增强疏水膜半干式蛋白电泳印迹作用的实验

电泳印迹技术是蛋白质化学研究的重要手段之一 ,主要方法有垂直的槽式和水平的半干式两种 ,本实验探讨对疏水膜半干式蛋白电泳印迹的影响因素 ,旨在增强印迹作用。1　材料和方法1.1　试剂　两性载体 ( ampholine p H 3.5～ 10 .0 )购自Pharmacy公司 ;丙烯酰胺 ( Acrylamide)、N,N′-甲叉双丙烯酰胺 ( Bis)及疏水膜 ( PVDF)购自 Bio-Rad公司 ;兔抗鼠 α、β、γ抗血清由美国卫生研究院 ( NIH) Zigler JS博士惠赠 ;其余试剂均购自 Sigma公司。1.2　仪器　等电聚焦采用多用电泳仪 ( Multiphor ,L KB公司 ,瑞典 ) ;SDS-PAGE采用微…     

蛋白免疫印迹法在G蛋白检测中的应用

目的：建立一项用蛋白免疫印迹法测定鸟苷酸结合蛋白（Ｇ蛋白）含量的技术。方法：取冷冻组织块２００ｍｇ置于４℃预冷的匀浆缓冲液中匀浆、离心后，ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移法转移至硝酸纤维素膜上，经５％脱脂奶粉封闭后，依序与抗Ｇ蛋白抗体和辣根过氧化物酶标记的ＩｇＧ反应，化学发光法检测。结果：所得的Ｇ蛋白目标带清晰、明显，重复性好。不同种属大鼠主动脉、心房、心室、脑组织中Ｇｏα和Ｇｉα均为单一带，     

重症肌无力合并胸腺瘤的血清学诊断：蛋白印迹法与酶联免疫法的比较

目的：探讨Wasternblot法对重症肌无力合并胸腺瘤(MGT)患者的血清学诊断价值。方法：分别用蛋白印迹法和酶联免疫法检测33例重症肌无力患者（有瘤16例,无瘤17例）、正常人10例、其他疾病对照18例血清中的人骨骼肌柠檬酸提取物抗体（CAE-Ab）。结果：CAE抗原中3.4万,5.0万,6.0万组分与MGT患者血清结合显色率分别为93.7％（15/16例）,75.0％（12/16例）,75.0％（12/16例）,而其他组无1例结合显色。蛋白印迹法、酶联免疫法对MGT患者检出阳性率分别为16/16,12/16,假阳性率分别为0/17,1/17。结论：蛋白印迹法检测血清中CAE-Ab比酶联免疫法更敏感,特异性高。但蛋白印迹法比酶联免疫法操作复杂,费用较高。     

用双向电泳及蛋白质印迹技术筛选乳腺癌相关抗原

目的：应用双向电泳及免疫印迹技术分析乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,寻找乳腺癌相关抗原。方法：提取乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,双向电泳技术（2-DE）对总蛋白进行分离后转膜,将健康人血清（对照组）和乳腺癌患者血清（实验组）作为一抗进行蛋白质印迹（Western blotting）分析,寻找杂交蛋白点的差异。结果：MCF-7总蛋白双向电泳考马斯亮蓝染色图谱共检测到248个蛋白质斑点,Western blotting显示实验组抗原抗体反应点23个,对照组为13个,找到10个差异蛋白点。结论：乳腺癌患者血清中的抗体表达水平有改变,这10个差异蛋白点有可能是乳腺癌相关抗原。     

重症肌无力合并胸腺瘤的血清学诊断：蛋白印迹法与酶联免？…

目的：探讨Ｗａｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法对重症肌无力合并胸腺瘤（ＭＧＴ）患者的血清学诊断价值。方法：分别用蛋白印迹法和酶联免疫法检测３３例重症肌无力患者（有瘤１６例,无瘤１７例）、正常人１０例,其他疾病对照１８便血清中的人骨骼肌柠檬酸提取物抗体（ＣＡＥ－Ａｂ）、结果：ＣＡＥ抗的中３．４万,５．０万,６．０万组分与ＭＧＴ患者血清结合显色率分别为９３．７％,７５．０％,而其他组无１例结合显色。蛋白印迹法、酶     

DAB2IP基因慢病毒载体构建及其在前列腺癌PC3细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒质粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP并转染前列腺癌PC3细胞，观察其转染效率及其在PC3细胞中的表达。方法：以人前列腺癌PC3细胞基因组cDNA为模板PCR扩增获得目的基因DAB2IP片段后，应用基因重组技术将目的片段克隆到PC3-pSin慢病毒表达载体，经PCR、双酶切和测序鉴定后，重组慢病毒表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞，获得携带DAB2IP基因的重组慢病毒。取病毒上清感染人前列腺癌PC3细胞，以PC3-pSin-EF2为对照，分别采用RT-QPCR、Western blotting法检测DAB2IP在靶细胞中的表达水平。结果：重组慢病毒质粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP经PCR、EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切鉴定结果与目的基因条带吻合，克隆测序结果与NCBI收录的DAB2IP基因序列（NM_138709）完全一致。重组慢病毒质粒转染293FT细胞收获慢病毒上清可高效感染PC3细胞，对照组细胞株PC3-pSin-EF2及过表达细胞株PC3-pSin-EF2-DAB2IP内DAB2IP基因的相对拷贝数分别为0.001±0.000和0.158±0.013，与对照组细胞比较，过表达细胞内DAB2IP基因mRNA表达水平上调(179.37±15.89)倍，差异有统计学意义（P<0.001）；Western blotting法，对照组PC3-pSin-EF2细胞中DAB2IP蛋白表达水平为内参的(1.002±0.783)倍， PC3-pSin-EF2-DAB2IP细胞组为内参的(2.431±0.892)倍，过表达组DAB2IP蛋白表达水平为对照组的(2.415±0.961)倍，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：成功构建携带DAB2IP基因的慢病毒表达载体pSin-EF2-Puro-DAB2IP，并使目的基因在靶细胞中稳定表达，为进一步研究DAB2IP基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体。     

采用Western blotting的方法分析蚕蛹致敏原成份

目的应用Western blotting的方法检测蚕蛹(silkworm chrysalis)浸出液中致敏原的成份,为蚕蛹致敏原的研究和临床诊断提供依据.方法取蚕蛹浸出液,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离,再转印到PVDF膜上,封闭后将血清与膜条共同孵育,后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgE抗体反应,显色底物用对氨基联苯胺.结果SDS-PAGE显示蚕蛹可辨条带有12条,分子量在14～94 kD之间,其中主带有8条,分子量依次为80 kD、68 kD、62kD、50 kD、29 kD、28 kD、18 kD、16 kD.Western blotting结果表明,22例蚕蛹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有6条致敏条带,其中分子量68 kD和29 kD是主要致敏组份,阳性反应率均为100%.结论蚕蛹分子量68 kD和29 kD的组份为主要致敏组份,结果可为开发适合我国特色的蚕蛹变应原提供依据.     

Western blotting中低丰度蛋白转膜方法改进

目的:改进Western blotting转膜方法,提高低丰度蛋白转膜效率.方法:在Western blotting转膜过程中,采用不同孔径的PVDF膜、不同的转膜时间及不同的甲醇含量进行转膜.转膜后,考马斯亮蓝染色观察PAGE胶上蛋白残留情况,ECL发光法检测FGFR1曝光强度.结果:通过改变膜孔径大小和转膜时间所得实验结果可见,孔径为0.22 μm的PVDF膜转移2h的转膜效率更高.通过改变转膜液中甲醇含量所得实验结果可见,甲醇含量为10％转膜效率更高.结论:本实验对Western blotting转膜过程中低丰度蛋白的转膜方法进行了成功改进,改进后能提高蛋白显影强度,具有广泛的应用前景,是一种方便可行的操作方法.     

TWEAK在肝癌细胞系高/低淋巴道转移株中表达的初步分析

[目的]研究肿瘤坏死因子样弱凋亡因子（TWEAK）在小鼠腹水型肝癌细胞系高／低淋巴道转移株（Hca—F／Hca—P）中的表达及差异。[方法]分别提取Hca—F和Hca—P细胞的总RNA，通过RT—PCR在mRNA水平检测TWEAK基因的表达；提取Hca—F和Hca—P细胞的总蛋白，用蛋白印迹法从蛋白表达水平验证差异表达。[结果]RT—PCR检测到两株细胞均在358bo处出现特异性扩增的条带，并且Hca—F的条带亮度低于Hca—P，图像分析显示，Hca—F细胞中TWEAK的转录子含量低于Hca—P细胞（P〈0．05）；蛋白免疫印迹法验证两株细胞表面均有TWEAK蛋白的表达，Hca—P强于Hca—F，与基因芯片的结果一致。[结论]TWEAK在鼠腹水型肝癌细胞系Hca—F和Hca—P均有表达，且Hca—F中较低，而在Hca—P中表达较高。这说明了TWEAK可能与淋巴道转移有关，同时可能参与了细胞的凋亡与组织分化。     

异丙酚分子印迹复合膜的制备

目的:制备异丙酚分子印迹复合膜。方法:在紫外光照和引发剂的作用下,模板分子异丙酚、功能单体甲基丙烯酸(MAA)和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)在聚偏氟乙烯(PVDF)微孔滤膜表面聚合形成分子印迹复合膜,考察模板分子和功能单体的结合特性,用扫描电镜表征膜的表面形态。结果:复合膜形态良好,异丙酚和甲基丙烯酸以氢键的方式缔合。结论:用紫外光照射法可以制得异丙酚分子印迹复合膜。     

蛋白印迹技术的优化

蛋白印迹是细胞和分子生物学研究中重要的一种实验技术。利用蛋白印迹技术可以检测细胞或组织裂解液中的特异性蛋白,特别是微量蛋白的检测,并进行定性及定量的分析。自1979年科学家发明了将蛋白质通过凝胶电泳移植到生物膜后,蛋白印迹技术得到了极大的发展,目前科学界有各种形式的印迹方法。我们就如何优化蛋白印迹提高成功率做一介绍。     

小鼠神经细胞蛋白质的SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳及免疫印记鉴定方法的建立

目的建立一套组合的磷蛋白分析法检测小鼠神经细胞中参与信号转导的蛋白激酶和信号分子。方法培养新生乳小鼠神经细胞,提取蛋白质,并进行SDS-PAGE凝胶电泳,当电泳结束后利用半干式不连续转移缓冲系统将凝腔上的蛋白质转移到PVDF支持膜上,结合免疫印迹和曝光自显影,即得到了小鼠神经细胞中磷蛋白分子（MEK2）的免疫印迹图谱。结果通过上述方法成功地获得了小鼠神经细胞磷蛋白组中磷蛋白分子（MEK2）的免疫印迹图谱。结论利用此组合方法可以检测小鼠神经细胞中参与信号转导的蛋白激酶或信号分子。实验证明本法操作简单,无放射性污染,灵敏度高、特异性强,经济适用,行之有效。     

Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的：获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白（GFP）标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法：应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5和1.0 mmol•L^-1）和不同温度（22℃和37℃）诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。 结果：0.5和1.0 mmol•L^-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温（22℃）诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。 结论：低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。     

电泳印迹和分子杂交技术在肝内HBV DNA研究中的应用

应用DNA电泳转移、生物素探针Southern杂交及不同探针重复杂交等3项新技术研究肝炎肝癌的肝内HBV DNA分子状态。经过方法学比较以电泳印迹取代毛细渗吸法对65例肝炎肝癌病人的101份肝内组织DNA进行尼龙膜快速转移和HBV DNA杂交,结果检出HBV DNA分子状态里整合型15份、游离型31份、整合型合并游离型30份。其中12例乙型肝炎标本为经生物素探针杂交检测,结果全部检出游离型HBV DNA。还有3例乙型肝炎标本和2例其它肝炎标本为经重复杂交检测,即先用~(32)P探针杂交继去探针再用生物素探针杂交,结果乙型肝炎标本两次杂交HBV DNA都阳性,其它肝炎标本两次均阴性。阳性者表现为3.2kb和2.3kb电泳位置呈现杂交带,代表HBV之松弛环状和超螺旋状结构。由于两种探针各含不同序列,故结果可对待检基因进行初步序列分析。本实验表明,上述3项技术对临床医学研究有广泛的应用价值。     

化学发光技术在蛋白质组学研究中的应用

目的:探讨在蛋白质组学研究中应用化学发光技术分析鉴定蛋白质的方法和价值。方法:采用细胞培养、双向电泳及银染等技术建立小鼠神经元蛋白质组图谱,再用PDQuest 2D分析软件和免疫印迹持久性化学发光技术选择性地鉴定三种小鼠神经元蛋白质-PI3Kr3、MEK1、PKCα。结果:三种蛋白质的双向电泳化学发光图谱上均只出现了1个特异蛋白质斑点,信号强,背景低。结论:利用化学发光技术鉴定蛋白质简单、实用、灵敏、高效,可为蛋白质组学的研究提供有力的技术支持。     

酶免疫转移印渍试验(EITB)分析斯氏狸殖吸虫成虫抗原

本文应用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离斯氏狸殖吸虫成虫抗原,并通过转移电泳至硝酸纤维薄膜(NC)上,然后用酶联免疫试验观察成虫抗原蛋白与感染斯氏狸殖吸虫的病人、犬及大鼠血清的反应,检测和识别特异性虫体抗原蛋白。实验结果呈示;虫体抗原经SDS-PAGE分离、染色后可显示20余条蛋白区带;分子量分别为22、24、26KD的抗原蛋白对人体和动物的斯氏狸殖吸虫感染具有诊断价值。     

红外荧光标记蛋白检测方法的优化

目的应用Odyssey双色红外荧光扫描成像系统定量检测蛋白质,通过对免疫印迹中转印膜和封闭液的筛选及抗体双标记的应用,优化红外荧光标记的蛋白检测方法。方法①差速离心法提取大鼠心肌组织膜蛋白,在转膜和封闭过程中比较了4组方案,通过对不同方案蛋白转印效率和背景噪音强度的差异比较,筛选最佳转印膜和封闭液;②运用抗体双标记的方法来研究不同种或不同形式蛋白在同一泳道的检测情况。结果@PVDF膜和脱脂奶粉封闭液结合应用,蛋白显现更清晰;②双重标记间隙连接蛋白43,同时检测到该蛋白两种形式。结论VDF膜、脱脂奶粉封闭液及抗体双标记的使用可以取得更好的红外荧光标记的蛋白检测结果。     

蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较

为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法，采用免疫沉淀法及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。免疫沉淀结果表明，照射后１７５００、２２０００、２８０００、３２０００、４００００、４３０００及５３０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明，照射后２８０００、３２０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中，免疫沉淀法优于Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。