人源化Fab段噬菌体抗体库的构建

目的构建人源化Fab噬菌体抗体基因库。方法利用反转录PCR和PCR技术从B细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞中扩增人IgG抗体重链Fd基因及κ、λ轻链基因,将之克隆入噬菌体载体pComb3,构建人源性Fab噬菌体抗体库,并进行鉴定。结果构建完成了库容量为6.0×108的噬菌体抗体库。结论成功地构建了人源化噬菌体抗体库,为下一步抗CD20抗体的筛选和表达奠定了基础。     

RT-PCR扩增人抗HBsAg抗体Fab段基因

目的:采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)的方法从少量外周血中扩增抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。方法：用RNAex试剂提取细胞总RNA，以Olig(dT)引导合成cDNA第一链．再经PCR扩增的方法，以重链Fd和κ轻链基因简并引物．直接从人外周血混合淋巴细胞中扩增出抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。结果：扩增出分子量为700bp的抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。结论：得到的抗体基因为下一步构建含人抗HBsAg抗体Fab段基因的腺相关病毒载体奠定了基础。     

前列腺癌患者噬菌体抗体库的构建

[目的]构建前列腺癌患者的噬菌体抗体库,为前列腺癌特异性的人源性抗体 Fab片段的筛选及其应用奠定基础.[方法]由前列腺癌患者外周血分离得淋巴细胞,完整提取其总 RNA,经 RT PCR及半套式扩增得到免疫球蛋白全部轻链和重链 Fd段基因,然后经酶切、纯化、连接等步骤克隆进载体 pComb3,并电转化大肠杆菌 XL1 Blue,从而构建前列腺癌患者噬菌体抗体库.[结果] 成功构建噬菌体抗体 Fab片段库,其轻链及重链 Fd段与载体 DNA的重组率分别为 87%、 79%,库容为 23.2× 107,滴度为 87× 1012 mL- 1.[结论]本研究成功构建了前列腺癌患者噬菌体抗体库.     

抗华支睾吸虫抗体Fab段基因的克隆及重组表达载体的构建

为了制备抗华支睾吸虫基因工程抗体,本文从感染华支睾吸虫患者的淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA。用相应的引物进行PCR,扩增出约700bp的重链Fd段和轻链κ、λ基因,经Xho　I和Spe　I,SacI和 Xba　I双酶切后,分别和质粒载体pComb3连接,再经电穿孔转化大肠杆菌XL 1-blue菌株,将轻链和重链Fd基因先后克隆人pComb3中,成功地构建了抗华支睾吸虫Fab段抗体基因的表达载体,为进一步构建噬菌体抗体库奠定基础。     

以鼠源重链Fd片段为模板导向筛选人源性抗γ-浆蛋白抗体轻链

以鼠源抗γ-sm抗体重链Fd片段为模板，筛选人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链．方法：利用RT-PCR从前列腺癌患外周血淋巴细胞扩增出全套的人抗体轻链基因，克隆入含鼠源性抗γ-sm抗体重链Fd片段的噬粒载体pComb3X／mFd中，电转化大肠杆菌XL1-Blue后建立人-鼠杂合的Fab抗体库。     

抗腮腺炎病毒抗体Fab段基因的克隆及重组表达载体的构建

目的　构建抗腮腺炎病毒抗体Fab段基因重组表达载体。方法　从腮腺炎患者和腮腺炎抗体IgG阳性正常人群的淋巴细胞中提取总RNA ,逆转录成cDNA。用相应的引物进行PCR ,扩增出轻链和重链Fd段基因 ,经酶切后分别和噬粒载体pComb3连接 ,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1 blue菌株 ,将轻链和重链Fd基因先后克隆入pComb3中。结果　从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约 1 1 0 μg ,经逆转录、PCR ,分别扩增出约 70 0bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接 ,在 2 5kv,2 0 0Ω ,2 5 μF的条件下电转化 ,最终转化率为 :2 4 8× 1 0 7。随机挑取电转化后的 1 0个菌落 ,经PCR鉴定 ,共有 5个克隆同时含有轻链和重链Fd基因 ,抗体Fab的重组率为 5 0 %。结论　获得的抗体Fab重组表达载体是高效、实用的 ,为下一步构建抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库打下基础     

抗HFRS病毒单抗1A8鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建及表达

目的 构建HFRS病毒mAb1A8鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体，并进行表达。方法 将抗HFRS病毒mAb1A8的VH基因和人重链CH1基因加接，VL基因和人Ck基因连接，分别构建了鼠/人嵌合重链Fd基因和轻链基因，将它们克隆人pComb3，构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗表达载体，用辅噬菌体VCSM13超感染，ELISA间接夹心法检测抗体活性。结果 经多种限制性内切酶酶切鉴定载体构建正确，ELISA间接夹心法检测超感染上清为阳性。结论 成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体，并在噬菌体表面表达出可结合HFRS病毒抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。     

用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。     

噬菌体库技术构建HPV 16 E7人源化单克隆抗体

目的：构建抗HPV16E7的噬菌体抗体库。方法：由感染者抗凝血中分离外周淋巴细胞，提取细胞总RNA，以逆转录聚合酶链反应（RT－PCR），用人IgG Fab基因特异引物，从合成的cDNA中分别扩增出抗体轻链和重链可变区基因，回收纯化PCR产物。用SpeI XhoI酶切重链可变区基因，XbaI SacI酶切轻链可变区基因，先后克隆入噬菌体载体pComb3。结果：PCR产物经电泳证实分子量大小正确，酶切电泳证实质粒构建正确。结论：成功构建抗体轻链和重链基因克隆，建立抗HPV16E7噬菌体抗体库。     

人破伤风免疫噬菌体抗体库的建立及鉴定

目的：建立人破伤风免疫噬菌体抗体库，筛选抗破伤风类毒素的抗体基因，并在大肠杆菌中表达可溶性Fab段。方法：从破伤风类毒素免疫志愿者中分离淋巴细胞，提取细胞总RNA，用一组人IgG Fab基因特异性引物，从合成的cDNA中经PCR扩增出抗体轻链(VL CL)和重链Fd(VH CHl)基因，分别经Xba Ⅰ／Sac Ⅰ和Spe Ⅰ／XhoⅠ酶切克隆入噬菌粒pComb3。用破伤风外毒素作为抗原进行筛选富集获得特异性抗破伤风类毒素的噬菌体抗体，切去噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ(gⅢ)，表达可溶性人抗破伤风类毒素的Fab段。结果：经核苷酸序列分析证实，所获得的基因为人IgGFab基因；用ELISA鉴定表明，表达的人IgGFab抗体能特异性地与破伤风外毒素结合。结论：利用噬菌体抗体库技术筛选可得到与破伤风外毒素特异性结合的人抗破伤风类毒素基因工程抗体。