猪苓多糖协同卡介苗对小鼠巨噬细胞TLRs表达的影响

目的：了解猪苓多糖（PPS）及猪苓多糖联合卡介苗（BCG）体内刺激对小鼠腹腔巨噬细胞TLRs表达的影响。方法：应用流式细胞术检测PPS联合BCG体内刺激2、12、24小时后小鼠腹腔巨噬细胞表面CD14、TLR2、TLR4及粘附分子CD11b的表达。结果：PPS组在作用的3个时点内小鼠腹腔巨噬细胞TLR分子表达无明显变化,联合BCG作用2小时后TLR表达高于BCG和PPS单用组;PPS组作用12小时后,CD11b表达高于对照组,24小时后下降,联合BCG作用2小时和12小时,CD11b表达高于BCG和PPS单用组。结论：PPS体内单独刺激不能促进TLR分子的表达,联合BCG可促进TLR分子和粘附分子CD11b的表达。     

猪苓及猪苓多糖协同卡介苗对膀胱癌大鼠模型腹腔巨噬细胞功能的影响

目的:观察猪苓及猪苓多糖(PPS)协同卡介苗(BCG)对BBN诱导的大鼠膀胱癌腹腔巨噬细胞表面分子的表达及体外NO释放的影响。方法:流式细胞术检测BBN诱导膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞的表面分子CD14、TLR4;共刺激分子CD86、CD40的表达。Griess试剂盒检测并分析猪苓及PPS协同BCG对腹腔巨噬细胞体外NO释放的影响。结果:PPS协同BCG组巨噬细胞表面CD86、CD40的表达与模型组比较均显著升高(P<0.05)。猪苓协同BCG组CD86、CD40的表达介于模型组与空白对照组之间,与两者均无显著性差异(P>0.05)。BCG组腹腔巨噬细胞TLR4/CD14的表达显著升高(P<0.05)。PPS协同BCG组TLR4/CD14的表达显著低于单独BCG组。PPS协同BCG组及猪苓协同BCG组与模型组比较NO释放的比值均显著降低(P<0.05)。结论:猪苓及PPS能协同BCG调节膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞表面分子的表达,降低腹腔巨噬细胞NO的释放,从而调节膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞的功能,降低NO过度释放对机体组织的损伤作用。     

重组卡介苗对小鼠巨噬细胞活性及细胞因子产生的影响

目的 将ｒＢＣＧ－ＩＬ－２应用于动脉实验,观察其对肿瘤生长和免疫功能的影响。方法 采用基因工程技术构建ｒＢＣＧ－ＩＬ－２,用黑色素瘤细胞株Ｂ１６接种于小鼠小腿外侧皮下,再用ｒＢＣＧ－ＩＬ－２局部治疗,２ｗｋ处死小鼠,用ＭＴＴＩ地检测腹腔巨噬细胞活必不学无术手淋巴细胞培养上清中ＩＬ－２,ＩＦＮ－ｒ和ＧＭ－ＣＳＦ的含量。结果 ｒＢＣＧ－ＩＬ－２对肿瘤生长的抑制作用与对照组比较有显著性差异Ｐ〈０．０１。     

猪苓多糖联合卡介苗诱导的细胞外热休克蛋白对巨噬细胞功能的影响

目的 研究猪苓多糖联合卡介苗刺激T24膀胱癌细胞株后,细胞外HSP的表达及其对J774A.1巨噬细胞TLR2、TLR4,胞内钙离子(Ca2+)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)表达的影响,探讨膀胱内灌注卡介苗治疗浅表性膀胱癌的免疫启动和免疫调节机制.方法 用ELISA的方法检测猪苓多糖和卡介苗联合刺激T24膀胱癌细胞后胞外HSP90、HSP70、HSP60、HSP27的表达,胞外HSP作用于J774A.1巨噬细胞后,用流式细胞术检测J774A.1巨噬细胞表面TLR4和TLR2的表达,应用激光共聚焦扫描技术,检测J774A.1细胞内Ca2+、NO和ROS的动态变化.结果 猪苓多糖和卡介苗联合作用组胞外HSP的表达明显高于猪苓多糖和BCG单独使用组(P＜0.05),48h时胞外HSP的表达至峰值,且胞外HSP70呈优势表达;胞外HSP可上调J774A.1巨噬细胞TLR4的表达(P＜0.05),对J774A.1细胞内Ca2+、NO和ROS有明显的调节作用(P＜0.05).结论卡介苗体外直接刺激人T24膀胱癌细胞后,可表达细胞外HSP90、HSP70、HSP60、HSP27,猪苓多糖和卡介苗联合使用可增加其表达.细胞外HSP对J774巨噬细胞有一定的免疫调节作用.     

猪苓多糖/卡介苗诱导的热休克蛋白对巨噬细胞表面分子的影响

目的:观察猪苓多糖/卡介苗诱导T24膀胱癌细胞产生的细胞外热休克蛋白对J774A.1巨噬细胞TLR、共刺激分子、粘附分子、活化分子表达的影响,探讨猪苓多糖/卡介苗灌注治疗膀胱癌的天然免疫启动机制.方法:(1)ELISA检测猪苓多糖/卡介苗与T24膀胱癌细胞共培养上清中HSP90、HSP70、HSP60、HSP27的表达.(2)流式细胞术检测含HSP共培养上清(eHSP)对小鼠J774A.1巨噬细胞表面分子CD14、TLR2/4、MHCⅠ/Ⅱ;活化分子CD25;共刺激分子CD80、CD86、CD40;粘附分子CD44、CD62L、CD11b、CD18表达的影响.(3)用流式细胞术检测TLR4/MD2抗体复合物阻断J774A.1巨噬细胞表面TLR4后,eHSP对其表面分子MHCⅠ/Ⅱ、CD25、CD80、CD86、CD40、CD44、CD62L、CD11b、CD18的表达.结果:(1)猪苓多糖/卡介苗诱导T24膀胱癌细胞产生的热休克蛋白呈剂量和时间依赖性,猪苓多糖(2 mg/ml)和卡介苗(250 μg/ml)作用48小时时HSP的表达至峰值,其中HSP70呈优势表达;(2)含HSP的共培养上清可上调J774A.1巨噬细胞TLR4、MHCⅠ、CD86、CD40、CD25分子的表达,增强粘附分子CD44、CD62L荧光强度;(3)含HSP的共培养上清作用于用TLR4/MD2阻断后的巨噬细胞,其表面分子CD86、MHCⅠ、CD40、CD25的表达降低.结论:猪苓多糖/卡介苗可诱导T24膀胱癌细胞产生危险信号热休克蛋白,并且热休克蛋白可通过激活小鼠J774A.1巨噬细胞TLR4信号通路,上调其表面分子的表达,启动抗膀胱癌天然免疫应答.     

猪苓多糖对巨噬细胞一氧化氮生成和细胞内还原型谷胱甘肽的影响

本文观察了猪苓多糖 (PPS )对小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮 (NO )生成和细胞内还原型谷胱甘肽 (GSH )的影响。结果显示 :(1)PPS对小鼠腹腔巨噬细胞NO生成具有明显的促进作用 ;(2 )细胞内GSH浓度随NO生成增加而减少 ;(3)这些作用能被NO生成抑制剂L NMMA所抑制。结果表明PPS能促进小鼠腹腔巨噬细胞NO生成 ,并同时消耗细胞内GSH。提示细胞内GSH可能起到调节巨噬细胞NO生成和保护宿主细胞免受NO介导的细胞毒作用。     

猪苓多糖对重组卡介苗在膀胱癌细胞株T24作用部位的影响

目的：探讨猪苓多糖（PPS）对重组绿色荧光蛋白的卡介苗（rBCG）在人膀胱癌细胞株T24作用部位的影响。方法：将rBCG表达的绿色荧光蛋白作为报告基因，用激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析rBCG以及其与PPS协同rBCG刺激培养的T24细胞的变化。结果：T24细胞与rBCG相互作用24h以后，T24细胞质中发现明显的绿色荧光（86．335±5．856）。流式细胞术检测显示rBCG组24、48h细胞，SS＆FS为参数的散点光信号强于对照组，T24细胞群向右上方偏移；FLl通道检测到GFP＋T24细胞[（8．7±1．572）％、（13．8±2．31）％，P〈0．01]。rBCG联合PPS用药组T24细胞细胞核内绿色荧光（72．603±1．165）增强，细胞质荧光（93．06±0．958）减弱，核／质荧光强度比（0．78±0．005）增大，与rBCG组（62．832±2．909，105．306±6．393，0．597±0．012）相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：rBCG能够直接进入T24细胞细胞质中。     

猪苓及猪苓多糖对膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬细胞吞噬和表面免疫相关分子表达的影响

目的:观察猪苓及猪苓多糖(PPS)对BBN加糖精诱导的膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能、体外NO释放及共刺激分子和表面分子表达的影响。方法:实验分为空白对照组、模型组、PPS组和猪苓高中低剂量共6组。用流式细胞术检测膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞的荧光微球吞噬率、TLR4/CD14、CD86、CD40的表达。Griess试剂盒检测并分析猪苓及PPS对腹腔巨噬细胞体外NO释放的影响。结果:PPS组与模型组比较,PPS显著促进巨噬细胞吞噬率的增加、NO释放的比值均降低、巨噬细胞表面分子TLR4/CD14、CD86、CD40的表达均显著升高(P<0.05)。不同浓度猪苓组与模型组比较巨噬细胞吞噬率增加、NO释放的比值均降低(P<0.05),巨噬细胞表面分子CD86表达增加。低浓度猪苓组巨噬细胞CD40表达百分率显著升高(P<0.05);但TLR4/CD14的表达无明显变化;中、高剂量猪苓组TLR4/CD14的表达百分率与模型组比较则降低(P<0.05),CD40的表达无统计学差异。结论:PPS可显著促进膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能和表面免疫相关分子的表达,但猪苓组对巨噬细胞功能的影响因剂量不同而表现出不同结果,可能与猪苓诸多成分同时作用或各成分作用的靶点不同有关。     

猪苓多糖协同卡介苗对巨噬细胞表达CD11b、CD18以及协同刺激分子的影响

目的：了解猪苓多糖协同对巨噬细胞J774 A.1CD11b、CD18及协同刺激分子表达的影响.方法：应用流式细胞术检测猪苓多糖协同卡介苗刺激J774 A.10.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h及48 h后,其CD11b、CD18及协同刺激分子CD86、CD40表达的变化.结果：BCG（50 mg/L）组作用1 h后,J774 A.1 CD11b、CD18的表达高于空白组;联合应用PPS（50 mg/L）组刺激12 h,其CD11b、CD18的表达明显高于BCG组（P＜0.05）.BCG组0.5 h、3 h、12 h、24 h、48 h,其协同刺激分子的表达增高;联合应用PPS协同刺激J774 A.10.5 h、1 h、3 h、6 h,协同刺激分子的表达高于BCG组.结论：卡介苗能提高巨噬细胞CD11b、CD18及协同刺激分子的表达,联合应用猪苓多糖可使其作用增强.     

猪苓多糖对巨噬细胞RAW264.7的双向免疫调节作用

目的观察猪苓多糖对γ干扰素(IFN-γ)诱导M1亚型巨噬细胞膜表面蛋白的影响及对相关细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-αm RNA的作用,探讨猪苓多糖对巨噬细胞的免疫调节作用。方法实验分为空白对照组、IFN-γ模型组、猪苓多糖组和IFN-γ加猪苓多糖组。IFN-γ诱导巨噬细胞极化为M1型后用猪苓多糖干预,采用流式细胞术检测膜蛋白CD14、TLR4、CD86、CD40、CD16/32的阳性表达率,ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-17及IL-10的表达量,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β及IL-10 m RNA的相对表达量。结果 IFN-γ可单独诱导M1巨噬细胞模型,猪苓多糖作用于M1型巨噬细胞,分泌的因子增加,但是对膜蛋白影响不大;猪苓多糖单独作用于巨噬细胞,可以增加膜白蛋的表达量,分泌的因子和空白对照组比较有统计学差异。结论猪苓多糖可以极化巨噬细胞为M1型,可以增加由IFN-γ诱导的M1炎症因子的表达,同时也增加抑炎因子的表达,有着双向的调节作用。     

高糖腹膜透析液对小鼠腹腔巨噬细胞活力和NO产生的影响

目的探讨商业用腹膜透析液(commercial peritoneal dialysate,CDS)对腹腔巨噬细胞功能的影响.方法培养的小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)在含不同葡萄糖浓度(15、25和42 g/L)的CDS中,经不同时间(10、30和60 min)的暴露,观察MФ还原MTF的能力及其NO的产量.结果低葡萄糖浓度(25 g/L)暴露10 min实验组,MФ还原MTT的能力(A570nm值)为0.210±0.008,NO的产量为(9.1±1.3)μmol/L,均明显低于对照组(P＜0.01);高葡萄糖浓度(42 g/L)和较长时间(60 min)暴露组,MФ还原MTF的能力(A570nm值)为0.056±0.004,NO的产量为(5.7±1.1)μmol/L,与对照组相比较,改变最明显(P＜0.01).结论短时间CDS暴露,即可降低MФ的活力及NO产生,这种作用与CDS中的葡萄糖浓度以及MФ暴露于CDS的时间呈正相关.     

双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生细胞因子以及细胞毒活性的影响

目的探讨青春型双歧杆菌对巨噬细胞Μ功能的调节作用。方法将双歧杆菌注射于裸鼠腹腔 ,用小鼠胸腺细胞增殖法、L929细胞体外杀伤法及Griess试剂 ,分别测定裸鼠腹腔Μ产生的IL 1 ,TNF α及NO的水平 ;同时观察了Μ体外杀瘤活性的变化。结果双歧杆菌注射组裸鼠腹腔Μ产生的IL 1 ,TNF α及NO的水平分别为 :0.55±0.024(A值) ,(165±41)103U/L及(53±6)μmol/L ;对照组分别为 :0.34±0.021(A值) ,(12±6)103 U/L及(31±13)μmol/L。三组数据各自比较均有显著性差异(P<0.01)。同时 ,体外杀瘤活性也明显增强(P<0.01)。结论青春型双歧杆菌能激活Μ ,增强其杀瘤活性 ,并使之分泌大量的细胞毒性效应分子。     

一氧化氮在巨噬细胞的细胞毒效应中的作用

目的:探讨一氧化氮(NO)对巨噬细胞细胞毒效应的影响。方法:将20只昆明种小鼠分为两组,一组皮下接种S180横纹肌肉瘤细胞,另一组作为正常对照组。分别取两组小鼠腹腔灌洗液中的巨噬细胞与K562肿瘤细胞共同培养,检测在培养液中加入左旋精氨酸(L-Arg)和G-单甲基左旋精氨酸(L-NAME)后巨噬细胞杀伤率的改变。结果:正常小鼠腹腔灌洗液中的巨噬细胞在L-Arg和L-NAME存在的情况下细胞毒效应没有改变;荷瘤小鼠腹腔灌洗液中的巨噬细胞在L-Arg组和空白组中的细胞毒效应明显增强。结论:NO是巨噬细胞细胞毒作用的一个效应分子。     

Induction of nitric oxide (NO) synthesis in murine macrophages requires potassium channel activity

The activation of macrophages for antimicrobial responses is a multistage event involving numerous intracellular signalling cascades that makes possible target cell destruction by these effector cells. This study examined the effects of different potassium channel inhibitors and activators on the NO production of murine macrophage-like cell lines P388D.1 and B10-4(S). We found that the potassium channel inhibitors tetraethylammonium, 4-aminopyridine, and quinine caused dose-dependent reductions in the NO production of macrophages, and that the potassium channel activator, minoxidol, caused a dose-dependent enhancement of NO production. The inhibition of NO production was due to involvement of potassium channels in the priming stage of macrophage activation, since pretreatment with the priming agent interferon-gamma partially restored the NO response of the macrophages. The results of this study demonstrate a link between potassium channel activity and the activation of anitimicrobial functions of murine macrophages.     

Alcohol extracts of Echinacea inhibit production of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha by macrophages in vitro

It has been suggested that Echinacea has anti-inflammatory activity in vivo. Nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), and interleukin-1beta are important mediators in the inflammatory response. The effect of alcohol extracts of E. angustifolia (EA), E. pallida (EPA) and E. purpurea (EP) on the production of these inflammatory mediators in both LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages in vitro and murine peritoneal exudate cells (PECs) in vivo were investigated. As macrophages produce these inflammatory mediators in response to pathogenic infection, parallel cultures of macrophages were studied for phagocytosis and intracellular killing of Salmonella enterica. EPA and EP in vitro inhibited NO production and TNF-α release in a dose-dependent manner. RAW 264.7 cells treated with EA or EP showed decreased killing over 24 h, although EA enhanced bacterial phagocytosis. Upon bacterial infection, RAW 264.7 cells produce high levels of NO; however, an Echinacea-mediated decrease in NO production was observed. Echinacea alcohol extracts administered orally at 130 mg/kg per day for seven days had a weak effect on NO production and phagocytosis by LPS-stimulated PECs. The results indicated that all Echinacea species significantly decreased inflammatory mediators in vitro, however, only EA and EP reduced bacterial killing. Oral administration of Echinacea alcohol extracts did not adversely affect the development and anti-bacterial function of inflammatory PECs in vivo, however, NO production was decreased during bacterial infection of PECs.     

巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶的表达调节机制

一氧化氮是一种重要的巨噬细胞免疫效应分子,它参与免疫调节和宿主防御反应.一氧化氮的生成主要由诱导型一氧化氮合酶调节,然而诱导型一氧化氮合酶表达的调节机制及信号通路尚不完全清楚.     

L-精氨酸和一氧化氮抑制剂对大鼠血管钙化的影响

观察给予一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂左旋硝基精氨酸(L-NNA)或底物L-精氨酸(L-Arg)对血管钙化的影响。利用维生素D3和尼古丁制备大鼠血管钙化模型，测定大鼠尾动脉压，血管钙含量、碱性磷酸酶活性及^45Ca沉积；并检测血管组织的L-Arg转运，NOS活性及NO2^-和cGMP含量。发现钙化大鼠血压略升高；动脉钙含量、ALP活性及^45Ca沉积明显增加，von Kossa染色可以看到明显的钙化颗粒；钙化血管组织NOS活性升高；NO和cGMP含量均减少。给予L-NNA或L-Arg后，与单纯钙化组相比，L-NNA干预组的L-Arg转运、NOS活性及NO和cGMP的含量均降低；而L-Arg干预组上述指标的变化正相反。同时，L-NNA干预组的钙化程度比钙化组加重，而L-Arg干预组的钙化程度比钙化组减轻；提示血管钙化时NO—NOS—cGMP途径发生紊乱，干预NO—NOS—cGMP途径可以影响钙化的进程。     

Localization of nitric oxide synthase in human trophoblast cells: role of nitric oxide in trophoblast proliferation and differentiation

PROBLEM: There are conflicting reports about the isoform of nitric oxide synthase (NOS) present in trophoblast cells. In this study, we have examined the presence of different NOS isoforms in trophoblast cells. In addition, the role of nitric oxide (NO) in trophoblast function has also been studied by investigating the possible role of nitric oxide in trophoblast proliferation and differentiation. METHOD OF STUDY: NOS isoforms in primary-term trophoblast and JEG-3 cells were identified by immunocytochemistry. The intracellular localization of this enzyme was determined by confocal laser scanning microscopy. Trophoblast proliferation was studied by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasolium bromide (MTT) conversion assay and cellular differentiation was monitored by human chorionic gonodotropin (hCG) and progesterone secretion, measured by radioimmunoassay. RESULTS: The immunoreactive NOS was present in human trophoblast cells of normal term placenta and JEG-3 cells (a choriocarcinoma cell line) maintained in culture. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)-dependent diaphorase activity overlapped with the immunostaining of NOS. Specific antibodies against the different isoforms of NOS detected the presence of neuronal-type NOS (nNOS) only. The other two isoforms, i.e., eNOS (endothelial) and iNOS (macrophage specific) were completely absent. The nNOS was localized in cell cytoplasm. In culture, JEG-3 cells normally undergo proliferation and cytotrophoblast cells in primary culture differentiate to form hormone-secreting syncytial cells. Sodium nitroprusside (SNP), a nitric oxide donor, when added to the culture, significantly increased proliferation of JEG-3 cells and inhibited the differentiation of cytotrophoblast cells. The arrest by SNP in the formation of syncytial cells was further evidenced by the low secretion profile of hCG and progesterone. CONCLUSIONS: Our findings suggest for the first time the presence of nNOS in the human trophoblast cells and a previously unrecognized role of NO in trophoblast proliferation and differentiation.