足细胞分子高表达致阿霉素肾病大鼠发生蛋白尿

目的 动态观察足细胞裂孔隔膜复合体分子nephrin、podocin、CD2AP及α-actinin-4在阿霉素肾病大鼠蛋白尿发生发展中的表达变化，探讨其在蛋白尿发生发展中的分子行为及其机制。方法 尾静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型，3、7、14、28 d每组处死6只大鼠留取肾脏标本。应用间接免疫荧光染色、实时定量PCR、Western 印迹分别检测各个时间点nephrin、podocin、CD2AP、α-actinin-4的分布、mRNA和蛋白表达量的变化。结果 (1)14 d肾病组大鼠24 h尿蛋白显著高于对照组(P < 0.01)，增高持续到28 d。(2)透射电镜显示14 d肾病组足突不同程度变宽，28 d足突弥漫性融合。(3)与对照组相比，从第7天开始肾病组nephrin和podocin染色从沿肾小球毛细血管袢线样分布向不连续粗颗粒样的分布模式转变；CD2AP节段染色增强区逐渐扩大，有的区域呈斑片状和连续线状增强；α-actinin-4从沿肾小球毛细血管袢均匀的点线样分布向不均匀粗颗粒的分布转变，而且随时间进展这种转变逐渐加重。(4)与对照组相比，肾病组于7 d时nephrin mRNA表达显著增高(P < 0.01)；podocin mRNA表达14 d时显著增高(P < 0.05)，直至28 d(P < 0.05)；CD2AP mRNA表达28 d时显著增高(P < 0.05)。(5)与对照组相比，肾病组nephrin蛋白表达28 d时显著增高(P < 0.05)；podocin蛋白表达于7 d时显著增高(P < 0.05)，而28 d时又显著降低(P < 0.05)；CD2AP蛋白表达于14 d时显著增高(P < 0.05)，直至28 d (P < 0.05)。(6)α-actinin-4 mRNA与蛋白表达在实验过程中未出现明显变化。结论 nephrin、podocin和CD2AP的表达增加及分布异常是导致阿霉素肾病大鼠蛋白尿发生发展的分子机制，而分子表达的增加是足细胞抵抗损伤的一种代偿反应。     

敲低动力蛋白激活蛋白1基因表达对足细胞分化的影响

目的：观察敲低动力蛋白激活蛋白1（dynactin1）基因表达对足细胞分化的影响。方法：用免疫荧光技术检测dynactin1在条件永生化小鼠足细胞中的表达;用RNA干扰技术抑制dynactin1的表达,用Western blot技术证实转染效率,用MTT法检测转染后细胞的生长速度,用RT-PCR技术检测转染后细胞分化标志蛋白synaptopodin的表达情况。结果：在足细胞分化过程中,细胞形态发生改变,dynactin1主要分布在核周及附近的胞浆区域;转染特异性siRNA后dynactin1蛋白表达下调,细胞生长速度明显减慢,synaptopodin mRNA表达下调,细胞分化迟滞。结论：敲低dynactin1基因表达阻滞足细胞分化。     

地塞米松影响足细胞活动力的相关分子研究

Objective To investigate the potential roles of dexamethasone (Dex) in podocyte motility, and to explore the mechanism of modulating α-actinin-4, nephrin. Methods Podocytes were divided into three groups: Dex group [1 ?滋mol/L Dex+50 mg/L puromycin aminonucleoside (PAN)], PAN group (50 mg/L) and normal control group. Scrape wound assay and Transwell migration assay were used to detect cell motility. Filtering ratio of podocytes was measured by FITC labeled BSA. Real-time PCR and Western blotting were used to examine the expressions of α-actinin-4 and nephrin. Results From the scrape wound assays, the ability of wound repair in podocytes of PAN group was significantly increased (P＜0.01), and the number of migrating cells in this group also rose (P＜0.01). Compared to PAN group, podocytes in Dex group did not enhance the motility after treatment with the same dose PAN (P＜0.01). Real-time PCR and Western blotting showed that Dex could significantly inhibit the up-regulated expression of α-actinin-4 and nephrin induced by PAN. Conclusions Dex can relieve the enhanced motility induced by PAN. Its mechanism may be associated with the modulation of the expressions of α-actinin-4 and nephrin.     

podocin基因敲低对小鼠足细胞nephrin和α-actinin表达与分布的影响

目的 研究足细胞分子podocin、nephrin和α-actinin之间的相互作用和联系。方法 将针对podocin分子设计的特异RNA干扰(RNAi)质粒导人体外培养的小鼠足细胞系(MPC5)；应用免疫荧光染色及双标记在共聚焦显微镜下观察nephrin、podocin和α-actinin的分布方式；半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测podocin、nephrin，α-actinin-4及内参照GAPDH／β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表达量。结果 (1)干扰组podocin的荧光强度显著低于对照组，其mRNA和蛋白的表达量分别下降了65％和89％。免疫双标记显示podocin的分布发生了明显变化：对照组podocin不但分布在胞核的周围，而且在胞浆呈放射性沿着细胞骨架分布，以及主要在胞膜上呈连续性的线状分布；干扰组podocin呈点状分布在胞核周围。(2)干扰组nephrin的荧光强度亦明显减低，其mRNA及蛋白的表达量分别减少了70％和78％。免疫双标记显示nephrin的分布也发生了显著变化：干扰组nephfin亦呈点状分布在胞核周围；在对照组，nephrin和podocin的分布方式相同。(3)干扰组和对照组α-actinin的分布及在mRNA和蛋白水平上的表达量无明显差异，呈细丝状均匀分布于胞质内，亦呈放射性分布于足细胞伸出的突起中。结论 通过RNAi成功地使MPC5的podocin表达下调。Podocin和nephrin分子关系紧密，可能存在着直接的分子间反应；podocin与α-actinin无直接的作用和联系。     

三种不同药物作用下足细胞分子的变化

目的 从足细胞分子的角度探讨抗蛋白尿药物作用的细胞分子机制。方法 建立阿霉素肾病大鼠模型。注射阿霉素后次日分别给予利生普利、泼尼松以及全反式维甲酸(ATRA)干预蛋白尿。注射阿霉素后第3、7、14、28 天每组处死6 只大鼠，留取肾脏标本。应用间接免疫荧光染色、实时PCR、Western印迹分别检测各个时间点nephrin、podocin、CD2相关蛋白(AP)、α辅肌动蛋白(actinin)-4 的分布、mRNA 和蛋白表达量的变化。应用免疫沉淀检测nephrin 与podocin、nephrin与CD2AP 分子间作用以及nephrin 磷酸化水平。结果 与对照组相比，第14天时肾病组尿蛋白显著增加(P < 0.01)。与肾病组相比，利生普利、泼尼松和ATRA干预后均显著降低了蛋白尿( P < 0.05)， 减轻了足突融合。通过分析不同时间点足细胞分子的表达，显示3种干预药物均引起了nephrin、podocin、CD2AP 表达的变化，维持了正常的nephrin 磷酸化水平，而且利生普利和泼尼松首先抑制了podocin 分子，而ATRA首先抑制了CD2AP 分子的异常变化。与此同时，nephrin、podocin、CD2AP 和α-actinin-4 分子的分布在干预后也趋于正常。此外，无论在肾病组还是干预组大鼠，nephrin 与podocin、nephrin 与CD2AP 分子间一直保持着共沉淀关系。 结论 利生普利、泼尼松和ATRA 都通过稳定重要的足细胞分子nephrin、podocin、CD2AP 来发挥它们的抗蛋白尿作用。     

CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果

目的 采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系(HaCaT),筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果.方法 用CaCl2法将已构建好的3种pHSER-CCL20-shRNA-GFP载体(pHCG-1和pHCG-2为CC120基因特异性,pHCG-3为CCL20基因错配)转染293FT包装出慢病毒颗粒,流式细胞术测定其病毒滴度.用G418压力筛选慢病毒感染的HaCaT,荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测CC120基因mRNA和蛋白的表达水平,以判断其特异性干扰效果.结果 三种慢病毒载体所包装出的慢病毒滴度分别为7.08×105转导单位(TU)/ml、1.88×105TU/ml和2.08×105TU/ml;感染后的HaCaT经过G418筛选5～8周,获得4株CCL20基因特异性的细胞克隆(HaCaT-1、HaCaT-2、HaCaT-3和HaCaT-4)及2株CCL20基因错配对照的细胞克隆(HaCaT-5和HaCaT-6).经荧光定量PCR和ELISA法检测显示,4株CCL20基因特异性细胞克隆均具有稳定干扰效果,不仅能显著地下调CCL20基因的mRNA表达(其抑制率分别为81.0%、89.0%、81.3%、77.2%),而且明显地减少CCL20蛋白分泌(其抑制率分别为70.0%、86.1%、88.1%、90.7%).结论 采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染HaCaT可以筛选出具有长期稳定表达RNA干扰效应的CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆,将可能为低免疫排斥反应异基因组织工程皮肤的构建提供种子细胞.     

人 Orail基因真核表达载体的构建及在足细胞中的表达

目的构建重组人 Orail基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株（MPC5）中的表达。方法根据GenBank数据库检索到的人 Orail基因序列,人工合成法合成Orail基因编码区（coding sequence,CDS）全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PC-CMV-Orail,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Western blot法分别检测Orail基因的转录与翻译。结果PCR扩增的片段长度为906bp,双酶切出现两条带,其中约906bp处可见目的条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人 Orail基因的CDS序列完全一致。转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光。RT-PCR及Western blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orail均有所增强。结论成功构建了重组人 Orail基因真核表达载体PG-CMV-Orail,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2’通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础。     

足细胞分子nephrin在高血压大鼠肾脏的表达及作用

目的探讨足细胞分子nephrin在自发性高血压大鼠（SHR）肾脏的表达及作用。方法监测不同时期SHR与京都大鼠（wistar-kyotorats,WKY）尾动脉收缩压（SBP）、尿β2-微球蛋白（β2-MG）、尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）水平;免疫组化、RT-PCR方法检测nephrin蛋白及mRNA的表达,观察肾脏的病理改变。结果与WKY组相比,SHR组SBP、β2-MG、BUN、SCr升高,nephrin蛋白及mRNA表达量下降,且nephrin含量与尿β2-MG呈负相关。SHR组肾脏发生病理改变。结论足细胞分子nephrin在SHR肾小球表达减少,可能是导致足细胞裂隙膜损伤,引起尿β2-MG排泄水平增加,肾功能受损,肾脏病理改变的基础。     

洛沙坦对糖尿病大鼠肾脏炎症反应及足细胞损伤的影响

目的 探讨洛沙坦对糖尿病大鼠模型肾组织炎症反应及足细胞损伤的影响。方法 Wistar大鼠随机分为3组：对照组（NC）、糖尿病组（DM）、洛沙坦治疗组（DL）。链脲菌素（STZ）注射建立糖尿病动物模型，洛沙坦治疗组在大鼠建立糖尿病同时即开始以洛沙坦（20mg·kg·d^-1）灌胃治疗。分别于2周和12周杀鼠，观察体重、肾重、肾重／体重指数、尿蛋白量（24h）、Scr、Ccr以及肾组织病理改变；免疫组化染色观察肾小球细胞间黏附分子（ICAM-1）、白细胞共同抗原（CD45）、nephrin、血管内皮生长因子（VEGF）表达的改变；免疫印迹观察肾组织nephrin、VEGF表达的改变。结果 （1）DL组大鼠肾重／体重指数、尿蛋白量（24h）、Ccr则均低于DM组，差异均有统计学意义（P均〈0．05），其病理改变程度也比DM组轻。（2）免疫组化及免疫印迹显示，DM组和DL组肾小球ICAM-1、CD45、VEGF表达均高于对照组，而DL组ICAM-1、CD45、VEGF表达均低于DM组；DM组和DL组大鼠肾小球nephrin表达低于对照组；DL组肾小球nephrin表达高于DM组，差异均有统计学意义（P均〈0．01）。结论 洛沙坦可能通过抑制肾组织白细胞浸润、炎症反应及减轻足细胞损伤，达到肾脏保护作用。     

慢病毒介导的膜孔相互作用分子1基因敲减对SMMC7721细胞凋亡的影响

目的 观察膜孔相互作用分子1(Stim1)基因表达下调对肝细胞癌(HCC)细胞凋亡的作用.方法 设计和合成Stim1基因干扰序列,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,利用第3代慢病毒包装系统进行病毒制备;干扰慢病毒以2倍感染复数( MOI)感染SMMC7721细胞,定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法(WB)检测Stim1基因表达;采用碘化丙锭(PI)和膜联蛋白V( Annexin V)双染法检测SMMC7721细胞的凋亡变化. 结果 测序结果表明干扰序列连入干扰载体;定量PCR和West-em blot法检测结果显示干扰慢病毒感染可以抑制Stim1基因75％以上的表达;流式细胞仪检测结果表明在Stim1基因被敲减后,凋亡细胞的比例从8％上升到26％.结论Stim1基因的敲减促进SMMC7721细胞的凋亡.     

马兜铃酸损伤大鼠肾小球足细胞的研究

目的 探讨马兜铃酸是否能损害肾小球足细胞.方法 用关木通浸膏水溶液间断灌胃制作马兜铃酸肾损害大鼠模型,分别于第1、4周末检测早期马兜铃酸肾损害大鼠24 h尿蛋白量,并以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察尿蛋白成分.随后处死大鼠取肾组织,用激光显微切割捕获技术分离肾小球;用实时荧光定量PCR检测肾小球中nephnn、podocin、CD2AP、podocalyxin、podoplanin的mRNA表达;电镜下测量肾小球足突的平均宽度.结果 模型大鼠4周末尿蛋白量较对照组显着增多(P＜0.01),其中白蛋白含量明显增加.电镜结果显示肾小球足突平均宽度较对照组显著增宽(P＜0.01).肾小球中nephrin、podocin、CD2AP、podocalyxin、podoplanin的mRNA表达均较对照组显著减少,分别下调34％、62％、56％、50％(P＜0.01)及27％(P＜0.05).结论 马兜铃酸能损伤肾小球足细胞,导致足细胞相关蛋白mRNA表达下调,足突节段增宽,并出现白蛋白尿.     

小檗碱在高糖及糖基化终末产物诱导足细胞损伤中的保护作用

目的探讨小檗碱对糖基化终末产物(AGE)和高糖诱导下足细胞损伤及其骨架蛋白的影响及机制。 方法以条件永生性人足细胞作为研究对象,于含10%胎牛血清及100 U/L γ-干扰素的RPMI 1640培养液中进行体外培养,细胞增殖并诱导分化后进行分组处理。分别用高糖(30 mmo/L)、AGE(100 μg/ml)、小檗碱(10 μmo/L)处理48 h后,激光共聚焦检测技术观察纤维状肌动蛋白(F-actin),球状肌动蛋白(G-actin)变化;原位细胞免疫组化检测cspase-3,nephrin表达。采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。 结果共聚焦显微镜下观察显示,高糖及AGE作用下,足细胞F-actin出现重排,G-actin易位,小檗碱干预后有所恢复。免疫组化结果显示,对照组及高糖组几乎未见capase-3阳性表达,但高糖＋AGE组,capase-3呈阳性表达(F＝99.339,P<0.001);高糖＋AGE组nephrin表达显著降低(F＝165.84,P<0.001),与对照组及高糖组比较,差异均有统计学意义。小檗碱作用后,高糖＋AGE组capase-3的水平下降(F＝6.927,P＝0.048),nephrin表达水平升高(F＝165.84,P＝0.025),差异均有统计学意义。 结论在持续的高糖和AGE作用下,可引起足细胞骨架蛋白F-actin、G-actin重构及分布异常,并诱导足细胞凋亡,小檗碱能改善高糖和AGE引起的足细胞骨架蛋白损伤,并抑制足细胞的凋亡,其机制可能与nephrin的参与有关。     

抑制骨桥蛋白表达对肺癌侵袭、增殖的影响

目的 观察抑制骨桥蛋白(OPN)表达对肺癌细胞株A549侵袭、增殖的影响.方法 构建针对人OPN mRNA干扰质粒pENTR~(TM)/U6-INF(pINF-1)及对照质粒pENTR~(TM)/U6-CTR(pCTR),将其转染A549细胞.Western blot测定OPN的表达;噻唑蓝(MTY)比色法检测A549增殖力;Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭力的改变.结果 与空白对照组(1.23±0.16)比较,转染72 h后pINF-1组OPN蛋白表达(0.17±0.07)下降85%;转染 pINF-1后,A549细胞增殖力下降56%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).Matrigel实验示,与空白对照组(72.4±6.5)比较,转染pINF-1组细胞穿过人工基底膜的数量(15.2±2.8)明显减少,差异有统计学意义(P<0.01).结论 pINF-1可以特异性抑制肺癌细胞株A549中OPN的表达,可显著降低其侵袭力和增殖.     

狼疮肾炎患者自噬水平及其对足细胞相关蛋白表达水平的影响

目的探讨狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)患者自噬水平及其对足细胞相关蛋白表达水平的影响。方法选择2017年5月至2019年5月于榆林市第一医院收治的69例LN患者为LN组,50例系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者为SLE组,50例肾切除手术患者为对照组,观察3组肾脏足细胞内自噬体数量,比较3组肾脏组织中自噬相关蛋白、微管相关蛋白轻链3(LC3)、B淋巴细胞瘤蛋白质-2-相互作用蛋白(Beclin1)的表达,以及足细胞相关蛋白,肾病蛋白(Nephrin)、足突蛋白(Podocin)的表达。分离狼疮肾炎患者肾脏足细胞,将足细胞分为自噬抑制组和自噬诱导组,自噬抑制组加入100 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA),自噬诱导组加入100 nmol/L雷帕霉素(RAPA),比较3组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin等蛋白的表达。结果LN组、SLE组肾脏足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05);SLE组肾脏足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于LN组(P<0.05);自噬诱导组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于正常对照组、自噬抑制组(P<0.05);正常对照组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于自噬抑制组(P<0.05)。结论LN患者自噬水平呈升高状态,自噬水平升高可能通过上调足细胞相关蛋白Podocin、Nephrin水平而减轻足细胞损伤,抑制LN病情进展。     

Effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on glomerular podocyte injured by lipopolysaccharide

Objective To observe the effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSC) on glomerular podocyte injured by lipopolysaccharide (LPS) and the expression of related protein. Methods Podocytes are divided into control group, BMSC group, LPS group and LPS plus BMSC group. After 24 hours of intervention, observing each experimental group podocyte form under inverted phase contrast microscope;detecting the expressions of mRNA and protein of nephrin, CD2AP, synaptopodin, and TRPC6 by RT-PCR and Western-blot. Results Compared with control group, expressions of nephrin, CD2AP, and synaptopodin in LPS group decreased (P＜0.05) while that of TRPC6 increased (P＜0.05); compared with LPS group, expressions of nephrin, CD2AP, and synaptopodin in LPS+MSC group increased (P＜0.05) while that of TRPC6 decreased (P＜0.05). Conclusion BMSC may relieve LPS-induced podocyte injury.     

可诱导共刺激分子基因表达抑制降低大鼠T淋巴细胞活化增殖能力的研究

目的 RNAi抑制大鼠T淋巴细胞可诱导共刺激分子(ICOS)基因表达,观察其对T淋巴细胞功能的影响.方法 选择4个干扰位点,插入pSilencer 4.1-CMV neo载体,转染大鼠淋巴细胞.RT-PCR检测ICOS基因的抑制程度,流式检测ICOS表达变化.MLR检测细胞的增殖能力,ELISA法检测细胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平.结果 转染后,T淋巴细胞ICOS的mRNA和ICOS分子表达水平下降(P＜0.05),淋巴细胞增殖能力明显降低,同时IFN-γ和IL-4的水平也减低.结论 大鼠淋巴细胞ICOS基因的表达抑制,降低了T淋巴细胞活化增殖能力.     

抑制骨桥蛋白表达降低肺癌侵袭和增殖的机制

目的 探讨抑制骨桥蛋白(OPN)表达降低肺癌细胞株A549侵袭、增殖的机制.方法 构建针对人OPN mRNA干扰质粒pENTRTM/U6-INF(pINF-1)及对照质粒pENTRTM/U6-CTR(pCTR),将其转染A549细胞,Western blot测定OPN、基质金属蛋白酶(MMP)和促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白的表达;明胶酶谱检测MMP的表达.结果 与空白对照组(1.20±0.15)比较,转染72 h后pINF-1组OPN蛋白表达(0.15±0.04)下降87%,与对照组比差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot的结果显示,pINF-1组细胞磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)、磷酸化丝裂原细胞外激酶(pMEK)和MMP-2的表达明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);而MMP-9表达差异无统计学意义(P＞0.05).明胶酶谱结果同样表明pINF-1组MMP-2的表达明显下降(P＜0.01).结论 抑制OPN的表达降低肺癌细胞株A549侵袭力和增殖的机制可能与抑制MAPK信号通路和MMP-2的表达有关.

Abstract：

Objective To explore the mechanism of invasion and proliferation of lung cancer cell line A549 mediated by osteopontin. Methods One double-stranded DNA vectors pENTRTM/U6-INF ( pINF-1 ) targeting the mRNA of human osteopontin ( OPN), and the control vector pENTRTM/U6-CTR (pCTR) mismatching with mRNA of OPN were constructed, and then they were transfected into human A549 cells with high metastatic potentials. Western blotting was used to quantify the protein level of OPN,matrix metalloproteinases (MMPs) and mitogen-activated protein kinases (MAPK). The activity of MMPs was detected by gelatin zymography. Parallel experiments were performed in sextuplicate. Results As compared with control group only transfected with LipofectamineTM 2000, OPN protein level in pINF-1 group was decreased by 87% 72 h after transfection (P ＜0. 05), and no significant difference was found in the group transfected with pCTR. Moreover, the expression levels of phosphorylated extracellular signal-regulated kinases 1/2 (pERK1/2), phosphorylated MAPK/ERK1/2 kinase (pMEK) and MMP-2 protein were also decreased in pINF-1 group (P ＜ 0. 01 ). The activity of MMP-2 but not MMP-9 was decreased significantly in pINF-1 group (P ＜ 0. 01 ). Conclusion OPN plays an important role in metastasis as well as tumor growth of lung cancer cells probably through activation of the MAPK pathways and MMP-2.