结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的　克隆结核分枝杆菌 (MTB)分泌蛋白ESAT6基因 ,并构建重组表达质粒。方法　根据Genbank中ESAT6基因序列 ,针对其编码区合成引物 ,采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因 ,并连接到T载体 ,然后定向克隆到原核表达质粒pGEX 4T 2 ,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　经双内切酶消化所切下的片段 ,大小与预计相符 ;测序结果证实基因序列正确 ,符合表达框架。结论　成功构建了重组原核表达质粒 pGEX ESAT6。     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白ESAT6基因，并构建重组表达质粒。方法 根据Genbank中ESAT6基因序列，针对其编码区合成引物，采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因，并连接到T载体，然后定向克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 经双内切酶消化所切下的片段，大小与预计相符；测序结果证实基因序列正确，符合表达框架。结论 成功构建了重组原核表达质粒pGEX-ESAT6。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的 对结核分枝杆菌的ESAT-6基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上，经测序反应确定无误后，再将PCR产物与原核表达载体pET42b( )构建表达ESAT-6的重组质粒，将重组质粒先转化人大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行SDS-PAGE电泳。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，其表达的蛋白质相对分子质量为9900。结论 目的基因克隆到菌株内，重组结核分枝杆菌ESAT-6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础。     

人EGFR胞外段原核表达及免疫原性研究

目的：研究人EGFR胞外段在原核本质的表达，纯化条件以及对小鼠的免疫原性。方法：以既往构建包含人EGFR胞外段基因的表达质粒为基础，采用基因工程方法构建pET原核表达载体。在大肠杆菌中表达目的蛋白，表达蛋白在变性条件下，通过Ni^2 柱亲和层析纯化以包涵体形式存在的His-Tag融合蛋白，SDS－PAGE检测其纯度。去余His-Tag的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。以复性蛋白免疫小鼠获得抗血清，western blotting及流式细胞仪器检测特异抗体的存在。结论：通过限制酶切分析及测序鉴定表明获得了人EGFR胞外段基因的pET原核表达载体，SDS－PAGE分析表明在IPTG诱导下可以表达90Kd目的蛋白其纯度大于95％，所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于A549细胞上的EGFR。提示在大肠杆菌中表达的人EGFR胞外段重组蛋白具有免疫原性，可以进一步用于EGFR免疫研究。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础     

ESAT6在结核病中的最新研究进展

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的人兽共患慢性传染病,是威胁人类的三大传染性疾病之一,目前全世界大约有20亿人感染结核分枝杆菌,每年大约有200～300万的人死于     

日本血吸虫候选疫苗原肌球蛋白的表达载体构建、原核表达及免疫原性研究

目的 将日本血吸虫原肌球蛋白基因(tropomyosin)克隆到原核表达载体pET-28a(+)裁体上,在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中表达其产物,并对其进行免疫原性分析.方法 从日本血吸虫的Expressed Sequence Tag(EST)文库中筛选出包含tropomyosin全长基因的EST,然后用高保真酶PCR扩增,构建到pET-280(+)裁体上,最终在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IFTG)诱导表达.表达的his-tropomyosin融合蛋白用镍螯舍树脂蛋白纯化柱(Ni-NTA resin)亲和层析纯化,得到纯度较高的tropomyosin后,通过Western Blotting技术,用感染日本血吸虫的兔血清作为天然抗体来研究tropomyosi的免疫原性.结果 pET-28a(+)-tropomyosin重组质粒在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中成功表达,使用SDS-PAGE分析得到实际Mr约为40 000的his-tropomyosin融合蛋白,Ni-NTA resin的纯化效果很明显,获得的相对纯的目的 蛋白经过Western BIotting方法 检潮显示:tropomyosin融合蛋白能够与感染日本血吸虫6 w的兔血清有较强的免疫反应.结论 Tropomyosin能够在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中高效表达,且抗原免疫原性强,日本血吸虫感染的兔血清能够识别体外表达的tropomyosin,具有与天然的tropomyosin相同的免疫原性.     

结核分枝杆菌rdESAT-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究

目的构建结核分枝杆菌(MTB)融合基因2×esat-6原核表达载体,利用耻垢分枝杆菌诱导表达、纯化早期分泌抗原ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),Western blot分析其抗原性,并评估其在结核病患者中的血清学诊断价值。方法以DNA疫苗HG856A2为模板扩增2×esat-6基因,构建pMF41-2×esat-6原核表达载体,电转化耻垢分枝杆菌,诱导表达rdESAT-6蛋白,Western blot分析其抗原性。收集126例确诊的结核病患者和42名健康体检者的血清,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和结核斑点金免疫渗滤试验(TB-DOT)检测血清结核抗体,评估rdESAT-6在结核血清学诊断中的价值。结果成功构建了pMF41-2×esat-6重组质粒,以包涵体形式表达了rdESAT-6蛋白,纯化的蛋白纯度在95%以上,可与小鼠抗ESAT-6血清发生特异性反应。126例结核病患者血清检测结果表明,rdESAT-6蛋白在MTB阳性组和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为79.75%(63/79)、61.70%(29/47),好于TB-DOT的62.03%(49/79)、44.68%(21/47)(P0.05)。2种方法对42名健康体检者血清诊断特异性均为95.24%(40/42)。结论 MTB的融合蛋白rdESAT-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性,可作为结核病血清学诊断的优选抗原。     

恙虫病东方体Karp株56-kDa外膜抗原基因片段的原核表达及免疫原性研究

目的探讨恙虫病东方体56-kDa蛋白在大肠埃希菌中的表达及作为诊断性抗原的可行性。方法用PCR扩增恙虫病东方体Karp菌株编码56-kDa蛋白长约1 100bp的DNA,克隆至表达载体pET30a(+)。表达产物经SDS-PAGE、质谱分析及western blot鉴定分析。重组蛋白质纯化后作为包被抗原,用方阵实验确定最佳浓度包被,ELISA法检测其与立克次体目16种成员及10种致病菌阳性血清的反应性。用此重组蛋白质免疫小鼠后制备抗血清,分别用ELISA及间接免疫荧光法(IFA)检测抗血清的效价。结果重组质粒经PCR及测序分析证明,56-kDa外膜抗原的基因片段以正确的读码框连入到pET30a(+)质粒载体中,SDS-PAGE结果表明重组蛋白质在约46-kDa处有表达的目的条带,western blot分析显示该条带可与1∶1 600稀释的兔抗Karp血清反应,证实其具有免疫活性。质谱分析鉴定该蛋白质为恙虫病东方体56-kDa蛋白;方阵滴定确定选择抗原的最佳稀释度为1∶1 600,特异性分析结果表明,重组蛋白质除与查菲埃立克体、嗜吞噬细胞无形体及五日热巴尔通体存在弱交叉反应外,与其他细菌均无交叉反应。IFA及ELISA检测表明抗血清效价可达1∶1 600。结论构建的重组蛋白质可以作为恙虫病东方体快速诊断的抗原。     

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。     

结核杆菌Ag85A重组蛋白的免疫原性研究

目的探讨纯化的结核杆菌Ag85A重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达Ag85A蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定Ag85A重组蛋白的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,Ag85A重组蛋白(10μΜ)能刺激全部12例HL-A*0201阳性(A2 )结核菌素阳性(PPD )健康个体的PBMC发生增殖(平均SI为56.2±3.6);增殖反应明显高于PPD(平均SI为13.7±3.5)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在Ag85A重组蛋白诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μΜ)的T2细胞作为靶细胞,Ag85A重组蛋白诱导的CTL作为效应细胞,Ag85A重组蛋白能诱导全部的12例A2 PPD( )健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(85.2±8.5%),显著高于PPD〔(平均为(21.6±1.7%)〕(P<0.01)诱导的CTL杀伤活性。结论本研究得到的重组优化Ag85A蛋白具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性,为进一步开发有效的结核疫苗打下了基础。     

一种结核杆菌融合抗原的克隆表达及活性测定

目的进一步分析优化结核杆菌抗原优势表位,获得高特异性融合抗原,以满足研制结核病检测试剂的需要。方法用分子生物学软件分析结核杆菌四种抗原MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3的优势表位后,分别插入到pBVIL1载体中,构建表达质粒,并利用pBVIL1载体特点,将其基因连接后,进行融合表达,经纯化获得抗原,用间接ELISA法测其活性。结果各抗原优势肽段及融合抗原均获得了高效表达,融合抗原的特异性和灵敏性均高于各单一肽段。结论此融合抗原可用于研制结核病的诊断试剂。     

Isoniazid induces expression of the antigen 85 complex in Mycobacterium tuberculosis.

Exposure to isoniazid induced the expression of several secreted proteins in Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Two-dimensional gel electrophoresis and immunoblot analyses indicated that two of the prominent isonicotinic acid hydrazide-inducible polypeptides were members of the antigen 85 complex, recently demonstrated to have mycolyltransferase activity. We postulate the existence of an intermediate, whose production is inhibited by isonicotinic acid hydrazide, which plays a negative feedback regulatory role in the metabolism of mycolic acids are revealed by the overexpression of the antigen 85 complex. The approach described here relies on analyses of differential gene expression following exposure to inhibitors and may become a more general tool in dissecting the effects of antimicrobial agents.     

结核分枝杆菌重组Ag85A、Ag85B蛋白免疫原性的研究

目的研究结核分枝杆菌重组Ag85A（rAg85A）和/或Ag85B（rAg85B）蛋白与母牛分枝杆菌菌苗（Mycobacteri-um vaccae,MV）联合免疫的免疫原性。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机分为下列6组：（1）阴性对照组：磷酸盐缓冲液（PBS）组,（2）阳性对照组：卡介苗（BCG）组,（3）阳性对照组：MV组,（4）实验组：rAg85A-MV组,（5）实验组：rAg85B-MV组及（6）实验组：rAg85A-rAg85B-MV组。每2周免疫1次,共免疫3次。末次免疫结束后第14天杀鼠,用ELISA法检测血清中IgGI、gG1和IgG2a水平;ELISPOT检测脾脏分泌γ干扰素（IFN-γ）的T淋巴细胞斑点数;流式细胞术检测全血单个核细胞内Th1和Th2百分比。结果三个实验组小鼠血清抗体水平均明显高于三个对照组（P〈0.001）;三个实验组和两个阳性对照组小鼠的T淋巴细胞斑点数均明显高于阴性对照组（P〈0.05）;rAg85A-rAg85B-MV组小鼠Th1百分比明显高于其余五组（P〈0.001）,三个实验组Th1/Th2比值均明显高于三个对照组（P〈0.05）。结论结核分枝杆菌rAg85A和rAg85B蛋白均具有很强的免疫原性,与MV联合免疫可增强其Th1型细胞免疫应答。     

预防性MPT64和ESAT6疫苗保护力的评价

目的利用BACTEC-960仪分析动物试验模型主要脏器的结核分枝杆菌生长情况,分析结核分枝杆菌MPT64和ESAT6 DNA疫苗预防结核病的效力。方法将BALB/C小鼠随机分成五组,分别用A组生理盐水、B组载体质粒、C组卡介苗、D组重组质粒JW4303-MPT64DNA、E组JW4303-ESAT6DNA免疫9周后,用H37RV结核分枝杆菌强毒株攻击小鼠。分别在攻击一个月后和二个月后观察结果。结果 C、D、E组比B组生长天数总体向后推迟,生长时间明显集中,生长曲峰强度比B组明显减弱,C组肝脏中的感染率比D、E组有所下降。D组肺脏中感染率下降明显。D、E组鼠脾淋巴细胞转化率较C组高,B组明显降低。结论与B组比,小鼠免疫力的短期预防是有所增强,其中卡介苗前期效果明显;MPT64、ESAT6是持续效果好。     

结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38kD-ESAT6-CFP10的构建与抗原性初步检测

目的为了提高结核病诊断试剂的特异性和敏感性,构建了结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38kD-ESAT6-CFP10,并且采用双抗原夹心ELISA方法初步分析了该融合抗原的抗原性。方法运用生物学软件分析抗原优势肽段并模拟其串联后的三维结构,以确保串联后仍保持良好的抗原性。通过PCR方法分别扩增38kD、ESAT-6和CFP40抗原优势肽段基因并将其进行连接,然后将融合基因分别连接入pBVIL1和pGEX-4T-2表达载体,在大肠杆菌菌株DH5α中进行表达。将两种不同载体表达的38kD-KSAT6-CFP10融合抗原分别作为包被抗原和标记抗原,以双抗原夹心ELISA方法初步评价其抗原性。结果获得了38kD、ESAT-6和CFP10的抗原优势肽段融合抗原38kD-ESAT6-CIW10,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所获得的抗原具有良好的抗原性。结论该种抗原优势肽段融合抗原有望成为结核病血清学诊断的重要候选抗原,并且双抗原夹心ELITSA方法有助于提高检测的特异性和敏感性。     

Evaluation of a novel fusion protein antigen for rapid serodiagnosis of tuberculosis

The detection of Mycobacterium tuberculosis‐specific antibodies in human sera has been a rapid and important diagnostic aid for tuberculosis (TB) control and prevention. However, any single antigen is not enough to be used to cover the antibody profiles of all TB patients. In this study, a novel fusion protein was constructed using gene splicing by overlap extension (SOEing), and then the antibody level against it in 171 TB patients and 86 controls was evaluated by enzyme‐linked immunosorbent assay. Compared with the three individual antigen (16 kDa: sensitivity 19.9%, specificity 96.5%; MPT64: sensitivity 75.4%, specificity34.9%; 38 kDa: sensitivity 33.3%, specificity 83.7%), the fusion protein antigen (sensitivity 42.1%, specificity 89.5%) gave the best diagnostic performance with the largest receiver operating characteristic curve area 0.656 (95% confidence interval [CI], 0.590–0.721; P<0.01). These results suggested that the novel fusion protein antigen successfully constructed by gene SOEing provided the improved diagnostic performance for TB, and other mycobacterial multiepitope fusion proteins may also be worthy of investigation for further enhancing the detection sensitivity. J. Clin. Lab. Anal. 25:344–349, 2011. © 2011 Wiley‐Liss, Inc.