表达IL-33蛋白重组狂犬病病毒的构建及鉴定

目的以狂犬病病毒(RABV)弱毒株SAD为载体,构建表达IL-33蛋白的重组狂犬病病毒株SAD-IL33。方法利用反向遗传学技术,通过Pfl23Ⅱ和NheⅠ位点经酶切连接,将鼠源IL-33基因ORF区插入狂犬病病毒SAD株的伪基因区,获得全长感染性克隆,与辅助质粒共转染BHK-21细胞,拯救重组病毒SAD-IL33,采用RT-PCR、免疫荧光及Western blot鉴定SAD-IL33的生物学特性,并用其感染小鼠,每天观察小鼠体重及精神状态的变化,初步评价其安全性。结果 PCR和测序证实,含IL-33基因的感染性克隆SAD-IL33构建成功;经RT-PCR、免疫荧光及Western blot鉴定,重组病毒SAD-IL33可扩增出1 065 bp的预期条带,同时有RABV G蛋白和IL-33蛋白的特异性荧光,且分子质量单位为70 ku和30 ku,与预期大小一致;SAD-IL33的细胞适应性良好,在BHK-21细胞和Neuro-2a细胞上均能生长,滴度峰值分别为10~(8.345)FFU/ml和10~9FFU/ml,均高于亲本SAD株。将其在BHK-21细胞上连续传代10次,第3～10代的病毒滴度介于10~6～10~8 FFU/ml之间。小鼠感染SAD-IL33后,21 d内体重及精神状态无异常变化。结论成功构建表达IL-33蛋白的重组狂犬病毒SAD-IL33,细胞适应性良好且滴度高,传代稳定,对小鼠无明显影响,为进一步研制安全、高效、廉价的狂犬病预防疫苗奠定了基础。     

狂犬病毒HEP-dG株的拯救

目的筛选免疫原性高、致病性低的狂犬病疫苗候选株。方法应用反向遗传技术,在狂犬病毒弱毒株HEP-Flury株全基因组3'-N-P-M-G-L-5'的假基因区域(G与L之间),插入一个G基因,构建携带双G基因的全长感染性克隆,其与辅助质粒共转染BHK-21细胞,盲传十代,用荧光抗体和RT-PCR鉴定病毒。结果成功获得携带双G基因的狂犬病毒HEP-dG株,该病毒在BHK-21细胞中稳定生长,其病毒滴度达到1010FFU/mL。结论HEP-dG株会为研制高效的狂犬病病毒基因工程口服疫苗提供了良好的疫苗候选株。     

狂犬病病毒HEP-Flury-mEG株的拯救与鉴定

目的拯救狂犬病毒HEP-Flury-mEG株,为疫苗制备奠定基础。方法将ERA株G蛋白333位毒力位点修饰为谷氨酸后替换至HEP-Flury株基因组。重组感染性克隆质粒和4个辅助质粒,共转染BHK-21细胞,拯救重组病毒。结果 IFA鉴定成功拯救出了HEP-Flury-mEG株狂犬病病毒。重组病毒G基因经XholⅠ酶切,片段大小为1 071bp和520bp,与预期结果相符。重组病毒在BHK-21细胞中传代4次,滴度维持在1×107.5 FFU/ml。重组病毒经常规负染后在电镜下为弹状粒子,长度和直径与亲本株一致。结论获得了重组狂犬病毒HEP-Flury-mEG株。该病毒滴度高,形态完整,传代稳定,为进一步研究狂犬病毒病毒的生物学特性和新型基因工程疫苗奠定了基础。     

登革2型病毒NS3蛋白具有抑制病毒复制的作用

目的 构建登革2型病毒非结构蛋白NS3及其结构域基因的真核表达载体, 并鉴定重组蛋白在BHK-21细胞内对登革病毒复制的抑制作用。方法 以登革2型病毒新几内亚毒株(NGC DENV-2)基因组RNA为模板, 设计引物扩增获得编码NS3及其蛋白酶NS3P和解旋酶NS3H的基因, 通过基因重组的方法分别将3段基因片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+), 获得重组表达载体pcDNA3.1-NS3、pcDNA3.1-NS3P和pcDNA3.1-NS3H;经脂质体法分别转染BHK-21细胞后, 用RT-PCR、间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达的蛋白。结果 成功构建pcNS3、pcNS3P和pcNS3H重组质粒, 转染进BHK-21细胞48 h后, 分别检测出相对分子量约为69 kDa、50 kDa及18 kDa的特异蛋白;且转染pcNS3、pcNS3H组均与空白对照组及未转染组间的病毒载量存在着差异(P<0.05);转染pcNS3P组与未转染组及空白对照组的病毒载量无统计学差异(P>0.05)。结论 DENV-2的非结构蛋白NS3能够抑制病毒的复制。     

SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗的构建、筛选、安全性和免疫原性研究

目的 利用穿梭质粒通过同源重组构建表达SARS-CoV-2 RBDEPI蛋白重组痘苗病毒,并对其进行筛选、鉴定和免疫原性检测。方法 参照SARS-CoV-2全基因组序列设计合成目的基因RBDEPI,通过PCR、测序、酶切连接将目的基因插入到痘苗病毒穿梭载体pSTKE中,构建pSTKE-RBDEP。将pSTKE-RBDEPI与天坛株痘苗病毒VTT共转染鼠肾细胞BHK-21中,通过同源重组,并以增强型绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记,通过多次绿色荧光噬斑筛选获得重组病毒rVTT△TK-RBDEPI。利用RT-PCR和Western blot检测rVTT△TK-RBDEPI目的基因的转录和目的蛋白的表达情况;通过ELISA和ELISPOT检测rVTT△TK-RBDEPI免疫小鼠SARS-CoV-2与痘苗病毒载体特异性抗体水平和特异性淋巴细胞IL-4与IFN-γ的表达情况,确定rVTT△TK-RBDEPI的免疫原性。结果 经过10次绿色荧光噬斑筛选、RT-PCR与Western blot鉴定获得1株能够表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒rVTT△TK-RBDEPI,且rVTT△...     

动物狂犬病病毒街毒株的细胞分离鉴定

目的N2A细胞和BHK-21细胞用于我国动物狂犬病流行街毒株的分离培养。方法狂犬病发病动物脑组织悬液首先脑内接种乳鼠,再采取Nonclon Delta Tube内置盖玻片法从鼠脑中进行病毒分离培养,脑组织悬液接种细胞后96h,利用直接荧光抗体实验检测盖玻片上的病毒感染细胞,判定病毒是否在细胞上增殖;通过测定不同毒株细胞培养上清中的病毒滴度对病毒进行鉴定。结果22份狂犬病病犬、猪和牛的脑组织接种乳鼠后均获得了鼠脑分离毒,将鼠脑毒接种N2A细胞分离获得了22株病毒,接种BHK-21细胞却只分离获得20株病毒。不同病毒株第三代细胞培养上清中的病毒滴度从10-1TCID50/100μL到10-3.6TCID50/100μL。结论N2A细胞对狂犬病病毒街毒株的敏感性高于BHK-21细胞,且不同的病毒株对细胞的适应能力不同。实验分离获得的病毒细胞适应株丰富了我国狂犬病病毒毒种资源,为进一步研究不同病毒分离株的抗原性差异奠定基础。     

福建省狂犬病毒街毒株分离鉴定及生物学特性研究

目的 分离福建省狂犬病毒街毒株,了解病毒株的生物学特性。方法 采集疑似狂犬的脑组织,通过细胞培养和乳鼠脑接种分离狂犬病毒,用直接免疫荧光和RT-PCR等方法进行鉴定,并对病毒的分子生物学特性进行研究。结果 从疑似狂犬的脑组织中分离出狂犬病毒,TCID₅₀的测定结果显示,细胞毒滴度不高,病毒株对BHK-21细胞的适应性不强,LD₅₀的测定结果显示,病毒株为狂犬病毒强毒株。结论 从福建省家犬中成功分离到狂犬病毒街毒株,为狂犬病的实验室研究奠定基础。     

犬瘟热病毒M蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的对犬瘟热病毒(CDV)弱毒株M基因进行克隆及原核表达,并制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。方法针对犬瘟热病毒弱毒株(CDV-LP)的M基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)并转化至宿主菌BL21(DE3),在0.4mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化的M蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。结果通过RT-PCR成功扩增出大小为1 014bp的CDV M基因,构建的重组质粒pET-30a(+)-M在大肠埃希菌中诱导表达出分子质量单位为43ku的重组M蛋白,与预期值相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western blot检测显示M重组蛋白能被抗CDV多克隆抗体识别;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应。结论本研究成功构建了pET-30a(+)-M并表达了CDV M蛋白,制备了鼠多克隆抗体,为建立CDV M蛋白的ELISA抗原检测方法,鉴定表达M蛋白的重组杆状病毒奠定了基础。     

伊蚊唾液特异性rAlb-34k2蛋白促进DENV-2早期感染BHK-21细胞作用研究

目的探讨白纹伊蚊特异性rAlb-34k2蛋白与登革病毒(DENV)多种靶细胞粘附后促进DENV-2感染作用。方法 1)采用间接免疫荧光法检测rAlb-34k2蛋白24 h内对DENV-2感染BHK-21细胞的作用。2)Western blot和间接免疫荧光法检测rAlb-34k2蛋白与BHK-21、HepG2、HaCat细胞的粘附作用以及兔抗rAlb-34k2抗体的阻断效应。结果 1)免疫荧光法检测结果显示,热灭活rAlb-34k2蛋白处理组感染比值为0.40±0.023,未灭活组0.54±0.029,差异有统计学意义(P=0.001 1)。2)Western blot和免疫荧光法检测显示rAlb-34k2蛋白与BHK-21、HepG2、HaCat细胞均可发生粘附,且与BHK-21细胞的粘附具有剂量依赖性;特异性抗体不能阻断rAlb-34k2蛋白与BHK-21、HepG2细胞的粘附效应。结论 rAlb-34k2蛋白可与BHK-21等DENV多种靶细胞发生粘附作用,具有介导DENV-2吸附细胞,促进病毒入侵宿主的潜能。     

狂犬病病毒CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中G基因和滴度分析

目的 研究狂犬病病毒CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中的特性。方法 利用RT-PCR反应扩增CTN-1株19个代次的G蛋白基因,获得cDNA进行序列测定;并以免疫荧光法测定各代次毒株在细胞中的滴度。结果 序列测定显示:CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中G蛋白基因序列发生不同程度变异且逐步积累,从第30代开始,G蛋白基因序列趋于稳定。与CTN-1株相比,CTN-1鸡胚细胞驯化株在G蛋白的第147、333、389、421和485位氨基酸发生了突变。与此相对应,CTN-1株鸡胚细胞驯化株滴度逐渐趋于稳定,并于第33-58代滴度维持在10~10^{1 g}细胞荧光转化灶单位/mL左右。G蛋白同源性分析表明,CTN-1株鸡胚细胞驯化株与我国近期不同区域分离得到的街毒株具有较高同源性,其G蛋白氨基酸同源性为89.3%~99.0%。结论 CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中G蛋白基因发生稳定变异,滴度在传代后33-58代达到较高水平,稳定性较好,适于我国狂犬病防治的实际应用。     

浙江省1株犬源狂犬病病毒全基因组序列测定及细胞分离鉴定北大核心CSCD

目的了解浙江地区狂犬病分子流行病学现状,为浙江地区狂犬病防控提供相关数据。方法使用RT-PCR扩增浙江狂犬病病毒街毒株核苷酸并进行全基因组序列测定,与32株中国狂犬病病毒街毒株基因序列进行比对分析;使用Neuro-2a细胞进行病毒分离,测定不同代次全基因组序列并比较核苷酸突变情况。结果获得了全长为11782 bp的全基因组序列,经过比对分析后发现该毒株属于ChinaⅠ型,与全部参考基因Ⅰ型病毒核苷酸序列一致性为97.10%~99.31%;通过Neuro-2a细胞成功分离到狂犬病病毒,连续三代培养后病毒滴度最终达到5.71×10^(7)FFU/mL,子代之间序列一致性在99.9%以上,其中F3代较F1代核苷酸序列发生了7个位点突变,氨基酸未发生改变。结论新狂犬病病毒分离毒株(ZJSX-2021)属于ChinaⅠ型,与以往分离毒株属同一基因型,表明狂犬病病毒近年在浙江地区仍持续传播。细胞分离后病毒序列并无明显变化。     

新型冠状病毒RBD区重组流感病毒的拯救及初步鉴定北大核心CSCD

目的利用流感反向遗传技术,以B型流感病毒B/Yamagata/16/88株作为骨架,表达新型冠状病毒(SARSCoV-2)S蛋白的受体结合域(RBD),构建以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株。方法基因合成新冠病毒参考株S蛋白上的RBD基因片段(318-541aa),对B型流感病毒B/Yamagata/16/88/的NS1片段进行设计改造并插入RBD序列,构建重组质粒NS110-RBD。将NS110-RBD与其余7个骨架株重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞,拯救表达新型冠状病毒RBD区重组流感病毒,对拯救出的毒株进行形态学、分子生物学鉴定及病毒滴度和Western blot检测。结果成功拯救出重组流感病毒株并命名为rIBV-NS110-RBD。PCR鉴定RBD目的基因大小正确,测序表明拯救病毒株的序列正确,在透射电镜下观察到拯救病毒株的病毒粒子具有流感病毒粒子的典型特征。经测定,拯救株rIBV-NS110-RBD在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(5.5) TCID_(50)/ml,在鸡胚上的病毒滴度为10^(6.5) EID_(50)/ml,血凝效价最高达2_(5);Western Blot检测到RBD的表达,其分子质量为35ku。结论成功拯救出高表达新型冠状病毒RBD蛋白的高血凝效价的重组流感病毒株,该病毒具有流感病毒粒子的典型特征,为以B型流感病毒为载体作为新型冠状病毒疫苗的研发提供了新思路。     

乙型脑炎病毒NS3蛋白对病毒增殖及毒力的影响

目的探讨乙型脑炎病毒NS3蛋白对病毒增殖及毒力的影响。方法利用感染性克隆技术构建以乙脑病毒疫苗株为骨架,用野毒株NS3替换疫苗株相应区域的病毒感染性克隆,体外转录获得RNA,再通过电转染BHK-21细胞拯救病毒,通过噬斑试验、免疫荧光试验和测序鉴定病毒,通过生长曲线、CCK-8检测和动物试验观察和评价嵌合病毒的增殖能力和神经毒力。结果酶切和测序表明JEV(V)/NS3(W)嵌合病毒感染性克隆构建成功,并经病毒测序和免疫荧光试验证实成功拯救病毒;蚀斑实验显示:嵌合病毒蚀斑直径(2.92±0.08)mm大于JEV SA14-14-2疫苗株蚀斑直径(1.90±0.10)mm(P0.01),与野毒株SA14噬斑直径(2.96±0.13)相似(P0.05);生长曲线显示,用M.O.I=0.01接种BHK21细胞后,嵌合病毒48 h达到滴度高峰(8.9 log10PFU/mL);接种BHK21细胞72 h后,CCK-8显示:嵌合病毒组细胞的增殖活性(24.9±1.3)%低于疫苗组(41.4±1.8)%(P0.01),高于野毒株组(17.7±0.5)%(P0.01),但动物试验显示嵌合病毒神经毒力(LD_(50)=124.5 PFU/0.02 ml))弱于疫苗株(LD_(50)=7.7 PFU/0.02 ml)。结论乙脑病毒NS3蛋白对病毒的增殖和毒力均有一定影响,但体内和体外实验结果存在差异。     

人细小病毒B19非结构基因ns1和7.5ku蛋白基因的克隆与表达

目的通过分子克隆技术,构建人细小病毒B19非结构基因ns1和7.5kugene的原核表达载体,并诱导重组NS1和7.5ku融合蛋白的表达,为蛋白的纯化奠定基础。方法以含有B19病毒全基因组感染性克隆为模板,用PCR法扩增目的基因ns1和7.5kugene,以pET-28a为表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ns1和pET28a-7.5ku,转化E.coliBL21(DE3),获得重组工程菌株。经IPTG诱导培养6h后,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。结果成功构建了pET28a-ns1和pET28a-7.5ku,IPTG诱导能获得较高的目的蛋白。结论人细小病毒B19的非结构基因能在大肠埃希菌中获得成功的表达,为蛋白的纯化和抗体制备奠定基础。     

人IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组BCG的构建与表达

目的构建并鉴定人IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组BCG(卡介苗)。方法利用RT-PCR从EB病毒阳性的B95-8细胞中获得去除致癌部分的LMP1基因,与扩增的IL-2通过overlap-PCR扩增获得融合基因。将融合基因连接到穿梭表达质粒pMV261,进行酶切、PCR及测序鉴定。重组质粒经电转导入BCG,通过Western blot鉴定目标抗原在rBCG中的表达。结果 PCR扩增获得453bp IL-2和1 225bp LMP1,利用overlap-PCR获得1 623bp的融合基因,通过电转仪将重组质粒导入BCG感受态细胞,构建的重组质粒能够在BCG中表达相对分子质量为5.7×104的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被兔IL-2单抗及鼠LMP1单抗识别。结论构建的rBCG能稳定表达融合蛋白,为rBCG的抗肿瘤作用和抗肿瘤疫苗的研发奠定了基础。     

SARS病毒Spike蛋白重组腺病毒疫苗的构建及其免疫学分析

目的构建基于sARS病毒Spike（S）蛋白的重组腺病毒,并对该重组腺病毒进行初步鉴定和免疫学探讨。方法通过全基因合成得到全长S蛋白基因,利用Ad5腺病毒系统构建S蛋白基因的重组腺病毒,采用间接免疫荧光（IFA）试验和蛋白免疫印迹法（Western blot）对S蛋白的表达进行鉴定,再用重组腺病毒免疫小鼠,观察小鼠抗体诱生情况,从而对该重组腺病毒的免疫效果进行初步评价。结果PCR扩增重组腺病毒质粒外源片段,大小为800bp,与预期值一致;Western blot和IFA结果表明,重组腺病毒（rAd-S）表达S蛋白能被马抗SARS血清识别;ELISA检测结果显示,rAd-S能刺激小鼠机体产生抗体。结论重组腺病毒系统成功表达了SARS病毒S蛋白,免疫小鼠产生S蛋白特异的抗体。     

慢病毒介导的重组人α1-抗胰蛋白酶在小鼠体内的表达

目的:构建重组人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)因子的慢病毒表达载体,并通过体外细胞水平和小鼠体内分析其表达情况.方法:通过RT-PCR的方法扩增出hAAT基因的编码序列,并构建重组慢病毒质粒;经体外包装后,感染鼠成纤维细胞及注射小鼠.荧光显微镜下观察GFP的表达情况,同时对收获的细胞及感染小鼠的肝脏或血浆进行Western blot、ELISA检测.结果:获得重组hAAT因子的慢病毒表达质粒pLVX-ser;包装后得到8×106TU/mL滴度的慢病毒颗粒.通过荧光显微镜下观察,显示重组hAAT因子在成纤维细胞中正常表达;对小鼠尾静脉注射病毒之后,进行hAAT因子检测,Western blot结果说明hAAT因子在小鼠体内成功表达;通过ELISA检测发现hAAT在小鼠体内的表达平均达190g/L左右,而且在慢病毒的介导下hAAT在小鼠中的表达可持续3mo以上.结论:重组慢病毒载体可高效、持续表达hAAT因子,为通过基因工程生产重组hAAT因子以及为α1-AT缺乏症的基因治疗奠定基础.     

不同型别登革病毒融合外膜基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建登革病毒1型和2型外膜蛋白(E蛋白)DⅢ区融合基因的重组腺病毒,在BHK-21细胞中表达。方法用PCR法扩增登革病毒1型和2型EDⅢ基因,依次克隆入pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCDNA-D1/D2EDⅢ。以此为模板,扩增包含CMV启动子-D1/D2EDⅢ-BGHpA的表达片段,与pENTR4载体连接形成质粒pENTR4-D1/D2EDⅢ,与pAd/PL-DEST进行体外同源重组,形成重组腺病毒载体pAd-D1/D2EDⅢ,在293A细胞系中包装成具有感染性的重组腺病毒,进一步感染BHK-21细胞,用间接免疫荧光法和Westernblot法检测重组蛋白在细胞中的表达情况。结果重组腺病毒构建成功,转染293A细胞后获得2×109pfu/mL滴度的重组腺病毒,感染哺乳动物细胞后能够表达1型和2型EDⅢ区目的蛋白。结论不同型别融合基因的重组腺病毒表达载体能有效地表达相应型别的目的蛋白,为进一步构建单一的四价重组腺病毒应用于登革疫苗研究奠定基础。     

II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。