兔抗人肥大细胞羧肽酶抗体的制备与鉴定

目的：以原核表达的人肥大细胞羧肽酶（hMC-CP）免疫家兔，制备兔抗hMC-CP多克隆抗体并进行鉴定。方法：在大肠杆菌中诱导表达重组hMC—CP，经Ni-NTA—Agarose柱层析纯化后，以其为免疫原制备兔抗hMC-CP多抗，并以间接ELISA测定抗体效价，以Western blot鉴定抗体的特异性。结果：成功地表达并纯化了hMC-CP，以纯化的重hMC-CP组免疫家兔成功制备了兔抗hMC-CP抗体，ELISA结果显示效价达1：6400，Western blot分析表明该抗体能特异结合hMC—CP。结论：以纯化的重组hMC—CP为免疫原，成功地制备了效价、特异性较强兔抗hMC-CP抗体，为进一步建立简便的hMC-CP检测方法及进一步研究hMC-CP生物学功能打下了良好的基础。     

血清肥大细胞羧肽酶与支气管哮喘的相关性研究

目的：检测支气管哮喘患者外周血中肥大细胞羧肽酶的含量,研究其与哮喘患者FEV 1(%)、IgE的关系,探讨其在支气管哮喘发病机制中的作用。方法：35例临床确诊为中重度持续性支气管哮喘患者作为病例组,均行肺功能及IgE水平检测,依据血清IgE水平将支气管哮喘患者分为IgE升高组（n=20）和IgE正常（n=15）。另外,选取22名健康者作为对照组,采用ELISA法检测受试者血清肥大细胞羧肽酶水平。比较支气管哮喘患者与健康者血清中肥大细胞羧肽酶水平;分析血清肥大细胞羧肽酶水平与IgE及肺功能的相关性。结果：IgE升高组患者血清肥大细胞羧肽酶水平明显高于IgE正常组（P＜0.05）;支气管哮喘急性发作期患者血清肥大细胞羧肽酶水平明显高于健康对照组（P＜0.05）;另外,哮喘急性发作期患者血清肥大细胞羧肽酶水平与患者FEV(%)呈明显的负相关;缓解期血清肥大细胞羧肽酶水平与FEV-1(%)无相关性（r=-0.421, P=0.012;r=-0.284,P=0.099）。结论：血清肥大细胞羧肽酶可能参与了支气管哮喘急性发作的气道炎症反应。     

人肥大细胞类糜蛋白酶基因的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆人肥大细胞类糜蛋白酶cDNA,并进行原核表达,制备重组蛋白免疫家兔,制备兔抗类糜蛋白酶多克隆抗体。方法:用RT-PCR技术克隆类糜蛋白酶cDNA,用Gateway技术构建表达载体,以大肠杆菌为宿主,用L-阿拉伯糖诱导重组肥大细胞类糜蛋白酶的表达,经Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备兔抗类糜蛋白酶多抗,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:成功地克隆了人肥大细胞类糜蛋白酶cDNA,并在大肠杆菌BL21-AI中表达成功,用纯化的重组类糜蛋白酶为免疫原,免疫家兔制备了兔抗类糜蛋白酶抗体,ELISA结果显示效价达1:12800,Western blot分析表明该抗体能特异结合类糜蛋白酶。结论:以纯化的重组类糜蛋白酶为免疫原,成功地制备了效价及特异性较高的兔抗类糜蛋白酶抗体,为进一步建立简便的类糜蛋白酶检测方法及研究类糜蛋白酶生物学功能奠定了良好的基础。     

小鼠PGRP-L编码区基因的克隆及序列分析

目的：获得小鼠长型肽聚糖识别蛋白（mPGRP—L）全长编码区基因。方法：采用RT—PCR技术，从BALB／c鼠肝组织总RNA中扩增PGRP-L编码区基因片段，将其插入pUCm-T载体，以PCR和测序进行鉴定。结果：从BALB／c小鼠肝脏cDNA中，分别以Primer—F和Primer—R1、Primer—F1和Primer—R为引物对进行PCR，扩增得到约1050bp的上游基因片段和约540bp的下游基因片段。以纯化的上、下游片段为模板，Primer—F和Primer—R为引物进行PCR，扩增获得约16aHDbp的DNA片段，并将其克隆至pMD18-T载体获得重组质粒pMD18-mPGRP-L。鉴定结果表明，mPGRP—L编码区基因全长1593bp，与GenBank中mPGRP—LcDNA比较仅2个位置的核苷酸不同，两者的同源性为99．87％。结论：成功地克隆了mPGRP—L的cDNA，为mPGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

TLMV5‘非编码区基因的克隆与序列分析

目的 调查ＴＴＶ阴性的非甲￣庚型肝炎患者中ＴＴＶ－ｌｉｋｅ ｍｉｎｉ ｖｉｒｕｓ（ＴＬＭＶ）感染情况,对ＴＬＭＶ５’非编码区（５’ＮＣＲ）部分基因进行分子克隆与序列分析。方法 采用巢式ＰＣＲ技术检测５３例ＴＴＶ阴性的非甲－庚肝炎患者血清ＴＬＭＶ ＤＮＡ,对ＰＣＲ产物进行克隆、测序和分析。结果 ５３例病例中ＴＬＭＶ ＤＮＡ阳性３７例（６９．８％）,对其中８株ＴＬＭＶ基因克隆测序,并与Ｔａｋａｈａｓｈ     

人羧肽酶A的cDNA克隆和原核表达

目的：获得人羧肽酶Ａ基因,为进一步构建,表达抗人精浆蛋白单链抗体／羧肽酶Ａ融合蛋白,用于前列腺癌的抗体导向酶－前体药物疗法奠定基础。方法：从正常肺组织中提取总ＲＮＡ,经反转录ＰＣＲ分离人羧肽酶Ａ基因,并克隆入ｐＵＣ１９质粒中,用全自动荧光测序仪测定其序列。     

中国4株丁型肝炎病毒抗原编码区基因的cDNA克隆与…

从我国四川、广西、河南的丁型肝炎、病毒抗原（ＨＤＡｇ）或抗体阳性的ＨｂｓＡｇ携带者中，筛选出４株ＨＤＶ ＲＮＡ阳性标本，经逆转录和聚合酶反应（ＲＴ－ＰＣＲ）后，获得包含ＨＤＶ抗原编码区的ｃＤＮＡ片段，并对其进行克隆与序列测定。经计算机分析比较表明：四川、广西株与美国－１株同源性最高，分别为９９．３％、９９．０％；而河南－１、河南－２株与台湾株的同源性较高，分别为９４．３％、９２．１％；上述４株与日     

从人血液中克隆过氧化氢酶基因

目的 从人血液中克隆过氧化氢酶基因.方法 以新鲜的人血液为材料,提取全血RNA,运用RT-PCR方法扩增过氧化氢酶基因,构建pMD18T/CAT克隆载体,并进行了不同来源过氧化氢酶的氨基酸序列同源分析.结果 从人血液中成功扩增出过氧化氢酶基因,获得了重组载体PMD-18T/CAT,氨基酸序列分析的同源性达80% 以上.结论 从人血液中可以很方便地克隆出过氧化氢酶基因.     

TTV部分基因的克隆及序列测定

为了弄清萍乡地区ＴＴ病毒 (ＴＴＶ)感染情况 ,分析本地区ＴＴＶ株基因结构特点 ,我们对江西省萍乡地区 8例ＴＴ病毒株进行了部分基因的克隆及序列测定。1　材料和方法1 1　材料　血清标本采用本地区流行病学调查和本院的临床阳性标本。Ｔ载体、ＸＬ1 Ｂｌｕｅ菌为美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品。Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰｓ及Ｔ4ＤＮＡ连接酶购自华美公司。ＰＣＲ试剂由中国军事医学科学院提供。1 2　引物合成　根据Ｏｋａｍｏｔｏ等报道的ＴＴＶ基因序列 ,采用Ｇｏｌｄｋｅｙ软件在ＴＴＶＯＲＦ保守区设计两对套式引物 ,引物序列如下 :外…     

人胎儿胃肥大细胞的研究

观察了 40例不同胎龄胎儿胃底部两型肥大细胞发育、数量及分布和胃底部发育的关系 ,并探讨了甲醛固定对 CTMC和 MMC染色效应的影响。发现人胎儿胃 CTMC出现于受精后 13～ 16周的粘膜下层等处 ,主要分布在胃粘膜固有层近粘膜肌处 ,数量随粘膜层胃底腺及粘膜肌等结构的发育而增加。两型肥大细胞对甲醛固定的反应无明显差异。本文就肥大细胞在胃底部发育过程中的意义进行了讨论     

人核糖体磷酸蛋白P2基因的克隆及鉴定

利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ），从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ），并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克隆ｐＭＰ２－１、ｐＭＰ２－２的Ｐ２ ｃＤＮＡ进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本     

鸡干扰素基因的分子克隆与序列测定

目的：从接种新城疫Ｆ４８Ｅ９病毒的Ｌａ Ｓｏｔａ疫苗免疫鸡体外有丝分裂原刺激的脾淋巴细胞中克隆鸡干扰素基因。方法：应用逆转录多聚酶链式反应技术扩增,常规平端连接、转化及序列测定技术进行验证。结果：研究表明克隆得到的基因与国外报道的鸡胚成纤维细胞干扰素基因。结论：鸡在该状态下其脾淋巴细胞表达鸡胚成纤维细胞干扰素ｍＲＮＡ。     

鼠抗hTNF—α单克隆抗体轻链可变区基因片段的克隆和cDNA…

目的：获得鼠抗人肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）单克隆抗体轻链可变区基因序列。方法：采用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，以一对针对鼠Ｉｇ轻链可变区（ＶＬ）基因的引物，从分泌鼠抗ｈＴＮＦ－α单克隆抗体的Ｅ６杂交瘤细胞株中扩增和克隆ＶＬ基因片段，用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列，并进行计算机分析。结果：此ＶＬ基因长３４２ｂｐ，可编码１１４个氨基酸，为开放读框；有明确的框架区（ＦＲｓ）和抗原互补决定区     

藏酋猴类似人clock基因片段的克隆

目的：在藏酋猴中,寻找和克隆与人clock基因类似的基因。方法：提取藏酋猴外周血白细胞RNA,逆转录为全基因组eDNA,利用人clock基因保守序列设计相关引物,克隆,测序,进行生物信息学分析。结果：扩增得到1994bp的核酸序列。该序列与人,苏门答腊猩猩,绵羊,小鼠,褐家鼠,原鸡和蟾蜍clock基因核酸序列同源性分别为99％,98％,94％,90％,90％,82％和75％。结论：藏酋猴基因组中存在与人clock基因相似的基因,该基因可能为藏酋猴clock基因。     

人β2微球蛋白基因的克隆与鉴定

人 β2微球蛋白基因 (β2 ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ,β2 Ｍ)位于染色体15ｑ2 1～ 2 2 .2 ,成熟蛋白产物由 99个氨基酸组成 ,是ＨＬＡ Ⅰ类分子的轻链 ,在ＣＤ8+ 细胞毒Ｔ细胞 (ＣＴＬ)反应中起重要作用。近年发展的ＨＬＡⅠ 肽四聚复合物 (ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃｃｏｍｐｌｅｘ)技术 ,就是通过基因工程制备ＨＬＡ Ⅰ类分子的轻链和重链 ,模拟靶细胞膜表面的ＨＬＡⅠ 表位复合物与Ｔ细胞受体 (ＴＣＲ)结合来检测Ｔ细胞群中相应表位的特异性ＣＴＬ[1] 克隆。为此 ,我们采用逆转录聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)克隆了 β2 Ｍ ,并进行了鉴…     

人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定

目的：克隆和鉴定人淋巴细胞免疫反应性生长激素（ｉｒＧＨ）基因调控序列的核苷酸顺序。方法：通过ＰＣＲ扩增出人淋巴细胞ｉｒＧＨ基因５＇近端的调控序列,然后将其与质粒ＰＧＥＭ７Ｚｆ（＋）连接,经转化蓝白斑筛选、酶切鉴定,获得ＰＧＥＭ７Ｚｆ（＋）－ｉｒＧＨ ＤＮＡ（－４８４－＋２ｂｐ）重组质粒,进行序列测定。结果：显示ｉｒＧＨ基因５＇近端的调控序列与垂体细胞ＧＨ基因的５＇近端调控序列的核苷酸顺序完全相同。     

人源性羧肽酶 A突变体基因的构建及表达

目的从人正常肺组织中提取羧肽酶A基因并进行定点突变。方法从人正常肺组织中提取RNA,并进行逆转录得到人羧肽酶A(hCPA)。以计算机模拟hCPA的结构,寻找合适的突变位点。用PCR重叠延伸法,对羧肽酶A进行定点突变,并在大肠杆菌中表达。结果序列分析表明,所获hCPA的核苷酸序列为1251bp,编码417个氨基酸。hCPA突变体(mhCPA)基因的1126位核苷酸由G变为A,其余核苷酸序列均未发生变化,相应的此突变体蛋白质的376位核苷酸残基由丙氨酸突变为苏氨酸。将mhCPA基因在E.coli中诱导表达3h后,表达量高达30％左右。结论成功地构建并表达了mhCPA基因,为hCPA在肿瘤的“抗体导向酶前药疗法”(ADEPT)中的应用奠定了基础     

FasL基因转染对大鼠肥大细胞凋亡的影响

目的：观察FasL基因转染对大鼠肥大细胞凋亡的影响。方法：RT-PCR法扩增大鼠FasL穿膜区和胞外区cDNA，成功构建pcDNA3．1／FasL真核表达质粒，瞬时转染RBL-2H3，RT-PCR、免疫印迹法鉴定FasL在RBL-2H3上的表达，Annexinv流式细胞检测pcDNA3．1／FasL转染RBL-2H3后细胞的凋亡情况。结果：获得FasL穿膜区和胞外区eDNA，构建pcDNA3．1／FasL真核表达质粒，瞬时转染RBL-2H3后在细胞膜和上清均有FasL的存在，瞬时转染RBL-2H3后48小时，细胞发生凋亡。结论：吧大细胞可以通过Fas-FasL途径凋亡，为FasL基因应用于过敏性疾病的治疗提供依据。     

幽门螺杆菌ureB基因的克隆及序列分析

目的 对幽门螺杆菌（Hp)ureB核苷酸序列及推定氨基酸序列进行同源性比较分析,确定Hp菌株的ureB基因差异性,为疫苗的研究和诊断用品的评价提供依据。方法 自选设计引物,PCR扩增来自国内不同病人的4株Hp菌株的ureB基因,与pGEM-T载体克隆连接、测序;进一步同GenBank上发表的其他4株国外Hp菌株ureB的全基因序列进行比较分析。结果 8株Hp菌株的ureB基因序列出现了33种长度,CAPMF3和CPM630分别为1269bp和1680bp,其他为1710bp。6株1710bp的ureB基因序列的分析表明,国外3株Hp的ureB同源性较高,三者氨基酸的同源性达到100％。国内3株Hp的ureB变异较大,推定氨基酸同源性为98．7％－98．9％。结论 UreB作为保护性同时存在免疫保护覆盖率问题,研究疫苗和诊断用品时要注意选择使用在人群中流行占优势的Hp菌株的高度保守的UreB抗原肽,使其具有更高的覆盖率。