的特征性活性位点,可作为开发抗囊型棘球蚴病的药物的候选靶点。     

细粒棘球绦虫TAK1基因ORF的克隆及其蛋白生物信息学分析北大核心CSCD

目的克隆细粒棘球绦虫(Eg)TAK1基因的开放阅读框(ORF)全长,预测其编码的蛋白EgTAK1的结构特点和生物学功能。方法从新疆株细粒棘球蚴中扩增EgTAK1-ORF全长,克隆至载体pMD20-T上并测序;从NCBI蛋白质数据库中下载EgTAK1的氨基酸序列,利用生物信息学分析软件分别对EgTAK1的理化性质、磷酸化位点、O-糖基化位点、N-糖基化位点、亲/疏水性、保守结构域、跨膜结构域、信号肽序列进行预测;采用MEGA 7.0软件对不同物种来源的TAK1蛋白进行多序列比对并构建系统进化树。采用实时荧光定量PCR检测细粒棘球绦虫在不同发育阶段TAK1基因mRNA的相对表达量。结果EgTAK1基因ORF全长1116 bp,编码371个氨基酸,理论等电点为5.97,不稳定指数为49.59,属于不稳定蛋白;脂肪系数为87.22,总平均亲水系数为-0.291,为亲水性蛋白;EgTAK1蛋白含有64个磷酸化位点,3个O-糖基化潜在位点,4个N-糖基化位点;EgTAK1蛋白属于蛋白激酶C类似(PKC-like)家族;无跨膜结构和信号肽,亚细胞可能定位于细胞膜、细胞质及细胞核内。该蛋白含有7个优势B细胞抗原表位,具有良好的免疫原性。二级结构包含34.77%的α-螺旋,5.12%的β-转角,40.97%的无规卷曲,19.14%的延伸链。TAK1蛋白同源序列比对中与多房棘球绦虫的TAK1同源性最高为83%。实时荧光定量PCR显示,细粒棘球绦虫在不同发育阶段EgTAK1表达有差异,成虫阶段相对表达量最高。结论基因EgTAK1可能是细粒棘球绦虫发育分化的重要调控基因,预测该基因编码的蛋白含有B细胞抗原表位,有可能成为包虫病免疫学预防及药物研制的靶标抗原。     

细粒棘球绦虫EGR＿09314蛋白的生物信息学分析

目的 利用生物信息学的方法预测、分析细粒棘球绦虫EGR＿09314蛋白的结构、功能和生物学特性等,为包虫病分子肽疫苗的筛选奠定基础。方法 从NCBI数据库中下载EGR＿09314基因的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列,利用ORF Finder在线工具分析该基因的开放阅读框;利用Prot-Param预测蛋白的理化性质,PotScale预测其亲水性和疏水性,NetPhos 3.1 Server预测其磷酸化位点,NetNGlyc预测其糖基化位点,GPS-SUMO 2.0预测其棕榈酰化修饰位点;利用SOPMA预测蛋白的二级结构,SWISS-MODEL预测蛋白的三级结构;利用Euk-mPLoc 2.0分析其亚细胞定位,SignalP 4.1Server分析其信号肽位置,TMHMM分析跨膜区域,SMART预测其结构域位置;应用ABCpred和IEDB预测EGR＿09314蛋白的B细胞抗原表位,应用SYFPEITHI和IEDB预测其T细胞抗原表位。结果 细粒棘球绦虫EGR＿09314蛋白是由491个氨基酸组成的亲水性蛋白,其分子式为C₂₄₄₆H₃₈₉₅N<...     

细粒棘球绦虫表面抗原EpC1的生物信息学分析北大核心CSCD

目的采用生物信息学方法分析细粒棘球绦虫表面抗原EpC1的结构和功能等。方法从NCBI数据库中下载EpC1氨基酸序列,采用ProtParam预测蛋白的理化性质,SignalP-5预测信号肽,Euk-mPLoc 2.0进行亚细胞定位,ProtScale、SOSUI、DNASTAR预测其亲疏水性,SOMPA预测二级结构,NetPhos预测磷酸化位点,MotifScan预测修饰位点,Swissmodel预测三级结构,TMHMM分析跨膜区域;运用ABCpred、IEDB预测B细胞抗原表位,SYFPEITHI预测T细胞抗原表位。结果预测EpC1由174氨基酸序列组成,分子式为C_(884)H_(1403)N_(245)O_(268)S_(9),不稳定指数为46.27,为亲水蛋白,无信号肽和无跨膜区,且定位于细胞膜及细胞质中。二级结构中α螺旋占44.25%,β折叠占14.94%,β转角占5.75%,无规则卷曲占35.06%,EgEpC1具有能与HLA-A*02-01的结合能力,且能被HLA-DRB*0401(DR4Dw4)分子呈递。结论生物信息技术分析EpC1蛋白存在多个B、T细胞表位,含有钙结合结构域,可为该蛋白的基因克隆表达及细粒棘球绦虫感染的防治研究提供理论基础。     

绵羊CTLA-4胞外区对细粒棘球蚴EG95抗原的免疫佐剂作用

目的探索绵羊细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)胞外区靶向提呈羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)EG95抗原的可行性。方法用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,插入原核表达载体pET-30a获得融合表达载体pET-IgV;根据蛋白质二级结构分析结果 ,用PCR扩增EG95亲水区编码序列,将串联的3拷贝EG95编码序列分别插入表达载体pGEX-6P-1和pET-IgV,诱导重组大肠杆菌表达并纯化重组蛋白;用相同剂量的GST-3EG95、IgV-3EG95包涵体或可溶性蛋白免疫小鼠,比较EG95抗体的应答水平。结果用RT-PCR扩增得绵羊CTLA-4胞外编码区,IPTG诱导的重组大肠杆菌表达预期的约63kDa GST-3EG95和60kDa IgV-3EG95融合蛋白,两者均能被EG95抗血清识别;经两次免疫后,IgV-3EG95免疫组的EG95抗体水平显著高于GST-3EG95免疫组,可溶性蛋白的免疫效果优于包涵体。结论绵羊CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进细粒棘球蚴EG95抗原的抗体应答水平。