血浆miRNA-21作为急性主动脉夹层分子标记物的初步探索

目的通过急性主动脉夹层(AAD)病例对照研究分析血浆miR-21的相对表达水平,结合受试者工作曲线(ROC)及相关临床资料评估miR-21对AAD的诊断价值。方法收集华南地区汉族人群AAD 30例、心绞痛30例、急性心肌梗死(AMI) 29例及对照组29例样本,同时对各组样本的相关临床资料进行收集。通过实时荧光定量反转录聚合酶联反应分别检测各组血浆miR-21及内参基因miR-16表达水平,计算miR-21的相对表达量。结果与对照组比较,AAD组患者血浆miR-21的相对表达水平显著升高(P0.05)。心绞痛组、AMI组与AAD组比较,血浆miR-21的表达水平差异无统计学意义(P0.05)。ROC曲线分析显示曲线下面积(AUC)为0.664,95%置信区间为0.520～0.809,血浆miR-21对AAD诊断的敏感度为40%,特异度为96.6%。当miR-21相对表达量为0.034时,血浆miR-21对AAD诊断的敏感度为80%,特异度为20.7%。结论血浆miR-21检测对AAD的诊断具有一定的临床价值,但尚不足以支持其独立作为AAD理想的分子诊断标志物。     

miRNA-210在胃癌转移细胞株中的表达及功能预测

目的:筛选胃癌(gastric cancer,GC)转移相关的差异表达微小RNA(micro RNA,miR NA),探讨miR NA-210与GC转移的可能机制.方法:应用mi RNA表达谱芯片筛选GC高转移细胞株RF48及低转移细胞株RF1的差异表达mi RNAs,RT-PCR检测mi RNA-210在7种GC细胞株中的表达情况,利用mi RWalk软件获得mi RNA-210的靶基因,通过David在线软件(包括GO分析及KEGG通路预测)分析mi R-210靶基因的可能生物学功能.结果:与RF1相比,mi RNA芯片在RF48细胞中共筛选出21个表达上调和15个表达下调的mi RNA,其中mi RNA-210在高转移细胞株RF48中的表达增高;RT-PCR结果显示m i R N A-210在高转移G C细胞株中表达增高(P0.05);mi RWalk共获得155个mi RNA-210靶基因;GO分析及KEGG pathway分析得到miR NA-210靶基因功能,这些靶基因参与了肿瘤的发生、发展及转移.结论:利用mi RNA芯片技术获得了GC转移相关mi RNA表达谱;mi RNA-210的异常表达可能与GC的转移有关,为GC转移的早期诊断及发现新的治疗靶点奠定了基础.     

急性主动脉夹层与正常对照主动脉组织基因的差异表达

目的通过组织芯片技术分析急性主动脉夹层患者主动脉组织差异表达基因探讨主动脉夹层发病的分子机制。方法取急性主动脉夹层患者及健康对照（各4例）的主动脉组织,通过组织芯片筛选急性主动脉夹层患者和健康对照差异表达的基因。利用生物信息学技术分析差异表达的基因参与的信号通路。结果实主动脉组织芯片分析结果显示,急性主动脉夹层患者与正常对照差异表达大于2倍的基因有129个,其中83个基因表达下调,46个基因表达上调。差异表达的基因主要编码与细胞、细胞外基质粘附相关的蛋白。信号通路分析显示,主动脉夹层中受影响最大的两条通路是粘附斑和肌动蛋白骨架调节相关通路。结论通过组织芯片分析筛选到的急性主动脉夹层差异表达基因可能参与了主动脉夹层的病理过程,为研究其致病机制奠定了荩础。     

系统性红斑狼疮患者循环微小RNAs差异表达的初步分析

目的 检测系统性红斑狼疮(SLE)患者血浆中差异表达的微小RNAs(miRNAs),为寻求一种新的无创性SLE生物标志物奠定基础.方法 采用Agilent human miRNA芯片检测并筛选出SLE患者与健康人血浆中表达丰度有显著变化miRNA,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)对部分差异表达基因进行验证.2组间的比较用独立样本的t检验.结果 MiRNAs芯片检测发现,SLE患者与健康对照间存在明显差异的循环miRNAs共有51个,其中19个上调,32个下调;RT-qPCR对其中4个上调(miR- 126、miR-21、miR-223和miR-451)和3个下调(miR-125a-3p、miR-146a和miR-155)循环miRNAs的验证结果与芯片数据所示具有较好的一致性.结论 SLE患者和健康人体内循环miRNAs的表达谱存在着明显差异,这些差异的循环miRNAs可作为一种潜在的SLE候选生物标志物.     

新发展晚期血吸虫病患者循环microRNAs表达谱的初步研究

目的研究新发展晚期血吸虫病(晚血)患者循环miRNAs的表达谱特征。方法选取新发展晚血患者、未达到晚血的有史经治人群和健康对照人群各10例,采用Agilent Human micro RNAs microarray Rel 12.0芯片,检测570个人类相关的循环miRNAs的表达水平,分析各组循环miRNAs的表达差异。结果与健康对照人群相比,新发展晚血患者的miRNAs有4个表达上调,16个表达下调。而在健康对照和有史经治组的血清中存在着差异表达的miRNAs共有27个,其中6个表达上调,21个表达下调。其中mi R-383在有史经治组和新发展晚血患者组中的表达分别降低了4.23倍和11.82倍。结论新发展晚血患者、有史经治者和健康人群之间循环miRNAs的表达特征存在显著差异,循环mi R-383可能与新发展晚血的发生发展有关,值得进一步研究。     

DNA甲基化转移酶在急性A型主动脉夹层发病机制中的作用

目的探讨DNA甲基化转移酶(DNMTs)与急性A型主动脉夹层(Acute aortic dissection,AAD)发生发展之间的关系。方法收集5例急性A型AAD患者病变血管组织和4例无主动脉疾病的器官捐献者的升主动脉血管组织,采用Western Blot方法检测DNMTs(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L)的蛋白在患者和正常对照血管组织中的表达情况。结果与健康对照组相比,整体上DNA甲基化转移酶蛋白在A型AAD患者病变血管组织中表达下降,DNMT1蛋白在A型AAD患者病变血管组织中表达较正常对照下降约50%(P=0.023),DNMT3B蛋白在A型AAD患者病变血管组织中表达下降约50%(P=0.009);DNMT3A和DNMT3L蛋白在A型AAD患者病变血管组织中表达下降趋势,尽管无统计学意义(P=0.414,P=0.16)。结论 DNA甲基化转移酶在急性A型AAD患者病变血管组织中表达水平较正常对照呈下降趋势,DNA甲基化是否参与A型AAD病变的发生发展尚需进一步研究。     

人主动脉夹层与正常主动脉基因表达谱的差异

目的:利用基因芯片技术研究人主动脉夹层组织与正常主动脉组织基因表达谱的差异。方法:选取主动脉夹层病例标本5例,正常主动脉标本4例。提取总RNA,并反转录成cDNA、体外转录合成aRNA后与芯片进行杂交,对结果进行分析。同时对表达谱筛选出MYLK、PKD1、MYH11、SOD3、FLNA、TAGLN 6个差异基因进行基因转录水平的定量验证。结果:人主动脉夹层组与正常主动脉组比较基因表达差异倍数大于2的基因共有1 661个,其中有997个基因上调表达,664个基因下调表达。6个基因RT-qPCR验证结果表明,与正常组相比,6个基因都下调表达,其中MYLK、PKD1、MYH11、SOD3、TAGLN基因下调表达是有显著性差异的(P≤0.05),FLNA基因没有显著性差异(P0.05)。结论:通过全基因组表达谱芯片可以筛选主动脉夹层与正常主动脉表达差异基因,同时结合RT-qPCR验证,为研究主动脉夹层提供新的思路。     

MicroRNA-21及其靶基因程序性细胞死亡因子4在动脉粥样硬化中的作用

目的探讨microRNA(miR)-21及其靶基因程序性细胞死亡因子4(PDCD4)在动脉粥样硬化(AS)发生发展中的作用。方法收集38例急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者及34例非冠心病患者的血浆,实时定量PCR检测miR-21的表达水平。在Lipo3 000的介导下,将miR-21类似物、抑制剂及沉默PDCD4(siP DCD4)分别转染鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞,并用氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)与细胞共同孵育,设立空白对照组(未转染且未加ox-LDL)及ox-LDL组(仅加oxLDL)。采用油红O染色检测细胞泡沫化程度,实时定量PCR及Western blot分别检测泡沫细胞中miR-21及PDCD4蛋白水平。此外,建立ApoE~(-/-)小鼠AS模型20只,按随机数字表法分为3组:单纯高脂喂养组6只、过表达miR-21组7只及阴性对照组(NC,7只),鼠尾静脉注射胆固醇包裹的miR-21激动剂(agomiR-21)及阴性对照agomiR-NC分别建立过表达miR-21组及NC组。选用正常饲料喂养的C57BL/6小鼠作为正常对照组。实时定量PCR检测miR-21在AS斑块及正常动脉组织中的表达;Western blot及免疫组化分别检测PDCD4蛋白水平。结果与相应的对照组比较,miR-21在STEMI患者血浆、泡沫细胞及单纯高脂喂养ApoE~(-/-)小鼠斑块组织中的表达水平均明显升高(P<0.001;P<0.01;P<0.01);泡沫细胞及单纯高脂喂养ApoE~(-/-)小鼠斑块内PDCD4蛋白水平明显增多;与ox-LDL组比较,ox-LDL+miR-21类似物组及ox-LDL+siP DCD4组巨噬细胞泡沫化程度明显下降,ox-LDL+miR-21抑制剂组细胞泡沫化程度明显增加。过表达miR-21组AS斑块内PDCD4蛋白水平较NC组明显减少,且斑块较NC组明显减小。结论 miR-21在急性STEMI患者血浆中、泡沫细胞及AS斑块内的水平明显升高。过表达miR-21及沉默PDCD4可抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化,这与动物组织实验结果一致,表明miR-21或可靶向调控PDCD4的表达,从而发挥抗AS的作用。     

原发性高血压合并心力衰竭患者血浆microRNA表达谱的改变

目的应用微小RNA(miRNA)基因表达谱芯片技术筛查miRNA在原发性高血压(EH)合并心力衰竭患者血浆中的差异表达,旨在进一步探索EH合并心力衰竭发生发展的分子机制。方法收集50例来自医院心血管内科住院部的EH合并心力衰竭急性发作期患者作为实验组。随机选取50例EH不合并心力衰竭患者做为对照组。测定受试者血脂、血压、体质量指数(BMI)、氨基末端脑钠尿肽前体(NT-proBNP)水平,评估临床症状和超声心动图心功能情况,常规抽提总RNA,应用CapitalBio公司miRNA芯片检测miRNA表达谱,并对差异表达的miRNA进行实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证,观察相应差异表达的miRNA与NT-proBNP的相关性。结果与对照组比较,实验组血脂、血压、BMI差异无统计学意义(均P0.05)。实验组患者血浆miRNA表达谱中明显差异表达的miRNA共有19个,其中有12个miRNA上调(miR-142-3p、miR-196、miR-28、miR-208等),7个miRNA下调(miR-542、miR-199a、miR-21、miR-195等),与qRT-PCR结果基本相符。miR-142-3p、miR-196与NT-proBNP呈明显正相关。与对照组比较,心功能Ⅱ级患者血浆miR-142-3p和miR-196表达水平分别升高(4.44±0.21)倍和(3.78±0.20)倍(均P0.05),在心功能Ⅲ级患者分别升高(10.09±0.19)倍和(9.88±0.25)倍(均P0.05),在心功能Ⅳ级患者分别升高(15.34±0.18)倍和(13.83±0.22)倍(均P0.05);miR-542、miR-199a与NT-proBNP呈明显负相关。与对照组比较,心功能Ⅱ级患者血浆miR-542和miR-199a表达水平分别降低(91±11)%和(85±10)%(均P0.05),在心功能Ⅲ级患者分别降低(55±9)%和(51±15)%(均P0.05),在心功能Ⅳ级患者分别降低(24±8)%和(22±7)%(均P0.05)。结论 EH合并心力衰竭患者血浆中miRNA的表达有明显改变,并随着心力衰竭严重程度的增加而相应改变,与NT-proBNP明显相关,提示部分血浆miRNA可作为预测EH合并心力衰竭患者疾病进展的新型生物学标志物。     

miR-944在食管鳞癌中的表达及其对Eca109细胞增殖、侵袭的影响

目的探讨miR-944在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中的表达与临床意义及其对食管癌细胞Eca109增殖和迁移能力的影响.方法收集36例经病理确诊的ESCC患者手术切除癌及癌旁组织,采用实时荧光定量PCR(realtime quantitative PCR,q RT-PCR)检测癌组织和癌旁组织中mi R-944表达,并分析mi R-944在不同临床病理资料之间的差异.脂质体法转染mi R-944 mimics、inhibitors、无关对照序列(negative control,NC)到Eca109细胞,q RT-PCR检测各组mi R-944表达水平,MTT法检测转染后24、48、72、96 h增殖能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果m i R-944在E S C C组织表达水平显著高于癌旁组织(P0.01).同时,mi R-944在癌症组织中的表达水平随患者TNM分期的升高而升高(P0.01),而淋巴结转移阳性组mi R-944表达水平显著高于阴性组(P0.01).与NC组相比,mi R-944 mimics和inhibitors转染组m i R-944表达水平显著升高和细胞增殖能力明显均增强,而inhibitors组均受到抑制(P0.01).结论mi R-944在ESCC组织表达上调,并与ESCC TNM分期和淋巴结转移相关,其可能通过促进癌细胞的增殖和侵袭能力参与ESCC的发生与发展.     

miR-350在腹主动脉部分缩窄大鼠心肌组织中的表达及意义

目的观察腹主动脉部分缩窄大鼠心肌组织miR-350在心肌肥厚形成过程中的表达变化并探讨其临床意义。方法将20只雄性SD大鼠随机分成正常组5只、假手术组5只和模型组10只,采用腹主动脉部分缩窄术制备大鼠心肌肥厚模型。采用Trizol法提取心肌组织RNA,芯片技术检测miRNA表达。构建过表达miR-350质粒载体,转染大鼠的胚胎心肌细胞H9c2;采用Real-time PCR方法检测心肌细胞中ANP、BNP、β-myosin及α-actin的表达。结果 miR-350在模型组的表达量明显高于对照组;过表达miR-350的细胞中ANP mRNA及BNP mRNA升高(P<0.05或<0.01)。结论在腹主动脉部分缩窄大鼠的心肌组织中miR-350表达升高,且介导心肌细胞肥厚。     

急性主动脉夹层患者血浆基质金属蛋白酶-8,-9、肿瘤坏死因子-α和C反应蛋白水平临床分析

目的 评估血浆基质金属蛋白酶-8,-9（MMP-8、-9）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和C反应蛋白（CRP）浓度与急性主动脉夹层（AAD）发生之间的潜在关系.方法 收集201 1年1月～2012年8月52例AAD患者人院血液标本,并同期收集56例冠心病患者和60例健康对照组的血液标本,分别检测MMP-8、MMP-9、TNF-α和CRP的血浆浓度.结果 AAD患者血浆中MMP-8、MMP-9和CRP的表达水平明显高于冠心病组和健康对照组（P＜0.05）;TNF-α水平虽高于冠心病组和健康对照组,但差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 血浆MMP-8、MMP-9和CRP升高与AAD发生具有明确相关性,对AAD的早期诊断具有一定的临床意义.     

醛固酮对大鼠主动脉尾加压素Ⅱ及其受体表达的影响

目的观察大鼠在正常盐饮食情况下,醛固酮增多时对主动脉和尾加压素Ⅱ(UⅡ)及其受体(UT)的影响。方法将16只大鼠随机分为正常组和醛固酮组,每组8只,醛固酮组采用醛固酮皮下注射(20μg/d),常规饲养6周,用Masson染色血管胶原沉积情况,用放射免疫法检测血浆和主动脉组织UⅡ的含量;用免疫组织化学法检测主动脉组织UT的表达。结果 Masson染色可见醛固酮组大鼠主动脉有大量胶原沉积,主动脉组织UⅡ含量明显上调(P0.01),UT表达同步上调,但是两组血浆UⅡ含量比较差异无统计学意义(P0.05)。结论醛固酮可上调UⅡ及其受体表达,并促进动脉纤维化,提示醛固酮上调UⅡ及其受体表达可能是其促进动脉纤维化的另一作用途径。     

miR-10b通过Twist调节鼻咽癌表达机制的研究

目的探究miR-10b调节鼻咽癌促进鼻咽癌细胞转移的作用机制和其和Twist的作用关系。方法采用脂质转染技术分别用miR10bmimics和mimics-NC及miR10binhibitor及Twist siRNA转染或共转染CNE-2Z细胞,应用qRT—PCR检测miR-10b的表达水平。结果 (1)miR-10b mimic组中miR-1 10b的表达明显高于NC组(P0.05),inhibitor组中miR-10b的表达明显低于NC组和miR-10b mimic组(P0.05),TwistsiRNA+miR-10bmimics组miR-l0b的表达明显低于NC组和miR-10b mimic组(P0.05),inhibitor组和TwistsiRNA组miR-1 10b的表达没有明显差别表达(P0.05)。(2)制作划痕2h后便有细胞越过划痕生长,4h后miR-10b mimic组细胞移动至划痕内生长的细胞数超过inhibitor组和TwistsiRNA组,至6h和8h再次计数,析因设计的方差分析结果显示,制造划痕2h-8h两组移动细胞数有显著差异(P0.05)。结论我们揭示了Twist诱导miR-1 10b表达,提高鼻咽癌细胞转移能力。     

先天性心脏病继发性肺动脉高压患者血浆中miRNA的研究

目的 应用微小RNA （microRNA,miRNA）芯片技术研究先天性心脏病合并重度肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）患者和不合并PAH患者血浆中miRNA表达谱的差异,并初步预测差异表达的miRNA调控的靶基因.方法 收集室间隔缺损（ventricular septal defect,VSD）合并重度PAH（PAH组）和不合并PAH患者（对照组）的血浆.分别提取总RNA,然后采用miRNA芯片进行miRNA表达谱差异分析,并对结果进行实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）验证.运用Targetscan、Pictar、Miranda软件预测可能调控的靶基因.结果 miRNA芯片结果提示：与对照组相比,左向右分流先天性心脏病继发重度PAH患者血浆中表达上调的miRNA有50个,表达下调的miRNA有36个.实时定量PCR验证miR-98与芯片结果一致,表达上调.靶基因预测软件显示内皮素（ET-1）为hsa-miR-98的重要靶基因.结论 miRNA在先天性心脏病继发重度PAH患者血浆中存在差异性表达,miRNA可能与PAH的发生、发展密切相关,血浆miR-98有可能成为先天性心脏病合并重度PAH的新的分子生物学标志物.     

长链非编码RNA RMRP和miR-34在肝细胞癌组织的表达及相关性

[目的]探讨长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,Lnc RNA)线粒体RNA处理核糖核酸内切酶RNA组份(RNA component of mitochondrial RNA-processing endoribonuclease,RMRP)对肝细胞癌(HCC)细胞生物学行为的作用及与患者预后的关系。[方法]购得66例HCC组织和16例癌旁组织的cDNA芯片,采用实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR,qRT-PCR)法检测HCC组织中RMRP和微小RNA-34(microRNA-34,miR-34)的表达;分析RMRP表达与患者临床病理参数之间的关系;并分析RMRP表达与miR-34表达二者间的相关性。将SMMC-7721细胞系分为空白组(negative control,NC)、对照组(sh-vector)和实验组(sh-RMRP),分别为未感染慢病毒、只感染空载质粒及感染sh-RMRP-慢病毒(lentivirus,lenti),采用MTT实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力。[结果]RMRP在HCC组织中的表达明显高于癌旁组织(t=13.41,P0.05),且HCC组织中RMRP的表达与T分级、TNM分期及是否复发相关(P0.05);RMRP与miR-34表达呈明显负相关(r=-0.802,P0.05);细胞转染后培养12、24、48、72 h后,sh-RMRP组吸光度值(OD490值)明显低于NC组和sh-vector组(分别F=30.42,73.68,52.94,107.37,P0.05);sh-RMRP组克隆形成数明显低于NC组和sh-vector组(F=257.0,P0.05),RMRP高表达患者总体生存率明显低于RMRP低表达患者(P0.05)。[结论]LncRNA RMRP在HCC组织中呈高表达,提示HCC患者预后不良。     

miR-155、miR-21在黏膜相关淋巴样组织结外边缘区淋巴瘤组织和细胞中的表达及意义

目的:探讨miR-155、miR-21在黏膜相关淋巴样组织结外边缘区淋巴瘤(MALT)组织和细胞中的表达及其对人MALT淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:qPCR检测比较MALT淋巴瘤组织和瘤旁组织miR-155、miR-21表达量,然后在人MALT淋巴瘤细胞中分别转染miR-155mimic/mimic NC及miR-21mimic/mimic NC,qPCR验证转染是否成功,CCK8法测各组细胞增殖情况,流式细胞术测细胞凋亡情况。结果:MALT淋巴瘤组织中miR-155、miR-21表达较瘤旁组织明显上调,差异有统计学意义(P0.05)。在模拟物转染组细胞增殖较对照组明显增加,而凋亡率明显下调(均P0.05)。结论:上调的miR-155、miR-21与MALT淋巴瘤的发生、发展具有相关性,对MALT淋巴瘤的诊断及治疗具有重要意义。     

冠心病患者血浆微小RNA作为生物标记物可能性的研究

目的探讨微小RNA(miRNA)在动脉粥样硬化性心脏病患者循环血浆中表达特点。方法选择男性冠心病患者32例作为冠心病组,男性健康体检者20例作为对照组。另选择载脂蛋白(apo)E-/-小鼠10只为实验组,正常C57BL/6J小鼠10只为观察组,用高通量基因芯片技术分析实验组和观察组小鼠血浆中差异表达的miRNA。用实时定量PCR法检测冠心病组和对照组miRNA的表达。结果与观察组比较,实验组小鼠血浆有14种miRNA显著差异表达,其中6种显著上调3.02~3.46倍,8种显著下调3.02~4.21倍。与对照组血浆miRNA表达比较,冠心病组miR-34a和miR-21显著上调、miR-23a显著下调(P<0.01)。结论冠心病患者循环血浆中miR-23a、miR-21、miR-34a较健康人群明显升高,提示这3种miRNA具有成为冠心病患者生物标记物的潜能。     

抗结核药物肝损伤与无肝损伤患者化疗前血循环miRNA分子的差异性表达

目的:研究抗结核药物肝毒性(anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity,ATDH)与非ATDH患者化疗前血浆差异性表达的miRNA分子,为ATDH易感者筛检提供新的生物学指标.方法:采用miRNA芯片检测ATDH及对照患者化疗前血浆标本.对存在差异表达趋势的25种miRNA分子,采用高通量实时荧光定量PCR进行分析验证.应用互联网上miRNA靶基因预测软件对表达上调的miRNA进行靶基因预测,并采用PANTHER tool查找靶蛋白GO功能分类.结果:与对照组相比,ATDH患者化疗前血浆中共检出7个差异性表达的miRNA分子,其中表达上调的miRNA有4个,包括miR-4284、miR-3620、miR-652-5p和miR-4800-5p;表达下调的miRNA有3个,包括miR-338-3p、miR-424-5p和miR-194-5p.结论:ATDH患者化疗前血浆内存在差异性表达的miRNA分子,其中表达上调的miRNA分子(特别是miR-4284)可能作为ATDH易感者筛检的生物学指标.