大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景：将生物材料复合细胞因子基因，或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复。目的：观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性。设计：对照观察实验。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。对象：新生SD大鼠5只，雌雄不限。方法：实验于2000—02／09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导人大鼠成骨细胞，并以质粒pcDNA，转染细胞作为对照。转染24h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况。采用G418筛选转染细胞2周，获得阳性细胞克隆，用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况。主要观察指标：链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况。结果：①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果：24h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒，对照组空载体转染细胞腧浆中刚没有棕黄倘．颗粒．说明转基因细胞中转化毕长因子β1 mRNA明显增高。②G418筛选转基因细胞组化检测：G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β表达。结论：利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子，转染后瞬时和筛选2周后，均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达，说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性。     

转化生长因子β1基因修饰成骨细胞复合仿生基质材料治疗骨缺损

背景:通过分子生物学技术与组织工程技术相结合以修复骨缺损,是骨科当前重要的研究方向之一。转化生长因子β1作为重要的骨形成因子,在骨代谢和骨损伤修复中发挥着极为重要的作用。目的:观察转化生长因子β1基因修饰的成骨细胞复合仿生基质材料修复鼠胫骨骨缺损的治疗效果。设计:随机对照实验。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。材料:实验于2003-03/08在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。选用健康SD大鼠20只,雌雄不限,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。方法:将转化生长因子β1基因转染的成骨细胞与涂覆多聚赖氨酸的聚DL乳酸仿生基质材料复合,植入鼠胫骨骨缺损模型,术后摄X射线片和组织学检查观察修复情况。主要观察指标:术后4,8周X线摄片和组织学检查情况。结果:20只SD大鼠均进如结果分析,无脱失。①实验组:4周时X线片可见骨痂形成,组织学观察有类骨组织和新骨形成,成骨细胞贴附于基质材料表面。8周时缺损基本修复,新骨密度与自体骨接近。②对照组:4周时X线片未见骨痂形成,组织学观察没有类骨组织形成,基质材料表面成骨细胞贴附较少,材料腔隙中有大量淋巴细胞浸润。8周时植入材料基本吸收,为纤维组织替代。结论:将分子生物学和组织工程学结合修复骨缺损,获得理想的治疗效果。     

转化生长因子β1基因修饰成骨细胞复合仿生基质材料治疗骨缺损

背景：通过分子生物学技术与组织工程技术相结合以修复骨缺损，是骨科当前重要的研究方向之一。转化生长因子β1作为重要的骨形成因子，在骨代谢和骨损伤修复中发挥着极为重要的作用。 目的：观察转化生长因子βl基因修饰的成骨细胞复合仿生基质材料修复鼠胫骨骨缺损的治疗效果。 设计：随机对照实验。 单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。 材料：实验于2003-03／08在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。选用健康SD大鼠20只，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。 方法：将转化生长因子βl基因转染的成骨细胞与涂覆多聚赖氮酸的聚DL乳酸仿生基质材料复合，植入鼠胫骨骨缺损模型，术后摄X射线片和组织学检查观察修复情况。 主要观察指标：术后4，8周X线摄片和组织学检查情况。 结果：20只SD大鼠均进如结果分析，无脱失。①实验组：4周时X线片可见骨痂形成，组织学观察有类骨组织和新骨形成，成骨细胞贴附于基质材料表面。8周时缺损基本修复，新骨密度与自体骨接近。②对照组：4周时X线片未见骨痂形成，组织学观察没有类骨组织形成，基质材料表面成骨细胞贴附较少，材料腔隙中有大量淋巴细胞浸润。8周时植入材料基本吸收，为纤维组织替代。 结论：将分子生物学和组织工程学结合修复骨缺损，获得理想的治疗效果。     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性

背景:脂肪间充质干细胞在转化生长因子β_1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞.然而,外源性转化生长因子β_1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷.因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β_1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义.目的:探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性.方法:利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β_1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率.结果与结论:重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β_1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β_1 mRNA和蛋白的表达上调.提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒.     

辐射诱发细胞恶性转化时Smad7基因表达对细胞生长抑制效应的调节

背景细胞逃避转化生长因子-β(TGF-β)诱导的对细胞生长、增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制.Smad7是TGF-β信号转导通路的抑制型Smads,它可阻断TGF-β信号在胞浆内的传导,其紊乱是TGF-β信号转导通路紊乱的机制之一.目的研究在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中,Smad7过表达是否可通过抑制TGF-β信号转导通路来拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应.设计自身对照前瞻性研究.地点和对象研究在军事医学科学院放射医学研究所完成.实验对象为永生化人支气管上皮细胞BEP2D及辐射诱发恶性转化的人支气管上皮细胞BERP35T2.干预以外源性TGF-β1作为刺激因子,用Northem blot检测永生化BEP2D及辐射诱发恶性转化的BERP35T2细胞中Smad7基因的表达水平;用Smad7真核表达载体PCISmad7.neo稳定转染永生化及恶性化的人支气管上皮细胞系,筛选G418抗性克隆,用Western blot加以验证.用MTT法检测Smad7基因转染前后TGF-β对永生化及恶性化细胞的生长抑制效应.主要观察指标Smad7转染前后BEP2D及BERP35T2细胞Smad7表达水平及TGF-β1作用于Smad7转染前后细胞的增殖能力变化.结果辐射诱发恶性转化的BERP35T2细胞中Smad7表达水平高于永生化BEP2D细胞,相同浓度的TGF-β1对BERP35T2细胞的生长抑制效应较BEP2D细胞弱;BEP2D和BERP35T2细胞转染Smad7基因后,各筛选到2个稳定表达SMAD7蛋白的细胞克隆,同对照细胞比,TGF-β1对稳定表达Smad7基因的细胞生长抑制能力显著减弱.结论在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中,Smad7基因表达增高,其过表达可降低TGF-β对细胞的生长抑制作用.     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

转化生长因子β1转染骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的:通过转化生长因子β1基因转染大鼠的骨髓间充质干细胞,观察目的基因的分泌情况及干细胞向软骨细胞分化效果,为构建新型的软骨组织工程学种子细胞提供新思路。方法:实验于2005-10/2006-09在中国医科大学细胞生物实验室完成。实验材料:6周龄Wistar大鼠10只,质粒pcDNA3.1-TGF-β1(由吉林大学徐莘香教授惠赠),转化生长因子β1、Ⅱ型胶原小鼠抗大鼠单克隆抗体(Neomaker公司)。实验分组:分为未经转染的骨髓间充质干细胞(未转染组)、转染空载的骨髓间充质干细胞(转染空载体组)和转染转化生长因子β1的骨髓间充质干细胞(转染转化生长因子β1组)。实验方法:①密度梯度离心法和贴壁分离法相结合分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,免疫荧光法检测细胞表面标志。②质粒pcDNA3.1-TGF-β1扩增、提取、鉴定。③转化生长因子β1基因转染骨髓间充质干细胞。实验评估:①四甲基偶氮唑盐法测定筛选后细胞的增殖活性。②Westernblot检测转染后细胞转化生长因子β1和Ⅱ型胶原蛋白表达。结果:①免疫荧光法检测骨髓间充质干细胞:CD29和CD44表达阳性,CD34和CD45表达阴性。②pcDNA3.1-TGF-β1真核表达载体的酶切鉴定:基因测序与GeneBank cDNA序列相符。③转染基因对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响:基因转染后骨髓间充质干细胞的增殖力变强,转染组的细胞增殖力高于未转染组和转染空载体组。④转化生长因子β1表达:转染后的骨髓间充质干细胞较未转染和转染空载体的骨髓间充质干细胞分泌转化生长因子β1蛋白增加。⑤Ⅱ型胶原的蛋白表达:在转化生长因子β1目的基因转染后的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原蛋白表达较未染和转染空载体的骨髓间充质干细胞增强。结论:应用基因转染技术将转化生长因子β1目的基因导入骨髓间充质干细胞中,在蛋白质水平鉴定转染成功,且骨髓间充质干细胞成软骨分化所需的特异性细胞外基质Ⅱ型胶原明显升高,使骨髓间充质干细胞在保持很强的体外传代增殖能力同时,又能产生、表达转化生长因子β1。     

补肾中药密骨片对成骨细胞生长因子转化生长因子β1 mRNA表达的影响

背景:补肾中药密骨片可有效防治骨质疏松,但其具体的药理学机制仍不是很清楚。转化生长因子β1是调节骨吸收与骨形成的重要耦联因子。目的:探讨补肾方对成骨细胞转化生长因子β1mRNA表达的影响。设计:随机分组设计,对照实验。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院骨伤科研究室。材料:实验于2003-05/2004-04在华中科技大学同济医学院附属协和医院中西结合骨代谢实验室完成。动物:选择出生一两天清洁级SD大鼠16只。实验药:密骨片药液在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨伤科研究室制备,主要成分为淫羊藿、杜仲、胡桃肉、干地黄、淮牛膝等;阳性对照药:重组碱性成纤维细胞生长因子由北京邦定公司提供。阴性对照组分为探针阴性对照和抗体阴性对照。方法:将体外分离培养的新生SD大鼠的颅骨成骨细胞加入100,1000,5000,10000mg/L补肾中药密骨片药液及阳性对照药5μg/L重组碱性成纤维细胞生长因子。24h后,利用自行制备的地高辛标记的鼠转化生长因子β1cDNA探针进行成骨细胞的核酸分子原位杂交分析,以其细胞内杂交阳性颗粒的平均光密度值代表转化生长因子β1mRNA的表达水平。在200倍视野下,每组随机选取40个成骨细胞,用TJTY-300型全自动图像分析仪测定细胞内杂交颗粒的平均光密度值(A)。主要观察指标:各组成骨细胞转化生长因子β1mRNA表达。结果:全自动图像分析显示,5000,10000mg/L密骨片药液组的细胞转化生长因子β1mRNA表达分别是阴性对照组的1.18倍和1.30倍,差异有显著性[5000,10000mg/L密骨片药液组、阴性对照组的细胞内杂交颗粒的平均光密度值(A)分别为0.21367±0.01500,0.23703±0.02173,0.18127±0.01528,P<0.05和P<0.01],5μg/L重组碱性成纤维细胞生长因子组的细胞内杂交颗粒的平均光密度值(A)(0.25445±0.02081)虽高于5000,10000mg/L密骨片药液组,但差异无显著性(P>0.05)。结论:补肾中药密骨片可刺激成骨细胞转化生长因子β1的分泌和合成,从而促进骨形成和抑制骨吸收。     

反转录病毒载体介导转化生长因子β_1基因体外转染兔膝关节软骨细胞的表达

背景:将功能基因片段整合到基因载体内,再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内,通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物,在一个较长的时期内保持局部治疗浓度,可修复关节软骨损伤.目的:以重组反转录病毒载体介导转化生长因子β_1体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响.方法:采用胰酶消化法分离培养兔软骨细胞.载体经PLNCX_2 Hind Ⅲ/Not Ⅰ双酶切、去磷酸化后,与载体pDsRed_2双酶切得到大的部分多克隆位点和RFP基因连接,构建PLNCX_2-RFP.转化生长因子β_1基因从PGEMT-TGF中扩增,经双酶切后与PLNCX_2-RFP连接,构建PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.包装反转录病毒载体,并检测病毒上清滴度.将培养的兔膝关节软骨细胞分组转染:对照组(不做任何转染)、转染PLNCX_2组、转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组,持续筛选2周,观察细胞变化.收集稳定转染的细胞上清液,以NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,以ELISA法检测细胞培养上清液中人转化生长因子β_1表达.结果与结论:重组基因PLNCX_2-TGFβ_1-RFP经酶切鉴定测序TGFβ_1、RFP、序列均正确,表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.转染到包装细胞并筛选培养后,病毒滴度为1×10~6CFU.稳定转染软骨细胞后可观察到红色荧光,证明转染成功.持续筛选2周,散在贴壁细胞形成阳性克隆,逐渐弥漫融合,并有细胞簇出现,双核多见,细胞增生活跃.转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组NO浓度高于对照组、转染PLNCX_2组(P<0.05),对照组、转染PLNCX_2组间差异无显著性意义.对照组与转染PLNCX_2组均无转化生长因子β_1表达,转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组转化生长因子β_1质量浓度为(28.08±3.73)ng/L.提示反转录病毒载体PLNCX_2介导的人转化生长因子β_1能有效转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃.     

逆转录病毒载体介导人胰岛素样生长因子Ⅰ在大鼠成肌细胞中的表达及分泌

目的:将经逆转录病毒载体的介导的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因导入大鼠成肌细胞,观察其是否表达,为组织工程人工肌肉体内基因治疗打下基础。方法:实验于2005-10/2006-12在华中科技大学同济医学院协和医院心血管病研究所完成。①实验材料:PLghIGF1SN由本实验室保存,逆转录病毒包装细胞系GP E86购自Clontech公司,包装细胞PT67购自ATCC。②实验方法:选用新生SD乳鼠骨骼肌进行成肌细胞的原代培养,选用新生SD乳鼠心脏进行心肌细胞的培养。通过脂质体2000将人胰岛素样生长因子ⅠcDNA导入逆转录病毒包装细胞PT67,经过G418筛选获取稳定表达病毒的克隆,NIH3T3细胞测定病毒滴度,挑取滴度高的克隆扩增,收取高滴度的病毒上清液,转染成肌细胞。③实验评估:G418筛选转染过的成肌细胞,采用ELISA方法检测其上清液中人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,采用MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性。结果:①病毒滴度的测定:利用不同量的病毒上清感染1×105NIH3T3细胞,并经G418筛选,测得不同PT67克隆的培养上清中,病毒滴度最高为8×105cfu/mL。②ELISA方法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达:在转染后大鼠成肌细胞分泌的上清液中可以检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,经过G418筛选2周后,收集培养液,人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度最高在40μg/L,总量可以达到(150～200)ng/2×106/d。未转染成肌细胞组人胰岛素样生长因子Ⅰ浓度约在0.3μg/L。③MTT法检测人胰岛素样生长因子Ⅰ的生物学活性:转染的成肌细胞培养上清液刺激心肌细胞后,心肌细胞活力明显增加。结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因可在鼠成肌细胞内稳定表达并具有生物学效应,可用于心血管系统基因治疗的研究。     

转化生长因子-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：针对转化生长因子-β（TGF-β）Ⅱ型受体基因的不同部位，构建不同TG-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA（shRNA）表达质粒载体，在转录后水平抑制TGF-βⅡ型受体的表达，对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法：用DNA重组技术将针对人TGF-βⅡ型受体基因不同部位所设计的4对shRNA序列克隆到真核表达质粒pSilencer^TM 3．1-H1 neo vector中，构建TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-β R ⅡshRNA1、2、3、4。脂质体介导转染成人原代成纤维细胞，经G418筛选抑制TGF-βⅡ型受体表达的稳定细胞克隆。结果：3个TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-βRⅡ shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westem blotting均证实3种shRNA重组质粒中pSilencer^TM3．1-H1—TGF-βRⅡshRNA2可明显降低细胞内TGF-βⅡ型受体mRNA峰度及TGF-βⅡ型受体蛋白表达。结论：成功构建了TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilenceir^M3.1—H1-TGF-βRⅡshRNA1、2、3，并筛选出特异而高效的阻断TGF-βⅡ型受体表达的克隆。此实验结果为进一步研究TGF-βⅡ型受体蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

外源Smad7转染肝星状细胞及对转化生长因子β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

背景:Smad7是转化生长因子β信号转导途径的主要抑制性蛋白,具有抗纤维化的作用.目的:构建并鉴定大鼠Srnad7真核表达质粒,观察外源Smad7可否有效转染肝星状细胞T6,并进一步研究其对转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平的影响.设计、地点:基因重组及细胞观察实验,于新疆石河子大学医学院第一附属医院完成.材料:pcDNA3.1(+)质粒为课题组保留;大肠杆菌DH5a系石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室所赠;肝星状细胞T6细胞由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供品.方法:采用基因重组技术将Smad7cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建大鼠Smad7真核表达质粒.脂质体介导转染肝星状细胞T6细胞,分为正常对照、空质粒及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞.主要观察指标:反转录-聚合酶链反应法检测各组中Smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平.结果:酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功.Smad7转染组与正常对照组、空质粒组比较:Smad7 mRNA 达显著增加(P<0.01);转化生长因子β、Ⅰ型胶原mRNA表达减少(P<0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P>0.05).正常对照组、空质粒组smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P值均>0.05).结论:大鼠Smad7真核表达质粒构建成功,外源Srnad7转染肝星状细胞T6细胞后可有效表达,并能降低转化生长因子β及Ⅰ型胶原mRNA表达水平.     

pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞的体外表达及体内成骨能力

背景：能否通过病毒或者非病毒载体将骨形态发生蛋白2转导到骨髓基质细胞发挥成骨作用？目的：观察真核表达载体pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞后体外表达，同时将MSC转染后但未筛选兔骨髓基质细胞自体回植入肌组织，利用X线观察其成骨情况。设计、时间及地点：观察对比实验。实验于2004—11／2005-04在辽宁医学院骨科研究室完成。材料：6只成年新西兰大白兔，雌雄不拘，体质量2．0～3．0kg。BMP2抗体为美国Sanaka公司产品，pcDNA3-hBMP2由解放军第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供，限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司。方法：从大肠杆菌提取超纯质粒pcDNA3-hBMP2，从成年兔股骨抽取骨髓，密度梯度分离法分离培养骨髓基质干细胞，将细胞分成4组；A组：pcDNA3-hBMP2转染进行G418筛选；B组：pcDNA3-hBMP2转染未用G418筛选；C组：给予pcDNA3空载体转染；D组：仅加入脂质体转染试剂Fugene 6。主要观察指标：①应用免疫组织化学法检测转染后瞬时表达。②应用免疫组织化学法检测细胞骨钙素表达，分别应用原位杂交法检测细胞Ⅰ型胶原表达。③转染2周后将B组细胞自体回植入兔后腿肌组织中，移植4周后应用X射线观察成骨情况。结果：①pcDNA3-hBMP2成功转染入骨髓基质干细胞内并100％瞬间表达BMP2。②基因转染4周后，A组细胞骨钙素及Ⅰ型胶原表达高于C组及D组。③B组细胞回植肌组织4周后，X射线可显示新骨形成。结论：pcDNA3-hBMP2能安全有效转染兔骨髓基质干细胞，通过其分泌物BMP2来作用诱导细胞加速分化为成骨细胞。     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记.目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞.取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能.结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积.结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

骨痂中转化生长因子-β1基因表达及利用骨痂植骨对术后功能的影响

背景:在骨折愈合过程中,若将骨折端周围的骨痂组织去除,骨折端比较难完全吻合,可以推测这些骨痂组织是人体在修复过程中的必然产物,应该是有益的,拟将这些骨痂做组织学分析和冰冻切片的原位杂交,观察其组织学内容和转化生长因子β1的含量,并做为供骨植于骨折端,了解骨痂植骨在骨折愈合中的作用。目的:通过测定骨痂中的组织学内容和转化生长因子β1的含量来了解延迟手术中骨折端周围骨痂组织的再利用价值。设计:采用骨痂组织原位杂交及随机分组对照的实验。单位:西安交通大学第二医院骨科、台州市中心医院骨科。材料:病例分别选择西安交通大学第二医院骨科和台州市中心医院骨科1994-07/2003-10骨折延迟手术的住院患者51例,在手术中取骨折延迟愈合的骨痂做标本(均已征得患者同意),Dig标记试剂盒购自BoehringerMannheim公司,转化生长因子β1寡核苷酸探针的序列:CTTGCTGTACTGTGTGTCCAA,由DNA合成仪合成,X线计算机系统(CR)购自日本富士公司。方法:在骨折后的2,4,6和8周,在手术中取出少量骨痂做标本,采用不脱钙的骨痂组织做冰冻切片,采用非同位素Dig标记原位杂交,观察转化生长因子β1在骨痂中的基因表达。术中将骨断端清理后,在骨折牢固固定的同时,再将原骨痂植于骨缺损处及骨折周围。对延迟手术的患者分别采用单纯骨痂植骨、髂骨植骨,骨痂加髂骨植骨,经1～4年患者复诊随访,平均1年9个月。主要观察指标:①骨折不同时期骨痂中的组织学内容和转化生长因子β1的含量。②不同植骨方式对骨折愈合时间的影响。结果:参加治疗51例,有7例因死亡和到外地生活而未能进行随访,评定44例,纳入结果分析。①骨痂中转化生长因子β1的基因表达:骨折后第2周,骨折端有少量纤维骨痂,软骨骨痂较多,转化生长因子β1在软骨小岛内的软骨细胞中高表达。骨折后4周左右转化生长因子β1在成骨细胞内表达显著。8周左右大量骨痂生长,并以软骨化骨为主,成纤维细胞、骨痂、成骨细胞、骨小梁越来越多,术后6周转化生长因子β1在各种细胞内的表达消失,但随着骨重建过程增强,8周时骨基质中转化生长因子β1表达又有增高趋势。②不同植骨方式的愈合时间:不同的植骨方式在愈合时间上没有显著性差异。结论:转化生长因子β1在骨愈合的平衡中发挥重要作用,不同阶段骨痂的组织变化和转化生长因子β1量的变化有着必然的联系,骨痂是机体修复和重建的产物,骨痂植骨再利用是一种可行的方法,它对需要植骨的患者可减少其痛苦和损伤。     

下颌骨牵引成骨过程中基因干预对牵引区转化生长因子β1表达的影响

背景:局部基因治疗能促进牵引区新骨的生成,但关于基因治疗后对局部生长因子表达的影响目前尚不清楚。目的:观察电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中转化生长因子β1表达的影响。方法:新西兰大白兔双侧下颌骨截骨后3d开始下颌骨牵引,0.8mm/d,连续牵引7d后,随机分为5组,分别在牵引区注射2μg(0.1g/L)重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、pIRES-hVEGF165、空质粒pIRES及相同剂量的生理盐水。之后施加电穿孔刺激。结果与结论:免疫组织化学染色发现转化生长因子β1主要在细胞胞浆中表达,给药7d时骨端骨细胞、编织骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞呈转化生长因子β1染色阳性;14d时新生成的编织骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞、肉芽组织中的间质细胞、单核巨细胞、多核巨细胞转化生长因子β1染色阳性;28d时转化生长因子β1阳性细胞明显减少。其中注射重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、pIRES-hVEGF165后转化生长因子β1的表达明显多于注射空质粒pIRES及生理盐水(P<0.05或P<0.01)。说明基因治疗能促进转化生长因子β1的表达,促进牵引区细胞基质的形成和新骨生成。