《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》评述

【摘要】高通量测序技术以其高输出量、高解析度的显著优势,在肿瘤基因检测领域被广泛应用。中国临床肿瘤学会肿瘤标志物专家委员会和中国肿瘤驱动基因分析联盟制定了《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》,本文结合该共识从二代测序技术（NGS）检测在肿瘤精准诊断中的应用价值、检测流程和质量保证、结果报告等方面进行简要评述,以指导临床医师和NGS检验从业人员更好地进行临床应用。     

基因组技术在肿瘤分子诊断中的应用

肿瘤是基因组疾病,基因组变化在肿瘤发生和发展中起着重要的作用。近20年来随着肿瘤基因组研究的不断深入,发现了许多肿瘤基因组在DNA、基因表达、遗传表观等不同水平的变化特征,为基因组水平肿瘤分子诊断和分型奠定了理论基础。由于肿瘤临床标本的特殊性,传统的分子生物学技术无法有效地分析肿瘤基因组变化。随着以基因芯片和第二代DNA测序(Next generation sequencing,NGS)技术为代表的全基因组分析技术的迅速发展,为高容量和高精密度分析肿瘤基因组变化提供新的手段。本文综述目前国际上主要的基因组分析技术,重点介绍其在肿瘤分子诊断中的应用价值,展望全基因组技术在肿瘤诊断和个体化治疗上的应用前景。     

单分子实时测序技术在1例21-羟化酶缺陷症患儿基因检测中的临床应用

目的 应用单分子实时测序(single molecular real-time sequencing, SMRT)技术明确1例21-羟化酶缺陷症患儿的分子病因,并探讨SMRT用于临床基因检测的可行性。方法 应用SMRT技术对先证者先天性肾上腺皮质增生症候选基因进行长读长测序,检测结果与多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)和Sanger测序检测的家系结果进行比较。结果 SMRT结果提示,先证者CYP21A2基因存在3个致病变异,先证者的一条染色体上串联排列两个重复的基因拷贝,分别为包含c.955C>T变异的CYP21A2基因和包含c.1069C>T变异的CYP21A2/CYP21A1P嵌合基因;另一染色体上的CYP21A2基因缺失。检测结果与家系MLPA+Sanger测序的结果相同,并明确了CYP21A2/CYP21A1P嵌合基因的排列方式。结论 SMRT技术能够明确基因拷贝数变异、结构变异及嵌合基因的排列方式,可为21-羟化酶缺陷症遗传学诊断和携带者筛查提供更有价值的信息,具有较...     

高通量测序技术的研究进展

高通量测序技术又称二代测序技术(NGS),与被认为是第一代测序技术的传统Sanger毛细管电泳测序方法相比,二代测序技术以更低的成本提供更高通量的数据,并实现大规模的基因组研究,单次运行数据量大,可以同时对数百万个DNA分子实施测序。随着当代科学技术的进步,二代测序平台已逐渐被引入包括肿瘤学在内的众多领域中,如临床诊断,农业基因组学和法医学等。尽管NGS目前已广泛用于目的性研究,但由于该方法的新颖性,在临床实践中的应用尚未完全指南式化,大多数临床医生对NGS认知及解读能力参差不齐。该文就NGS方法、原理及其优劣性进行综述,旨在帮助临床医生利用NGS技术对疾病进行更全方位的诊疗提供参考。     

高通量测序技术在口腔疾病中的应用进展

高通量测序技术即下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)或深度测序,广泛应用于全基因组和转录组的测序、基因组修饰的鉴定和蛋白质相互作用的分析。高通量测序技术不仅可以全面认识口腔微生物群落在健康和疾病状态下的特征,而且可以认识某种口腔微生物的生物功能及其在群落中的作用。对患者健康和患病细胞的基因组、外显子或转录组高通量测序的见解已经能够改善许多口腔疾病的诊断分类、预测和治疗选择。目前高通量测序技术在口腔疾病研究中应用广泛,本文将从高通量测序技术平台的发展及高通量测序技术在龋病、牙周病、口腔鳞状细胞癌和其他口腔疾病中的应用进行综述。     

新生儿基因筛查在遗传性疾病中的应用进展

近年来,随着分子生物学的快速发展,高通量测序（next generation sequencing,NGS）等基因检测技术在遗传性疾病筛查诊断领域有极高的应用价值,特别是在新生儿疾病防治方面。新生儿基因筛查旨在早期发现新生儿患遗传性疾病风险,为临床诊断和治疗提供依据。本文综述新生儿基因筛查作为一级筛查在基因表型明确的单基因遗传性疾病（遗传性耳聋、脊髓性肌萎缩症、地中海贫血、原发性免疫缺陷及进行性假肥大性肌营养不良等）中的应用、作为二级筛查联合生化筛查在遗传代谢性疾病中的应用及其在重症监护病房危重症新生儿疾病诊断中的应用。     

NGS自动化平台在HLA基因分型的建立及应用

目的 建立基于二代测序（next-generation sequencing,NGS）技术对人类白细胞抗原（human leucocyte antigen,HLA）基因进行分型的自动化操作平台,并评估其在HLA常规检测中的应用。方法 根据试剂盒操作说明编写相应的计算机程序,利用Hamilton Microlab STARlet全自动液体处理工作站联合96通道小型液体工作站、荧光化学发光分析仪等仪器,实现NGS技术对HLA基因分型过程中文库制备步骤的自动化操作。结果 手工法和自动化平台获取的文库片段两者读长基本一致,浓度及质量均符合要求,测序结果一致;而自动化平台操作时间明显少于手工操作。结论 建立的NGS自动化操作平台检测HLA基因分型方法可行,值得推广使用。     

下一代测序在孟德尔型运动障碍中的应用(英文)

在过去10年中，下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)得到了十分迅速的发展。与传统测序相比，NGS具有高通量和高灵敏性等优点。孟德尔型运动障碍是一类常见的神经疾病。由于样本较少等原因，通过连锁分析等传统方法寻找新的孟德尔型运动障碍尤其是罕见疾病的致病基因已经变得越来越困难，而NGS则可作为发现新的致病基因的理想手段。目前NGS已被应用于多种孟德尔型运动障碍的研究。本文将从基因组和转录组的角度对NGS在孟德尔型运动障碍中的最新应用进行综述，并展望NGS在罕见孟德尔型疾病中的应用。     

单细胞测序技术在肿瘤中的研究进展

肿瘤异质性是恶性肿瘤的特征之一,单细胞测序技术是在单个细胞水平上进行全基因组、转录组以及表观遗传学测序,从而为肿瘤异质群体的细胞亚群分类提供依据,进而有效揭示肿瘤细胞内有关遗传、转录和表观遗传水平复杂性改变的过程。本文介绍测序技术的进展、单细胞测序技术方法以及单细胞测序技术在具体肿瘤中的应用进展,并对其发展前景进行了展望。     

儿童极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症诊疗新进展

极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症 （VLCADD）是线粒体脂肪酸β氧化初始阶段酶的缺陷所致脂肪酸代谢障碍疾病。发生在从出生到青春期的任意阶段, 临床表型存在异质性, 其严重程度和时间具有显著特征。常见的确诊方法是血浆酰基肉碱谱和ACADVL基因分子检测,亦可通过酶学检测、脂肪酸氧化流量分析、二代测序（NGS）、体外探针测定、免疫印迹法等辅助诊断。治疗应避免长时间禁食,补充中链三酰甘油 (MCT) 、低长链脂肪酸、高碳水化合物饮食,应用提高残余酶活性药物、补充三羧酸循环中间代谢产物等方式改善代谢异常。因此通过早期积极筛查及诊断,指导临床医生对疾病认识并早期干预治疗,可极大地降低患儿的病死率。     

二代测序在胶质瘤研究与个体化治疗中的应用

脑胶质瘤是一类高度致死性恶性肿瘤,目前有关其在基因组学的研究及临床治疗存在诸多挑战.二代测序技术具有高通量优势,能通过对肿瘤全基因组、外显子组、转录组及表观遗传组全面分析加深对肿瘤基因组学的认识,并已成功应用于部分肿瘤的临床研究中,为肿瘤个体化靶向治疗提供合适可行的指导.当前,运用二代测序研究胶质瘤已成为热点,将全面阐明胶质瘤致病机制,并为制定个体化治疗方案提供策略,使患者获益.     

下一代测序技术在罕见肾脏病中的应用

罕见病是对具有极低患病率疾病的统称,其中150余种可累及肾脏。罕见肾脏病大多具有遗传背景,但由于其病因复杂、临床表型多样等原因,多数患者在未得到明确诊断时就已进展至疾病终末阶段。基因检测是罕见肾脏病诊断的有力工具,而下一代测序(NGS)技术的出现则显著提升了罕见肾脏疾病的诊断效率和质量,为我们了解罕见肾脏病的分子遗传学基础、选择或研发具有针对性的治疗方式等提供了新的方法。本文就NGS在罕见肾脏病中的应用进展、现存挑战及发展前景进行综述。     

全外显子组测序和目标序列靶向捕获测序在遗传性视网膜变性基因诊断中的差异

目的:对比外显子组测序(whole exome sequencing,WES)和目标序列靶向捕获测序检测中国遗传性视网膜变性(inherited retinal dystrophies,IRDs)患者致病基因变异的差异。方法:收集182例IRDs家系,所有先证者均接受系统的眼科检查和必要的全身检查,采集患者及家属血样并提取基因组DNA。按照就诊的时间顺序将患者平均分为两组,一组91例接受WES,另一组91例应用本课题组设计并定制的“遗传性眼病基因诊断芯片” (hereditary eye disease enrichment panel,HEDEP)进行IRDs致病基因外显子区域靶向捕获测序。对候选致病基因用Sanger测序进行验证,并对家系成员进行共分离分析,使用多重连接依赖的探针扩增技术对拷贝数变异进行验证,针对二代测序捕获效率低的区域如RPGR ORF15区,应用Sanger 测序补充检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology,ACMG/AMP)制定的《ACMG/AMP基因变异分类标准与指南》将检测到的所有基因变异进行分类,本文只包含“致病的”、“可能致病的”的基因变异,不包含“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”基因变异。结果:应用HEDEP确诊的家系共51例,阳性率为56.04%(51/91);应用WES确诊的家系共30例,阳性率为33.00%(30/91);总阳性率44.51%(81/182)。平均测序深度以及测序覆盖度方面,HEDEP优于WES,此外HEDEP具有检测拷贝数变异潜力。本研究共检测到29个IRDs基因的致病突变,最常见的致病基因为USH2A、ABCA4和RPGR,基因突变频率分别为11.54%(21/182)、6.59%(12/182)、3.85%(7/182);共发现43个新的致病突变,并检测到6例家系携带RPGR ORF15区的突变。结论:针对临床确诊的IRDs病例,HEDEP较WES能获得更高的基因诊断阳性率和更精确的诊断结果,可作为IRDs基因诊断的首选方法,WES可作为其他基因诊断方法的补充手段。同时,本研究丰富了IRDs致病基因的突变频谱,为将来IRDs基因诊断、遗传咨询和基因治疗奠定了基础。     

全外显子组测序和目标序列靶向捕获测序在遗传性视网膜变性基因诊断中的差异

目的:对比外显子组测序(whole exome sequencing,WES)和目标序列靶向捕获测序检测中国遗传性视网膜变性(inherited retinal dystrophies,IRDs)患者致病基因变异的差异。方法:收集182例IRDs家系,所有先证者均接受系统的眼科检查和必要的全身检查,采集患者及家属血样并提取基因组DNA。按照就诊的时间顺序将患者平均分为两组,一组91例接受WES,另一组91例应用本课题组设计并定制的“遗传性眼病基因诊断芯片” (hereditary eye disease enrichment panel,HEDEP)进行IRDs致病基因外显子区域靶向捕获测序。对候选致病基因用Sanger测序进行验证,并对家系成员进行共分离分析,使用多重连接依赖的探针扩增技术对拷贝数变异进行验证,针对二代测序捕获效率低的区域如RPGR ORF15区,应用Sanger 测序补充检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology,ACMG/AMP)制定的《ACMG/AMP基因变异分类标准与指南》将检测到的所有基因变异进行分类,本文只包含“致病的”、“可能致病的”的基因变异,不包含“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”基因变异。结果:应用HEDEP确诊的家系共51例,阳性率为56.04%(51/91);应用WES确诊的家系共30例,阳性率为33.00%(30/91);总阳性率44.51%(81/182)。平均测序深度以及测序覆盖度方面,HEDEP优于WES,此外HEDEP具有检测拷贝数变异潜力。本研究共检测到29个IRDs基因的致病突变,最常见的致病基因为USH2A、ABCA4和RPGR,基因突变频率分别为11.54%(21/182)、6.59%(12/182)、3.85%(7/182);共发现43个新的致病突变,并检测到6例家系携带RPGR ORF15区的突变。结论:针对临床确诊的IRDs病例,HEDEP较WES能获得更高的基因诊断阳性率和更精确的诊断结果,可作为IRDs基因诊断的首选方法,WES可作为其他基因诊断方法的补充手段。同时,本研究丰富了IRDs致病基因的突变频谱,为将来IRDs基因诊断、遗传咨询和基因治疗奠定了基础。     

基因检测在临床与科研中的应用

近年来,基因检测在临床疾病诊断和科学研究中发挥着越来越重要的作用.特别是新一代测序（next-generation sequencing,NGS）技术的出现使许多疾病的致病基因被发现,大量科研成果不断涌现出来,极大地提高了临床诊断水平和科研水平.本文重点介绍了几种常见的基因测序技术,比较其优缺点和在疾病诊断及科研中的应用,旨在对研究生、临床医生在疾病诊断和科研工作中起到促进作用.     

高通量测序分析miRNAs在胃癌新鲜组织与石蜡包埋组织中的表达

目的 利用二代测序技术对FFPE标本进行高通量测序及相关的生物信息学分析,探讨miRNAs在来源于石蜡包埋胃癌组织(FFPE)中的标本检测的可靠性,探讨其临床意义.方法 选取2015年和2016年2例胃癌患者手术切除同一组织的FFPE和新鲜冰冻标本,从标本中提取RNA并分离构建small RNA文库,采用Illumina测序平台测序的方法对其进行高通量测序,统计各已知miRNAs家族序列的表达量,构建已知miRNAs表达谱,对标本miRNAs进行Spearman相关性分析,评估miR-NAs表达量的差异变化情况.结果 新鲜冰冻标本中提取的总RNA质量较高,RNA保存度完整,显示28S是18S的1.3～1.4倍,从石蜡组中提取的RNA,结果显示有不同程度的降解,28S和18S的波峰不明显,miRNAs表达谱在冰冻和FFPE标本中,Spearman相关系数分别为0.90争0.86,两者miRNAs表达量较一致,具有相关性.结论 FFPE中的miRNAs仍然保持一定的完整性,且可通过二代测序进行肿瘤标本检测.     

Feasibility of genomic profiling with next-generation sequencing using specimens obtained by image-guided percutaneous needle biopsy

Abstract

Aims: The demand for specimen collection for genomic profiling is rapidly increasing in the era of personalized medicine. Percutaneous needle biopsy is recognized as minimally invasive, but the feasibility of comprehensive genomic analysis using next-generation sequencing (NGS) is not yet clear. The purpose of this study was to evaluate the feasibility of genomic analysis using NGS with specimens obtained by image-guided percutaneous needle biopsy with 18-G needles.

Patients and methods: Forty-eight patients who participated in a clinical study of genomic profiling with NGS with the specimen obtained by image-guided needle biopsy were included. All biopsies were performed under local anesthesia, with imaging guidance, using an 18-G cutting needle. A retrospective chart review was performed to determine the rate of successful genomic analysis, technical success rate of biopsy procedure, adverse events, rate of success in pathological diagnosis, and cause of failed genomic analysis.

Results: The success rate of genomic analysis was 79.2% (38/48). The causes of failure were unprocessed for DNA extraction due to insufficient specimen volume (6/10), insufficient DNA volume (2/10), and deteriorated DNA quality (2/10). The rate of successful genomic analysis excluding NGS analysis that failed for reasons unrelated to the biopsy procedures was 95.2% (40/42). Technical success of biopsy was achieved in all patients without severe adverse events. The rate of success in the pathological diagnosis was 97.9% (47/48).

Conclusions: Image-guided needle biopsy specimens using an 18-G cutting needle yielded a successful NGS genomic analysis rate with no severe adverse events and could be an adoptable method for tissue sampling for NGS.     

循环肿瘤DNA液态活检检测微小残留病在实体肿瘤诊疗中的研究进展

基于液态活检的微小残留病（minimal residual disease, MRD）检测在各肿瘤疾病的应用中具有巨大的潜力,随着基因测序技术和生物信息学的发展,二代测序(next-generation sequencing, NGS)作为一种新兴的MRD检测技术,可以对循环肿瘤DNA(circulation tumor DNA, ctDNA)进行定量和定性分析,目前在多种实体瘤中的应用均具有高灵敏度和高特异度。多项研究已证实基于ctDNA的MRD检测结果与患者复发预测、预后判断、疗效评估及个体化分层治疗均有临床相关性,且相较于传统临床手段优势明显。但目前ctDNA MRD的检测技术应用于常规临床实践仍需要大量临床数据的支持,检测方法的统一标准仍未建立。