肝爽颗粒对HSC-T6细胞ColⅠ、ColⅢ、TIMP1基因及蛋白表达的影响

目的观察肝爽颗粒对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ,ColⅠ)、Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ,ColⅢ)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 1,TIMP1)基因及蛋白表达的影响.方法用浓度0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.35、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0、16.0mg/ml肝爽颗粒作用于HSC-T6细胞48小时,采用MTT比色法观察其对HSC-T6细胞生长的影响;以0.05、0.1、0.2mg/ml肝爽颗粒作用于HSC-T6细胞48小时,采用逆转录PCR与ELISA方法分别测定其对HSC-T6细胞ColⅠ、ColⅢ、TIMP1基因及蛋白表达的影响.结果空白对照组ColⅠ、ColⅢ、TIMP1基因表达水平分别为0.91±0.11、1.54±0.09、1.83±0.13辉度值,蛋白表达水平分别为(187.63±4.11)、(7.59±1.04)、(23.85±2.13)ng/ml,以0.05、0.1、0.2mg/ml肝爽颗粒作用于HSC-T6细胞48小时,浓度0.05mg/ml肝爽颗粒仅能降低ColⅠ蛋白的表达;当浓度升为0.10mg/ml时不仅可显著降低ColⅠ蛋白的表达,而且对ColⅢ mRNA与蛋白的表达亦产生明显抑制作用;当浓度达到0.20mg/ml时作用更明显,可显著降低ColⅠ、ColⅢmRNA,ColⅠ、ColⅢ、TIMP1蛋白的表达.结论肝爽颗粒能明显抑制HSC-T6细胞ColⅠ、ColⅢ基因表达,抑制ColⅠ、ColⅢ、TIMP1蛋白表达,从而可抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,减弱TIMP1对基质金属蛋白酶的抑制作用,这可能是其抗纤维化的作用机制之一.     

复方861含药血清对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶组织抑制因子1 mRNA表达的影响

目的:观察复方861含药血清对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原(CoL-Ⅰ)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)mRAN表达的影响.方法:不同剂量复方861灌胃大鼠制备的含药血清,作用于HSC-T6细胞48h,以逆转录定量PCR方法测定其对HSC-T6细胞CoL-Ⅰ、TIMP1 mRNA表达的影响.结果:复方861 0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg、6.0g/kg等不同剂量的含药血清HSC-T6细胞Col-Ⅰ、TIMP1 mRAN表达水平分别为0.28±0.09、0.29±0.13、0.31±0.18、0.40±0.08,1.28±0.46、1.33±0.40、1.14±0.10、1.22±0.31,与空白对照组(0.58±0.04,2.29±0.67)比较,具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01).结论:复方861降低HSC-T6细胞CoL-Ⅰ、TIMP1mRAN表达水平,是其抗肝纤维化的作用机理之一.     

复方861含药血清对HSC—T6细胞I型胶原、基质金属蛋白酶组织抑制因子1 mRNA表达的影响

目的:观察复方861含药血清对HSC-T6细胞I型胶原(CoL-I)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)mRAN表达的影响。方法:不同剂量复方861灌胃大鼠制备的含药血清,作用于HSC-T6细胞48h,以逆转录定量PCR方法测定其对HSC-T6细胞CoL-I、TIMP1 mRNA表达的影响。结果:复方861 0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg、6.0g/kg等不同剂量的含药血清HSC-T6细胞Col-I、TIMP1 mRAN表达水平分别为0.28±0.09、0.29±0.13、0.31±0.18、0.40±0.08,1.28±0.46、1.33±0.40、1.14±0.10、1.22±0.31,与空白对照组(0.58±0.04,2.29±0.67)比较,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结论:复方861降低HSC-T6细胞CoL-I、TIMP1mRAN表达水平,是其抗肝纤维化的作用机理之一。     

干扰素γ对肝星状细胞-T6细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原等基因表达的影响

目的观察干扰素γ(IFN γ)对肝星状细胞(HSC)-T6细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(colⅢ)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)基因表达的影响。方法浓度0.1、1、10、102、103、104、2.5×105、5×105U/ml IFN γ作用于HSC-T6细胞48 h,采用四甲基偶氮唑盐比色法观察其对HSC-T6细胞生长指数的影响;以1、102、104U/ml IFN γ作用于HSC-T6细胞48 h,采用逆转录聚合酶链反应方法测定其对HSC-T6细胞Col Ⅰ、ColⅢ、TIMP1基因表达的影响。结果空白对照组ColⅠ、ColⅢ、TIMP1基因表达水平分别为2.86±0.21、2.00±0.23、3.90±0.81;1U/m1、102U/ml、104U/ml IFNγ作用于HSC-T6细胞,ColⅠ基因表达水平依次为1.00±0.11、0.42±0.12、0.33±0.12,与空白对照组比较, 差异有统计学意义;ColⅢ基因表达水平依次为1.09±0.1 5、0.52±0.14、0.43±0.18,与空白对照组比较, 差异有统计学意义;TIMP1基因表达水平依次为3.81±0.37、3.50±0.51、3.41±0.31,与空白对照组比较,差异无统计学意义。结论IFNγ明显抑制HSC-T6细胞colⅠ、ColⅢ基因表达水平,而对TIMP1基因表达水平无明显影响,从而可抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,这可能是其抗纤维化的作用机制之一。     

复方861对HSC-T6细胞基质分解素1mRNA表达水平影响的研究

为观察复方 86 1对HSC -T6细胞基质分解素 1(MMP3 )mRNA表达水平的影响 ,复方 86 1以 0 2 5mg/ml、0 5mg/ml、1 0mg/ml等浓度作用于HSC -T6细胞 48小时 ,以逆转录定量PCR方法测定其对HSC -T6细胞MMP3 mRNA表达水平的影响。结果表明 ,复方 86 10 2 5mg/ml、0 5mg/ml、1 0mg/ml等不同浓度的HSC -T6细胞mRNA表达水平依次为 2 75± 0 35、3 0 0± 0 0 1、3 5 0± 0 71,与空白对照组比较 ,可明显提高MMP3 mRNA表达水平 (P <0 0 5或P <0 0 1)。因此 ,复方 86 1提高HSC -T6细胞MMP3 mRNA表达水平 ,可能是其促进胶原降解 ,抗肝纤维化的作用机理之一。     

复方861治疗慢性乙型肝炎肝纤维化与早期肝硬化的临床研究

目的观察复方861对慢性乙型肝炎肝纤维化、早期肝硬化患者的抗肝纤维化效果.方法采用随机、双盲、安慰剂对照的方法,以治疗前后肝穿病理组织学为评价指标,对6家医院的慢性乙型肝炎肝纤维化患者136例,按照随机编码分别服用复方861胶囊或安慰剂胶囊共24周,观察治疗前后患者症状、体征、肝功能、肝纤维化指标[IV胶原(C Ⅳ)、层黏连蛋白(L N)、Ⅲ型前胶原N端肽(P ⅢP)、透明质酸(HA)]、基质金属蛋白酶1、2、9(MMP1、2、9)及金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP1、2)水平以及肝病理组织学的变化.结果 5 2例治疗组、5 0例安慰剂组的患者完成治疗前后肝穿刺.治疗组患者治疗前、后血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)分别为(68.2±68.6)U/L和(45.9±26.1)U/L、天冬氨酸氨基转移酶(AST)分别为(60.4 ± 62.6)U/L和(46.7 ± 39.0)U/L,安慰剂组患者治疗前、后血清ALT分别为(65.3±48.3)U/L和(85.4±115.5)U/L,AST分别为(60.4±44.6)U/L和(77.6±89.6)U/L,两组比较差异均有显著性,t=2.315和t=2.168,P＜0.05.治疗组血清HA、PⅢP、CⅣ、LN水平均较治疗前有所下降,但与安慰剂组相比,差异无显著性.治疗组治疗前、后血清TIMP1分别为(172.0±79.6)ng/m1和(133.5 ± 66.8)ng/ml,MMP9分别为(116.1±88.2)ng/ml和(80.4±79.0)ng/ml,较治疗前均明显下降,f=2.723和t=2.433,P＜0.05.复方861治疗前、后血清TIMP1/MMP1比值分别为4 8.3±96.3和19.9 ± 28.0,较治疗前下降,而对照组则较治疗前升高,治疗前后差值相比,两组差异有显著性,t=2.248,P＜0.05.治疗组治疗前、后肝组织炎症计分分别为14.0±6.0和10.2±6.1、纤维化计分分别为11.9±6.5和8.2=4.5,病理图像分析胶原相对含量分别为18.9%±9.5%和14.9%± 8.4%,t值为3.354～2.202,P值均＜0.05;S2期逆转率为38.9%,S 3期为53.3%,S4期为78.6%,总逆转率52.0%;安慰剂组分别为14.3%、25.0%、41.7%、20.0%,两组差异有显著性,x2值为9.766～4.478,P值均＜0.05.复方861治疗组未见明显不良反应.结论复方861治疗慢性乙型肝炎肝纤维化、早期肝硬化是可以逆转的.     

复方861对大鼠肝星状细胞胶原合成及降解干预作用的体外研究

目的深入研究中药复方861抗肝纤维化的机理。方法向传一代肝星状细胞培养液中加入终浓度为10mg／ml的复方861作用48小时,收获细胞培养液观察Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型胶原及TGFβ1的分泌量并测定胶原酶活性;收获肝星状细胞并提取总RNA,斑点杂交法检测胶原、胶原酶及其抑制TIMP1mRNA水平的变化。结果复方861可明显抑制肝星状细胞Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型胶原及TGFβ1mRNA的表达及相应蛋白的分泌,同时可提高间质性胶原酶的活性并抑制TIMP1mRNA的表达。结论复方861在抑制胶原过度合成的同时,又可促进胶原的降解,从而使二者间的失衡得以纠正,达到抗肝纤维化的目的。     

中药复方861抑制肝星状细胞NF-κB活性的体外研究

目的 研究中药方861对肝星状细胞NF－κB活性的影响。方法 将5mg/ml的复方861加入体外培养的大鼠肝星状细胞系作用48h,NF－κB活性的检测采用凝胶电泳移动抑制法,细胞培养液中细胞因子的检测采用ELISA法,细胞凋亡采用流式细胞仪和TUNEL法检测。复方861作用命名体外培养的肝星状细胞NF－κB结合活性比未加药的空白对照组显著减弱,细胞培养液中的IL－6和sICAM水平减低（P＜0.05）,星状细胞凋亡增加（P＜0.01）。结论 复方861显著抑制体外培养的肝星状细胞NF－κB活性可能为治疗肝纤维化中的重要机理之一。     

扯根菜浸膏对TGF-β1肝星状细胞胞内信号转导通路的影响

目的观察扯根菜浸膏对TGF-β1肝星状细胞胞内信号转导通路的影响。方法HSC-T6常规培养后分为正常组、模型组和药物组,用含0.5%FBS的DMEM培养,模型组在相同培养条件下加入TGF-β1刺激,药物组分别用不同浓度药物培养液加TGF-β1刺激,采用Alamar Blue法检测细胞活力,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测药物细胞毒性;根据Alamar Blue法及MTT的结果,选择药物组用含2mg/ml药物的0.5%FBS培养液加上TGF-β1刺激,24h后采用Western blotting法检测细胞I型胶原、α-肌动蛋白、ERK蛋白表达及磷酸化水平。结果不同浓度扯根菜浸膏均能抑制细胞增殖,在24h增殖抑制明显,以2mg/ml浓度最明显;MTT结果示2mg/ml药物组对细胞无明显的毒性,而10mg/ml、50mg/ml药物组对细胞有明显的毒性;扯根菜浸膏对I型胶原及α-肌动蛋白的表达均有明显抑制,与模型组比较,P0.01;对ERK蛋白表达未见明显抑制,与模型组比较,P0.05;但扯根菜浸膏对磷酸化ERK水平及表达均有明显的抑制,与模型组比较,P0.01。结论扯根菜浸膏能明显抑制肝星状细胞分泌I型胶原及α-肌动蛋白,减少细胞外基质沉积,其部分作用机制可能与抑制TGF-β1的胞内ERK信号转导有关。     

外源性脂联素对内皮素1诱导的肝星状细胞收缩的影响及作用机制

目的观察外源性脂联素对内皮素(ET)1诱导的肝星状细胞(HSC)-T6收缩的影响,探讨脂联素在此过程中的可能作用机制。方法应用胶原晶格法观察不同浓度(0.25、0.5μg/ml)脂联素及脂联素(0.5μg/ml)与左旋硝基精氨酸甲酯(LNAME)(5 mmol/L)共同作用下对ET-1诱导的HSC-T6细胞收缩的影响;分别采用实时荧光定量PCR、Western Blot检测脂联素(0.5μg/ml)作用后HSC-T6细胞中ET-1 mRNA及蛋白的表达,采用ELISA检测脂联素(0.5μg/ml)作用后HSC-T6细胞培养液中ET-1蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR及Western Blot检测不同浓度(0.5、1、2μg/ml)脂联素与ET-1共同作用下HSC-T6细胞中诱导型一氧化氮合酶(i NOS)的mRNA及蛋白的表达,同时检测HSC-T6细胞中AMPK、p-AMPK、Akt、p-Akt蛋白的表达。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用Dunnett法。结果 (1)胶原晶格实验显示,与空白对照组相比,ET-1组凝胶面积显著收缩[(24.8±7.3)%vs(71.9±4.1)%,P0.01];脂联素(0.5μg/ml)处理后,明显抑制ET-1引起的收缩[(52.7±20.6)%vs(24.8±7.3)%,P0.05];L-NAME(5 mmol/L)可以部分抵消脂联素的抑制作用(P0.05)。(2)脂联素(0.5μg/ml)可以抑制HSC-T6细胞中ET-1 mRNA及蛋白的表达(P0.05),同时可以抑制细胞上清液中ET-1的蛋白表达,在脂联素的基础上加入L-NAME后,脂联素的上述抑制作用均得到部分逆转。(3)HSC-T6细胞中有i NOS mRNA表达,加入ET-1后i NOS mRNA表达量明显下降(P0.01),同时加入ET-1和脂联素作用后i NOS mRNA表达较ET-1组增加,且随着脂联素浓度升高i NOS mRNA表达量有逐渐升高的趋势,HSC-T6细胞中i NOS蛋白表达与mRNA表达趋势一致;ET-1处理24 h后HSC-T6细胞中p-AMPK表达水平明显减低,在此基础上加入脂联素后,p-AMPK表达水平明显上升,且随脂联素浓度的增加逐渐增加;ET-1处理24 h后HSC-T6细胞中p-Akt表达水平明显上升,在此基础上加入脂联素后,p-Akt的表达水平下降,且随脂联素浓度的增加逐渐降低。结论脂联素能够抑制ET-1诱导的HSC收缩,其机制可能是通过激活AMPK,增加NO的合成,减少ET-1的合成分泌,同时阻断Akt信号通路来实现的。脂联素抑制HSC的收缩作用可能是其抗肝纤维化的机制之一。     

Effects of herbal compound 861 on human hepatic stellate cell proliferation and activation

AIM: To investigate the effects of herbal compound 861 (Cpd 861) on cell proliferation in human hepatic stellate cells (LX-2) and human hepatocellular liver carcinoma cells (HepG2), and expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in LX-2 cells.METHODS: LX-2 and HepG2 cells were incubated with various concentrations of Cpd 861 (0.1-0.003 mg/mL)for 1, 2, 3, 5 and 7 d. Cell proliferation was analyzed by 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. Effects of Cpd861on the expression of cc-SMA mRNA in LX-2 cells weremeasured by real-time quantitative PCR method using SYBRGreen I technology.RESULTS: Cpd 861, at 0.1 mg/mL, significantly inhibitedLX-2 cell proliferation (15% decrease relative to control,P&lt;0.05) after 3 d of incubation. The inhibitory effects seemedto increase with the treatment time (25% decrease after5 d of incubation and 35% decrease after 7 d of incubation,P&lt;0.01). However, Cpd 861 did not affect HepG2 cellproliferation at the same concentration used for I_X-2 cells.The expression levels of ~-SMA mRNA decreased significantlywhen LX-2 cells were exposed to Cpd 861 for 48 h (59%decrease relative to control, P&lt;0.05) or 72 h (60% decreaserelative to control, P&lt;0.01).CONCLUSION: Cpd 861 can significantly inhibit LX-2 cellproliferation in a dose-dependant manner, and reduce theexpression levels of o~-SMA mRNA in LX-2 cells. Since hepaticcell proliferation and high level of ~-SMA are associatedwith liver fibrosis, the results suggest that Cpd 861 may beuseful in the treatment of this disease.     

Down-regulation of transforming growth factor β1/activin receptor-like kinase 1 pathway gene expression by herbal compound 861 is related to deactivation of LX-2 cells

AIM: To investigate the effect of herbal compound 861(Cpd861) on the transforming growth factor-131 (TGFβ1)/activin receptor-like kinase 1 (ALK1, type I receptor)signaling-pathway-related gene expression in the LX-2 cell line, and the inhibitory mechanism of Cpd861 on the activation of LX-2 cells.METHODS: LX-2 cells were treated with TGFβ1(5 ng/mL) Cpd861 (0.1 mg/mL), TGFβ1 (5 ng/mL) plus Cpd861 (5 ng/mL) for 24 h to investigate the effect of Cpd861 on the TGFβ1/ALK1 pathway. Real-time PCR was performed to examine the expression of α-SMA (α-smooth muscle actin), ALK1, Id1 (inhibitor of differentiation 1). Western blotting was carried out to measure the levels of α-SMA and phosphorylated Smadl,and immunocytochemical analysis for the expression of α-SMA.RESULTS: In LX-2 cells, TGFβ1/ALK1-pathway-related gene expression could be stimulated by TGFβ1, which led to excessive activation of the cells. Cpd861 decreased the activation of LX-2 cells by reducing the expression of α-SMA mRNA and protein expression. This effect was related to inhibition of the above TGFβ1/ALK1-pathwayrelated expression of genes such as Id1 and ALK1, and phosphorylation of Smad1 in LX-2 cells, even with TGFβ1 co-treatment for 24 h.CONCLUSION: Cpd861 can restrain the activation of LX-2 cells by inhibiting the TGFβ1/ALK1/Smad1 pathway.     

Down-regulation of transforming growth factor β1/activin receptor-like kinase 1 pathway gene expression by herbal compound 861 is related to deactivation of LX-2 cells

AIM： To investigate the effect of herbal compound 861 （Cpd861） on the transforming growth factor-β1 （TGFβ1）/ activin receptor-like kinase 1 （ALK1, type Ⅰ receptor） signaling-pathway-related gene expression in the LX-2 cell line, and the inhibitory mechanism of Cpd861 on the activation of LX-2 cells.
METHODS： LX-2 cells were treated with TGFβ1 （5 ng/mL） Cpd861 （0.1 mg/mL）, TGFβ1 （5 ng/mL） plus Cpd861 （5 ng/mL） for 24 h to investigate the effect of Cpd861 on the TGFβ1/ALK1 pathway. Real-time PCR was performed to examine the expression of α-SMA （α-smooth muscle actin）, ALK1, Id1 （inhibitor of differentiation 1）. Western blotting was carried out to measure the levels of α-SMA and phosphorylated Smad1, and immunocytochemical analysis for the expression of α-SMA.
RESULTS： In LX-2 cells, TGFβ1/ALK1-pathway-related gene expression could be stimulated by TGFβ1, which led to excessive activation of the cells. Cpd861 decreased the activation of LX-2 cells by reducing the expression of α-SMA mRNA and protein expression. This effect was related to inhibition of the above TGFβ1/ALK1-pathway- related expression of genes such as Id1 and ALK1, and phosphorylation of Smad1 in LX-2 cells, even with TGFβ1 co-treatment for 24 h.
CONCLUSION： Cpd861 can restrain the activation of LX-2 cells by inhibiting the TGFβ1/ALK1/Smad1 pathway.     

肝细胞对星状细胞凋亡的影响和复方861的干预作用

目的：研究肝细胞对星状细胞凋亡和影响中药复方861的干预作用。方法：体外采用分离培养的正常大鼠原代肝细胞和星状细胞系,将培养的肝细胞和复方861作用于不同的培养基再作用于星状细胞,用电镜观察和流式细胞仪检测细胞凋亡。临床研究对象是用复方861治疗6个月行治疗前后肝穿的慢性乙型肝炎病人。结果：原代培养的正常肝血细胞促进了星状细胞的凋亡（P＜0．05）。复方861可以增加这种促凋亡作用（P＜0．05）。临床研究显示慢性乙型肝炎患者肝星状细胞大量活化增生,用复方861治疗6个月后有肝细胞再生,同时活化的星状细胞数量显著减少,可观察到其凋亡。结论：正常肝细胞可以促进星状细胞凋亡,复方861对星状细胞有直接和间接的促凋亡作用。     

siRNA沉默β-Catenin对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的研究siRNA干扰β-Catenin表达,阻断Wnt/β-Catenin信号通路对肝星状细胞（HSC）增殖和凋亡的影响。方法将化学合成的siRNAβ-Catenin以Lipofectamine包裹,转染HSC-T6细胞,设阴性对照和空白对照;采用逆转录-聚合酶链反应和Western blotting检测细胞β-Catenin表达;采用Western blotting法检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;采用MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和细胞凋亡。结果以不同浓度的β-Catenin SiRNA转染HSC-T6细胞后,β-Catenin mRNA水平比阴性对照组分别下调了51.3±3.6%、85.7±6.8%和94.5±7.5%（P均〈0.01）,比空白对照组分别下调了50.5±3.4%、86.1±6.2%和93.7±7.2%（P均〈0.01）;β-Catenin蛋白表达被抑制了56.43±2.88%（P〈0.01）;Ⅰ和Ⅲ型胶原表达分别被抑制了46.58±3.46%（P〈0.01）和50.48±3.72%（P〈0.01）;细胞增殖明显被抑制,最大抑制率达到44.8±2.8%（P〈0.01）;细胞凋亡增加达28.6%（P〈0.05）。结论 siRNAβ-Catenin能高效抑制HSC-T6细胞β-Catenin表达,阻断Wnt/β-Catenin信号通路,从而抑制HSC-T6细胞增殖,促进凋亡,显著减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和分泌,具有预防及治疗肝纤维化的潜力。