重组人促红细胞生成素对大鼠视网膜神经节细胞的影响

目的：观察重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存活及其轴突生长的影响,检测作为神经再生标志的生长相关蛋白43(growth associated protein 43, GAP-43)的表达情况,并探讨rhEPO对RGCs可能的作用机制。

方法：RGCs分为实验组(rhEPO组)和对照组(DMEM组)行体外培养,倒置显微镜下观察细胞和轴突生长情况,培养72h测量细胞最长突起长度进行比较,行GAP-43的Western-blot检测,图像分析系统对两组标本进行灰度值测量。

结果：培养72h的RGCs倒置显微镜下观察,形成典型的细胞突起,rhEPO组的细胞比对照组胞体更大,突起更长(P<0.05)。培养72h的RGCs行GAP-43 Western-blot检测,DMEM组GAP-43呈阳性表达,rhEPO组呈强阳性表达,两组差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：rhEPO能够促进体外培养的RGCs轴突生长,能够上调体外培养的RGCs的GAP-43蛋白表达水平,可能是其能够促进RGCs轴突生长的原因。     

黄连素对高糖培养下大鼠视网膜Müller细胞增殖的影响

目的：研究黄连素对体外高糖环境下的SD大鼠视网膜Müller细胞增殖的影响。

方法：采用酶消化法原代培养SD大鼠视网膜Müller细胞,将第2代Müller细胞随机分为正常糖浓度(5mmol/L)组、高糖浓度(25mmol/L)组、高糖+不同浓度(5、10、25、50、100μmol/L)黄连素组,分别培养24、48、72h后,采用CCK-8法检测细胞增殖活性。

结果：培养24、48、72h时,高糖浓度组Müller细胞吸光度值较正常糖浓度组明显降低(均P<0.01); 10、25、50、100μmol/L黄连素组细胞吸光度值较高糖浓度组明显升高(均P<0.05),且呈剂量依赖性; 5μmol/L黄连素组细胞吸光度值与高糖浓度组无明显差异(P>0.05)。

结论：黄连素在一定程度上能够减轻高糖对Müller细胞增殖活性的抑制作用,其作用强度与黄连素浓度呈正相关。     

水蛭提取液对人视网膜母细胞瘤细胞的抑制作用

目的：研究水蛭提取液对人视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞的抑制作用。

方法：采用不同浓度水蛭提取液(0.02、0.04、0.08、0.16U/mL)作用于体外培养的WERI-RB-1细胞0、24、48、72h,经CCK-8法筛选最佳药物干预浓度和时间进行后续实验。将体外培养的WERI-RB-1细胞分为对照组(正常培养基培养)和实验组(含水蛭提取液培养基培养),采用流式细胞仪检测药物对细胞周期和细胞凋亡的影响,Transwell侵袭实验检测药物对细胞侵袭能力的影响。

结果：根据CCK-8法检测结果选择0.04、0.08U/mL水蛭提取液作用48h为最佳干预条件进行实验。水蛭提取液干预的细胞主要阻滞在G2/M期,其中0.04、0.08U/mL实验组处于G2/M期的阳性细胞率分别为(12.59±5.36)%、(14.79±4.12)%,均明显高于对照组\〖(3.00±2.32)%,P<0.01\〗。水蛭提取液可诱导细胞凋亡,其中0.04、0.08U/mL实验组细胞凋亡率分别(37.91±3.44)%、(33.05±2.25)%,均明显高于对照组\〖(4.64±2.56)%,P<0.01\〗。Transwell侵袭实验检测结果显示,实验组Transwell小室下细胞数明显少于对照组,表明水蛭提取液能够抑制细胞侵袭。

结论：水蛭提取液在体外实验中能够抑制人视网膜母细胞瘤细胞的增殖、侵袭,并诱导细胞凋亡。     

视网膜血管内皮细胞高糖模型糖浓度及培养时间的筛选

目的:筛选Wistar大鼠视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells,RVEC)高糖模型糖浓度及培养时间.方法:取出生1～3d的Wistar大鼠,分离RVEC进行原代培养,Ⅷ因子抗体免疫组化鉴定细胞;设立葡萄糖浓度0mmol/L为正常对照组(C组),按不同葡萄糖浓度依次分为10mmol/L(A组)、15mmol/L(B组)、25mmol/L(D组)、35 mmol/L(F组),分别在24、48、72h的3个时间点用MTT法检测各组细胞OD值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.结果:RVEC纯度达94％;MTT法检测不同浓度葡萄糖对Wistar大鼠RVEC的影响:培养24h,各组的OD值比较差异无统计学意义(F=0.42,P=0.7411);培养48h,五组OD值比较差异有统计学意义(F=45.2,P=0.000),五组间两两比较,除A组、B组、C组间差异无统计学意义外(Q48AB=44.0427,Q48AC=36.4701,Q48BC=27.7953,均P＞0.05),其余各组两两比较差异均有统计学意义(其中Q48CF=11.0715,Q48AF=14.0794,Q48AF=12.2964,Q48BD=23.4698,Q48BF=12.7016,Q48DF=10.2013,均P＜0.05;Q48CF=6.4701,P＜0.01).培养72h后,五组OD值比较差异有统计学意义(F=37.46,P=0.000),五组间两两比较,同样A、B、C三组间差异无统计学意义(Q72AB=27.7338,Q72AC=25.0054,Q72BC=33.3797,均P＞0.05),其余各组差异均有统计学意义(其中Q72AD=13.4793,Q72BD=12.7546,均P＜0.05;Q72CD=7.3743,Q72Cr=8.3465,Q72AF=4.7455,Q72BF=3.9471,Q72DF=3.2649,均P＜0.01).不同浓度葡萄糖在不同时间点对RVEC凋亡率的影响:培养24h后各组间差异无统计学意义(P＞0.05).培养48h后,五组间两两比较,Q48AB=31.1704,Q48AC=33.5947,Q48BC=29.3968,Q48AD=30.4097,Q48BD=28.8164,均P＞0.05;Q48CF=12.5032,Q48AF=11.7531,Q48BF=14.1076,Q48DF=13.9372,均P＜0.05;Q48CF =7.0953,P＜0.01.培养72h后,五组间两两比较,Q72AB=26.3392,Q72AC=24.9142,Q72BC=30.2976,均P＞0.05,其余各组差异均有统计学意义(其中Q72AD=14.1983,Q72BD=12.9356,均P＜0.05;Q72CD=6.8752,Q72CF=7.6745,Q72AF=5.0545,Q72BF=4.0741,Q72DF=3.8876,均P＜0.01).结论:葡萄糖浓度为25mmol/L培养48h是RVEC高糖模型最佳葡萄糖浓度及干预时间.     

N—甲基—D—天门冬氨酸和地塞米松对体外培养鼠视网膜神经节细胞凋亡作用观察

目的:研究N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate NMDA)及地塞米松对体外培养视网膜神经节细胞(RGCs)的作用。方法:出生1～3天Sprague-Dawley(SD)乳鼠做体外RGCs培养。NMDA按20～500μmol/L加入两组混合培养的RGCs中,24小时后一组用Hochest33258检测凋亡细胞。另一组加0.4%台盼蓝,计数拒染细胞,并算出细胞存活率。地塞米松按1×10~(-4)、1×10~(-5)及1×10~(-6)mol/L分别加入混合培养及纯化培养的RGCs中,对照组不加,24小时后用Hochest33258检测凋亡细胞。结果:混合培养RGCs经不同浓度NMDA处理均可见明显的凋亡细胞形态学改变。对照组则不明显。而且其中细胞的存活率与NMDA浓度呈反相关。不同浓度地塞米松处理混合培养RGCs,经Hochest33258检测均未发现有凋亡形态学改变。而纯化培养RGCs实验组及对照组均有明显凋亡细胞形态学改变。结论:NMDA对体外混合培养RGCs有诱导细胞凋亡的作用;地塞米松则对培养RGCs无诱导细胞凋亡作用。纯化的RGCs生长24小时,不加神经营养因子Neurotrophic Factors(NTFs)有细胞凋亡的形态学改变。眼科学报1999 15:65—69。     

高糖诱导的人晶状体上皮细胞葡萄糖关键代谢酶的表达

目的：探讨葡萄糖关键代谢酶在高糖诱导的人晶状体上皮(HLEB3)细胞中的表达情况。

方法：将体外培养的HLEB3细胞分为正常对照组(采用DMEM培养液培养,含葡萄糖5mmol/L)、氧化应激组(采用含H₂O₂ 200μmol/L的DMEM培养液培养)、高糖诱导组(采用含葡萄糖30mmol/L的培养液培养),培养24h后检测细胞凋亡情况和细胞活力及6种葡萄糖关键代谢酶(6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶、柠檬酸合成酶、α-酮戊二酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶)的mRNA表达情况。

结果：高糖诱导HLEB3细胞凋亡,高糖诱导组(63.43%±3.40%)细胞活力低于正常对照组(100.00%±0.00%)和氧化应激组(91.90%±5.11%),且高糖诱导组细胞6种葡萄糖代谢关键酶的mRNA表达水平均低于正常对照组和氧化应激组(均P<0.05)。

结论：高糖可以诱导HLEB3细胞葡萄糖关键代谢酶的表达水平降低,诱导细胞凋亡,影响细胞活性。     

高糖对人视网膜色素上皮细胞神经钙黏连蛋白和纤维连接蛋白表达的影响

目的：体外建立高糖培养人视网膜色素上皮(hRPE)细胞模型,观察高糖条件下RPE细胞神经钙黏连蛋白(N-cadherin)和纤维连接蛋白(fibronectin)的表达变化,探讨高糖对RPE细胞发生上皮间质转化(EMT)的影响。

方法：体外培养hRPE细胞,以60mmol/L的葡萄糖建立高糖模型,实验分对照组(5.5mmol/L的葡萄糖)和高糖24,48,72h组,用免疫组织化学法及Real-time PCR技术检测各组RPE细胞N-cadherin和fibronectin的表达。

结果：高糖组RPE细胞出现排列紊乱,胞体变长变大,高糖72h组最明显。免疫组织化学法检测结果显示：与对照组相比,高糖组RPE细胞N-cadherin表达呈下降趋势; 而fibronectin表达出现并呈升高趋势。Real-time PCR检测结果显示：与对照组相比,高糖组RPE细胞N-cadherin mRNA表达水平在24h时出现下降,72h时降低最明显(F=12.252,P=0.000),24h组与对照组相比差异无统计学意义,48h及72h组分别与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05); 与对照组相比,高糖组RPE细胞fibronectin mRNA表达水平在24h时出现升高,72h时升高最明显(F=50.543,P=0.000),24h组与对照组相比差异无统计学意义,48h及72h组fibronectin mRNA表达水平明显升高,分别与对照组相比差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000)。

结论：高糖条件下RPE细胞上皮标记物N-cadherin表达下调,间质标记物fibronectin表达出现,发生EMT改变,这一现象为探讨增生性糖尿病视网膜病变的发病机制及其防治提供新的思路。     

阿柏西普对体外培养的视网膜Müller细胞膜离子通道的影响

目的：探讨阿柏西普对体外培养的高糖环境下视网膜Müller细胞膜K⁺通道的影响。

方法：人Müller细胞分为3组：对照组(常规DMEM培养基培养)、高糖组(高糖DMEM培养基培养)、实验组(高糖DMEM培养基和100μmol/L 阿柏西普处理)。采用荧光探针检测细胞K⁺浓度,MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot法检测Müller细胞caspase-3蛋白水平。

结果：Müller细胞培养48h后呈现谷氨酰胺合成酶(GS)阳性,纯化度在90%以上。荧光检测显示对照组、高糖组、实验组K⁺相对浓度分别为(2.14±0.44)%、(23.11±4.39)%、(5.20±0.92)%,细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(73.24±4.13)%、(85.22±5.33)%,细胞凋亡率分别为(5.03±1.91)%、(26.73±3.14)%、(16.63±2.73)%(均P<0.05)。 与对照组相比,高糖组Müller细胞内caspase-3蛋白水平显著上升(P<0.05); 与高糖组Müller细胞相比,实验组Müller细胞内caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)。

结论：阿柏西普可抑制体外培养的高糖环境下视网膜Müller细胞膜K⁺通道,抑制高糖诱导的Müller细胞凋亡,降低caspase-3蛋白表达水平,促进细胞增殖。     

橙皮苷对翼状胬肉成纤维细胞增殖及cyclin D表达的影响

目的：评价橙皮苷对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)增殖的抑制作用及对周期蛋白D(cyclin D)表达的影响。

方法：将人翼状胬肉新鲜组织进行体外贴壁细胞常规培养,并采用免疫荧光染色法进行鉴定。通过MTT法检测不同浓度丝裂霉素C(MMC)(1.5、7.5、30.0μmol/L)和橙皮苷(24、48、64、72、96、120μmol/L)作用不同时间(24、48、72h)对细胞增殖的抑制,筛选适宜的作用浓度和时间。采用Western blot法检测cyclin D在HPF细胞中的相对表达量。

结果：分别采用48、72μmol/L橙皮苷和7.5μmol/L MMC作用于HPF细胞48h,Western blot检测结果显示,空白对照组(正常培养)、MMC组、48μmol/L橙皮苷组、72μmol/L橙皮苷组细胞cyclin D蛋白相对表达量分别为1.20±0.02、0.60±0.03、0.54±0.02、0.45±0.07(F=73.025,P=0.001),MMC组和橙皮苷组细胞cyclin D蛋白相对表达量均低于空白对照组(P<0.05),但MMC组和橙皮苷组(48、72μmol/L)细胞cyclin D蛋白相对表达量均无差异(P>0.05)。

结论：橙皮苷能抑制翼状胬肉HPF细胞增殖,该过程与其降低cyclin D的表达有关。     

高糖对原代培养的视网膜神经节细胞中Toll样受体4表达的上调作用及其意义

背景 研究发现糖尿病性视网膜神经病变的发生早于糖尿病视网膜病变(DR),视网膜神经节细胞(RGCs)的损伤是DR的早期特征性改变.研究表明,Toll样受体4(TLR4)在糖尿病大鼠视网膜中呈高表达,但TLR4与糖尿病性RGCs损伤的关系尚不明确. 目的 研究高糖对原代培养的大鼠RGCs中TLR4表达的影响,为糖尿病性视网膜神经病变的预防和治疗以及靶向药物研究提供依据. 方法采用木瓜蛋白酶消化法从出生后1 ～3d的SPF级大鼠视网膜中分离RGCs并进行纯化培养,采用免疫荧光技术检测RGCs特异性标志物Brn3a的表达以鉴定培养的细胞.将培养的细胞分为正常对照组及10、20、30 mmol/L葡萄糖组,分别于不同浓度葡萄糖培养后24 h及48 h收集细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定RGCs中TLR4 mRNA及其蛋白的相对表达量.结果 细胞接种后贴壁生长并呈近圆形,纯化培养后24 h细胞体积逐渐增大且呈聚集样岛状生长,可见突触和轴突.培养的细胞中Brn3a为阳性表达.葡萄糖培养后24 h岛样细胞群周边细胞轮廓不清,反光弱,葡萄糖培养后48 h部分细胞内结构消失,仅残留细胞轮廓,可见大量细胞碎片.细胞培养后24 h,10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4 mRNA相对表达量分别为0.945±0.237、1.180±0.193和0.827±0.213,培养后48 h分别为1.509±0.422、2.433±0.617和1.435±0.410,均明显高于正常对照组的0.600±0.099和0.724±0.302,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞培养后24 h,10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4蛋白相对表达量分别为0.442±0.147、0.626±0.128和0.330±0.153,培养后48 h分别为0.464±0.121、0.930±0.441和0.394±0.158,均明显高于正常对照组的0.090±0.050和0.094±0.070,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 高糖环境下大量体外培养的RGCs细胞内结构消失,同时细胞中TLR4表达量上调,提示RGCs中TLR4的过量表达可能与高糖诱导的RGCs损伤有关.     

Wistar大鼠视网膜神经元高糖模型葡萄糖浓度和培养时间的筛选

目的　筛选Ｗｉｓｔａｒ大鼠视网膜神经元高糖模型的葡萄糖浓度及培养时间。方法　取出生１～３ｄＷｉｓｔａｒ大鼠分离视网膜神经元进行传代培养,尼氏染色法鉴定细胞;实验分５组:Ａ组培养液葡萄糖浓度为０ｍｍｏｌ·Ｌ－１（正常对照组）,Ｂ组浓度为１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１,Ｃ组浓度为１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１,Ｄ组浓度为２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１,Ｅ组浓度为３５ｍｍｏｌ·Ｌ－１。分别培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ后用ＭＴＴ法检测各组细胞ＯＤ值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果　倒置显微镜观察分离培养细胞,大部分细胞于接种２４ｈ后贴壁,少数细胞长出较短的突起,并有向中央聚集生长的现象。２～３ｄ后长出突起的神经元数目增多,突起长度增加,约为自身胞体长度的１倍。培养５～７ｄ后神经元突起进一步增多、变长。经尼氏染色后细胞质呈蓝紫色,尼氏小体颗粒状结构清晰。非神经元细胞胞质基本不着色,细胞核呈淡紫色、圆形,核仁清晰可辨,神经元率达９１％。各实验组在培养２４ｈ后ＯＤ值均低于正常对照组,但差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。随培养时间延长ＯＤ值继续下降,４８ｈ后各组ＯＤ值比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）;其中Ｂ组及Ｃ组与Ａ组比较差异无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）;Ｄ组ＯＤ值明显下降,与Ａ组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）,Ｅ组下降更明显,与Ａ组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。７２ｈ后各组ＯＤ值比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）;其中Ｂ组及Ｃ组与Ａ组比较差异无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）;Ｄ组及Ｅ组与Ａ组比较差异有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。各组在培养２４ｈ后视网膜神经元凋亡率差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。４８ｈ后各组凋亡率比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）;其中Ｂ组及Ｃ组与Ａ组比较差异无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）;Ｄ组凋亡率明显升高,与Ａ组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）;Ｅ组凋亡率升高更明显,与Ａ组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）,且与Ｄ组比较亦有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。７２ｈ后各组凋亡率比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）;其中Ｂ组及Ｃ组与Ａ组比较差异无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,Ｄ组及Ｅ组与Ａ组比较差异有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。结论　葡萄糖浓度为２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１培养４８ｈ是视网膜神经元高糖模型最佳葡萄糖浓度及干预时间。     

Effects of glycogen synthase kinase-3β on retinal ganglion cells under pressure in vitro

Objective To investigate the activity of glycogen synthase kinase-3β (GSK3β) on retinal ganglion cells (RGCs) under pressure, and the effect of GSK3β on the survival of RGCs.Methods This was an experimental study. Rat RGCs were mixed cultured in vitro and then divided into RGCs control group, RGCs pressure only group (60 mmHg of pressure cultivated for 24 hours),RGCs pressure group treated with 10 mmol/L lithium chloride (Licl, inhibitor of GSK3β) and RGCs pressure group treated with 20 mmol/L lithium chloride. Phospho-Ser9-GSK3β (pS9-GSK3β) was observed by immunocytochemical staining. Meanwhile, MTT method test optical density (OD) value to reflect the activity of RGCs of each group. The data for all groups were analyzed by an one-way ANOVA. Results Compared to the RGCs control group [mean optic density (MOD) was 0.085±0.023], the pressure only group expressed less pS9-GSK3β (0.057±0.012). However, both Licl treated groups, expressed more pS9-GSK3β (0.081±0.016 and 0.099±0.024) than the pressure only group.Meanwhile, as the concentration of Licl increased, the higher levels pS9-GSK3β were expressed. Moreover, MTT results showed that the difference of OD value in four groups had statistical significance (F=14.539, P＜0.05). OD value of pressure only group (0.109±0.016) was significantly lower than control group (0.135±).015) (P＜0.05), and RGCs viability was reduced. Compared to the OD value of the 20 mmol/L Licl treated group (0.159±0.014), the pressure only group showed lower OD value (P＜0.05), and the viability of RGCs increased. Conclusion The reduction of pS9-GSK3β in RGCs under pressure prompts GSK3β to be activated, so the viability of RGCs is lower than that of normal RGCs.However, Licl, as the inhibitor of GSK3β, maybe have the ability to protect RGCs from apoptosis.     

糖原合酶激酶3β对体外加压培养下的视网膜神经节细胞的作用

目的研究体外加压培养的视网膜神经节细胞（RGCs）中糖原合酶激酶313（GSK313）活性变化及其对RGCs存活的影响。方法实验研究。混合培养大鼠RGCs,分为RGCs无加压对照组、单纯RGCs加压组（60mmHg压力下培养24h）、RGCs加压＋10mmol／L氯化锂（Licl,GSK313抑制剂）组和RGCs加压＋20mmol／LLicl组。采用免疫荧光法检测RGCs中磷酸化丝氨酸9位点GSK3β（pS9．GSK3[3）的表达情况;以MTr法检测吸光度（OD）值反映RGCs活性。对数据进行单因素方差分析。结果加压组pS9．GSK313表达的荧光密度平均光密度（MOD）值为0．057＋0．012,较对照组（0．085＋0．023）低．而加压＋10mmol／LLiel组和加压＋20mmol／LLicl组pS9．GSK3β表达的荧光密度（分别为0．081±0．016和0．099±0．024）均较加压组大,且随着Licl浓度的增加,pS9．GSK3β表达的荧光密度增大。MTT结果显示,4个实验组的OD值差异有统计学意义（F=14．539,P〈0．05）。加压组OD值（0．109±o．016）较对照组（0．135±o．015）低（P〈0．05）,细胞活性较低;而加压＋20mmol／L Licl组中OD值（0．159±0.014）．014）较加压组高（P〈0．05）,细胞活性较高。结论压力培养下,视网膜神经节细胞中pS9．GSK3β表达减少,提示GSK3β活性增强,RGCs活性降低。Licl作为GSK313的抑制剂,可能对RGCs有保护作用。     

hsa_circ_0005699在高糖培养的人视网膜血管内皮细胞中的表达

目的 检测在高糖培养条件下人视网膜血管内皮细胞中hsa_circ_0005699的表达,为糖尿病性视网膜病变发病机制研究提供新的线索.方法 人视网膜血管内皮细胞分为低糖组(L组)、高渗对照组(C组)和高糖组(H组),设置低糖组中糖浓度为5.5mmol/L,高渗对照组中葡萄糖浓度为5.5mmol/L,甘露醇浓度为19.5...     

高糖对人角膜上皮细胞创伤修复中Cyclin D1 蛋白表达的影响

目的： 研究高糖环境对人角膜上皮细胞损伤修复的影响,初步探讨Cyclin D1蛋白在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中表达的意义。

方法： 模拟糖尿病角膜病变的高糖微环境,人角膜上皮细胞经复苏、培养传代后,分别设置等体积蒸馏水的DMEM完全培养基的正常对照组和含25mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基高糖处理组的两组细胞,细胞长满后进行划伤刺激,倒置相差显微镜下观察比较各组细胞生长状况及其变化,于不同时间点(0、12、24、48和72h)利用Western blot检测分析高糖培养的角膜上皮细胞中Cyclin D1蛋白的表达,qRT-PCR检测Cyclin D1 mRNA水平相对表达情况。

结果： 体外高糖处理条件下,人角膜上皮细胞划伤后修复速度减慢,漂浮细胞增多,细胞重新贴壁少,细胞间距增加,随着高糖处理时间的延长,细胞状态变差,生长速度慢; 正常组细胞损伤修复较快, 细胞密度增大,且形态规则,细胞膜光滑。Western blot 检测划伤刺激上调Cyclin D1的表达,但随着时间延长上调作用呈逐渐减弱,两组Cyclin D1最高表达量均出现在12h。高糖处理组Cyclin D1表达量低于正常对照组。qRT-PCR结果显示：高糖处理后,Cyclin D1 mRNA表达呈上调趋势,但随着高糖处理时间延长,上调作用减弱,且在48h处mRNA水平恢复至与对照组同一水平。

结论： 在角膜上皮细胞创伤愈合过程中,高糖呈负性调节,抑制Cyclin D1蛋白的表达,且与角膜上皮细胞增殖能力下降及凋亡相关。     

外源性趋化因子在高糖环境下对人脐静脉内皮细胞功能的影响

目的:探讨高糖环境下外源性趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能的影响及其机制。方法:将对数生长期的细胞分为对照组(葡萄糖浓度5.5mmol/L)、低糖组(葡萄糖浓度5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度30mmol/L),分别加入CXCL9(100ng/mL)、CXCL10(10ng/mL)、CXCL11(100ng/mL),培养24、48、72h,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,RT-PCR检测CXCR3 mRNA的表达,免疫荧光法检测细胞增殖标志分子Ki-67阳性表达情况。结果:CCK-8法检测结果显示,加入三种外源性趋化因子后,随着时间的延长,对照组细胞吸光度值逐渐增强;低糖组细胞吸光度值呈现先增强后降低的趋势,48h达到高峰;高糖组细胞吸光度值总体呈降低趋势。RT-PCR检测结果显示,加入三种外源性趋化因子后48、72h,低糖组和高糖组细胞CXCR3 mRNA表达水平均高于对照组,且均较同组24h时升高。免疫荧光检测结果显示,加入三种外源性趋化因子后72h,低糖组与高糖组细胞Ki-67荧光强度降低,高糖组变化更明显。结论:高糖环境下外源性加入CXCL9、CXCL10、CXCL11可使HUVEC细胞活力下降并诱导CXCR3表达增强,且以外源性加入CXCL10、CXCL11配体后,CXCR3表达增幅最高,这可能成为临床干预糖尿病视网膜病变的靶点。     

补肾活血中药血清对缺氧条件下纯化培养视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

背景 糖尿病视网膜病变（DR）的早期损害是高糖和缺氧导致的视网膜神经细胞的结构和功能性损伤.研究表明含补肾活血中药的血清能减轻缺氧和高糖状态下神经兴奋性毒性物质谷氨酸的毒性作用,但是否可提高神经兴奋抑制性物质甘氨酸的释放,从而对视网膜神经细胞发挥保护作用尚不清楚. 目的 探讨补肾活血中药血清对体外缺氧条件下纯化培养的视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用. 方法 采用中药或生理盐水对SD大鼠每日灌胃1次,7d后腹主动脉取血离心过滤提取正常大鼠血清和含补肾活血中药的大鼠血清.体外两步法纯化培养SD乳鼠的RGCs,用免疫荧光染色法对培养的RGCs进行鉴定.将RGCs置于96孔培养板中培养72 h后分为正常对照组（20％正常SD大鼠血清培养）、缺氧组（1.0 mmol/L连二亚硫酸钠培养）、正常中药干预组（20％ SD大鼠含药血清培养）、缺氧中药干预组（1.0 mmol/L连二亚硫酸钠＋20％SD大鼠含药血清干预）.于培养后24、48、72 h用L-8800型全自动氨基酸分析仪测定各组细胞外液中谷氨酸及甘氨酸的质量浓度,用乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒测定各组细胞培养上清液LDH的漏出量.结果 培养的细胞荧光染色阳性.细胞培养24 h,正常对照组谷氨酸、甘氨酸质量浓度和LDH的含量分别为（0.080 5±0.001 0）mg/L、（0.055 4±0.001 5） mg/L及（1 626.03±122.10） μmol/（min·L）,而缺氧组为（0.022 5±0.001 1）mg/L、（0.014 6±0.001 1）mg/L及（1 458.68±94.23） μmol/（min·L）,均明显低于正常对照组,差异均有统计学意义（q=-3.53,P=0.00;q=-2.45,P=0.00;q=-2.98,P=0.02）.细胞培养48 h,缺氧组的LDH含量及甘氨酸质量浓度均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（q=2.55,P=0.01;q=4.48,P=0.00）;细胞培养72 h,缺氧组谷氨酸和甘氨酸质量浓度均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（q=2.45,P=0.00;q=3.72,P=0.00）.细胞培养48 h、72 h,缺氧中药干预组甘氨酸质量浓度为（0.017 4±0.001 5） mg/L和（0.019 2±0.001 2） mg/L,明显高于缺氧组的（0.016 0±0.001 2）mg/L和（0.018 0±0.000 8） mg/L,差异均有统计学意义（q=2.28,P=0.04;q=2.33,P=0.03）.缺氧中药干预组的LDH含量分别为（1 632.94±264.31） μmol/（min·L）和（1 875.00±137.45）μmol/（min·L）,明显低于缺氧组的（1 688.49±112.86）μmol/（min · L）和（2 267.86±175.21） μmol/（min·L）,差异均有统计学意义（q=-2.95,P=0.02;q=-2.35,P=0.00）;细胞培养24、48和72 h,缺氧中药干预组和缺氧组谷氨酸质量浓度的差异均无统计学意义（P=0.55、0.28、0.46）.RGCs中谷氨酸与甘氨酸质量浓度均呈正相关（Kendall、Spearman相关系数分别为0.519和0.696,均P=0.000）.结论 缺氧条件下RGCs中谷氨酸与甘氨酸释放量同步增加,可能是细胞对短期缺氧的自身代偿性反应.补肾活血中药能增强缺氧条件下RGCs中甘氨酸的释放,减少LDH的漏出,从而保护RGCs.     

谷氨酸对视网膜内层神经细胞影响的研究

目的探讨谷氨酸对视网膜内层神经细胞(inner stratum retinal neurons, ISRN)的影响及其毒性作用的量效关系。方法将30只新生小鼠神经层视网膜组织块均匀接种于2块24孔培养板(48孔),将其 分成正常对照组、谷氨酸作用24 h组和正常培养18 h后,谷氨酸继续作用6 h组。培养24 h 后, 将视网膜组织块常规进行切片,HE染色,油镜下观察视网膜神经节细胞层(retinal ganglion cells, RGCs)和内核层(inner nuclear layer, INL)的细胞形态,并分别计算细胞形态正常的RGCs数和INL细胞数 。结果视网膜组织正常培养24 h后,ISRN(RGCs和INL细胞)中可见少数细胞胞核固缩和坏死。谷氨酸作用24 h组：当谷氨酸浓度为2、4 mmol时,ISRN的细胞形态与对照组之间差异无显著性意义(P>0.05);谷氨酸浓度≥6 mmol,视网膜内层形态正常的神经细胞数量明显较对照组减少(P<0.05),且随着谷氨酸浓度的增加,其数量逐渐减少。谷氨酸后6 h作用组：谷氨酸浓度为6 mmol时,INL中形态正常的细胞数量明显较对照组减少(P <0.05),而RGCs层中形态正常的细胞数量与对照组之间差异无显著性的意义(P>0.0 5); 谷氨酸浓度≥8 mmol时,RGCs层和INL中形态正常的细胞数量均较对照组明显减少(P<0. 05)。 结论谷氨酸对离体视网膜内层神经细胞具有毒性作用,其毒性作用呈剂量依赖性。(中华眼底病杂志,2001,17:311-314)