人端粒重复序列结合因子基因组和假基因研究

目的：确定人端粒重复序列结合因子(TERF1)的基因组结构和假基因的定位与结构。方法：利用GenBank等生物信息学资源，NCBI提供的BLAST及其他相关的生物信息学工具(Sequencher，DNA Strider和Autoassembler等)，确定TERF1基因组和假基因的定位与结构，并用PCR和测序证实。结果：定位在8q13上的7TERF1基因组由10个外显子构成。它有4个假基因分别分布在第13、18、21和X染色体上(ΨTERF1-X、ΨTERF1-18、ΨTERF1-21和ΨTERF1-X)，其结构均与TERF1 mRNA相似，但缺少部分外显子。ΨTERF1-13、ΨTERF1-18和ΨTERF1-21的周边序列之间存在长度至少60kb的同源片段。结论：TERF1基因组合10个外显子，它有4个加工过的假基因分布在第13、18、21和X染色体上。大片段同源序列属近期重复片段中的染色体间倍增。     

抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段（TRF1^33-277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF1^33-277，将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白哆，制备血清过柱纯化，将TRF1^33-277和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱，血清过GST柱以去除抗GST抗体，然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体，获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗。在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带，与阳对照基本一致。结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效。所获抗TRF1^33-277多克隆抗体为国内首次报道。     

端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达

目的检测端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌组织中的表达。方法收集我院33例明确诊断为食管癌患者的中心组织及其相应癌旁组织,然后提取总RNA并逆转录成cDNA,适时荧光定量PCR方法检测TRF1、TRF2和POT1基因在这些组织中的表达水平。结果 TRF1mRNA在食管癌中心和癌旁表达所得CT值分别为（1.42±2.31）和（1.02±1.04）,差异有统计学意义（P〈0.05,n=33）;TRF2为（8.53±2.57）和（8.38±1.50）,两者差异无统计学意义（P〉0.05,n=33）;POT1为（4.72±1.47）和（3.80±1.06）,两者差异有统计学意义（P=0.001,n=33）。结论虽然TRF2基因在食管癌中表达没有统计学差异,但TRF1和POT1基因在食管癌组织中表达显著降低,提示TRF1和POT1有可能与食管癌的发生、发展有着密切的关系。     

端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达

目的检测端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌组织中的表达。方法收集我院33例明确诊断为食管癌患者的中心组织及其相应癌旁组织,然后提取总RNA并逆转录成cDNA,适时荧光定量PCR方法检测TRF1、TRF2和POT1基因在这些组织中的表达水平。结果 TRF1mRNA在食管癌中心和癌旁表达所得CT值分别为(1.42±2.31)和(1.02±1.04),差异有统计学意义(P<0.05,n=33);TRF2为(8.53±2.57)和(8.38±1.50),两者差异无统计学意义(P>0.05,n=33);POT1为(4.72±1.47)和(3.80±1.06),两者差异有统计学意义(P=0.001,n=33)。结论虽然TRF2基因在食管癌中表达没有统计学差异,但TRF1和POT1基因在食管癌组织中表达显著降低,提示TRF1和POT1有可能与食管癌的发生、发展有着密切的关系。     

端粒重复序列结合因子在肾脏肿瘤中的表达水平

目的:研究TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤及相应癌旁组织中的表达水平.方法:定量分析肾组织中TRF1蛋白的表达水平,应用经倍比稀释的TRF133-277纯化蛋白作为定量标准,建立了以抗TRF133-277单抗作定量Wes-tern-blot的方法,并以该方法检测TRF1蛋白在组织中的表达水平.结果:32例肾肿瘤样本均不同程度的表达TRF1蛋白质,均值为2.428±1.352 μg/μl,癌旁自身对照组织TRF1的表达水平为3.611±1.922 μg/μl(t=5.776,P<0.001).肿瘤组织内TRF133-277表达水平较相应癌旁组织显著降低,并与肿瘤的恶性程度相关,差异具有显著性意义(P<0.01).结论:TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤中的表达明显减低,并与肿瘤恶性程度呈负相关.     

人端粒重复序列结合因子在急性白血病细胞中的表达及与端粒酶活性的关系

目的:研究人端粒重复序列结合因子(TRF1)在30例急性白血病细胞中的表达,了解TRF1表达与急性白血病分型的关系,以及与端粒酶活性的关系.方法:用荧光定量RT-PCR定量检测30例急性白血病细胞中TRF1 mRNA表达情况,同时检测hTERT mRNA的表达,并分析两者之间的相关性.结果:TRF1在急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)细胞中的表达0.0126(0.0127～0.0546)明显低于正常人骨髓单个核细胞中的表达0.0457(0.00839～0.262)(P<0.001),但在急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞中的表达0.0745(1.92×10-6～0.193)与正常人骨髓单个核细胞比较差异无显著性,且在ANLL细胞中的表达明显低于ALL细胞中的表达(P=0.001).TRF1和hTERT在急性白血病细胞和正常人骨髓单个核细胞中的表达无显著相关性(r=-0.173,P=0.207).结论:TRF1 mRNA在ANLL细胞中表达明显降低,而在ALL细胞中表达无显著改变,提示ANLL细胞中TRF1可能通过调控端粒长度对端粒酶起间接负调控作用.     

端粒重复序列结合因子1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的探讨人端粒重复序列结合因子1（TRF1）在非小细胞肺癌（NSCLC）肺组织中的表达及其与临床、病理的关系。方法采用Envision免疫组织化学染色法检测40例NSCLC患者手术切除后石蜡包埋标本和37例癌旁正常肺组织中TRF1的表达水平,并分析其与NSCLC患者临床、病理指标及生存期的关系。结果NSCLC组织中TRF1蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常组织（P〈0.01）;TRF1蛋白在NSCLC组织中的阳性表达水平与患者性别、年龄、是否长期吸烟、肿瘤大小、淋巴结是否转移、病理TNM分期、分化程度、组织学类型和总生存期等方面的差异均无统计学意义（均P〉0.05）。结论TRF1在NSCLC组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织,但其表达水平则与NSCLC的组织学类型、性别、年龄、是否长期吸烟、肿瘤大小、淋巴结是否转移、病理TNM分期、分化程度及预后无关。     

辛伐他汀对颅内动脉瘤大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶及端粒重复序列结合因子2基因表达的影响

目的 探讨辛伐他汀对颅内动脉瘤(IA)大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶(TERT)和端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因表达的影响.方法 将36只SD大鼠分为对照组、模型组和辛伐他汀组,每组12只.对模型组及辛伐他丁组的大鼠切除双侧卵巢并结扎左侧颈总动脉及双侧肾动脉后支以构建IA模型,对照组仅暴露相应组织及血管后缝合.建模后模型组和辛伐他汀组分别给予生理盐水及辛伐他汀灌胃.于建模后4个月,测定各组大鼠外周血白细胞端粒相对长度、TERT和TRF2 mRNA的相对表达量.结果 建模后4个月,模型组和辛伐他汀组各有8只大鼠形成IA,对照组无大鼠形成IA;对照组、辛伐他汀组和模型组大鼠的端粒相对长度依次缩短(P<0.05),而对照组、模型组和辛伐他汀组TRF2 mRNA相对表达量依次升高(P<0.05);模型组和辛伐他汀组的TERT mRNA相对表达量低于对照组(P<0.05),但两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 IA大鼠可能由于端粒酶活性降低而发生端粒长度缩短,辛伐他汀可通过促进TRF2的表达而发挥保护端粒作用.     

端粒重复序列结合因子2真核表达载体的构建及表达

目的:构建端粒重复序列结合因子2(TRF2)真核表达载体,观察其在胃癌细胞中的表达.方法:EcoRI,HindⅢ双酶切AdTRF2质粒,胶回收1 600 bp小片段,连接入pcDNA3.1载体.经双酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞,空载体质粒转染SGC7901细胞为对照.G418选择培养液培养2个月,选取转染组及对照组细胞克隆.①细胞用阿霉素处理6 h后Western blot法检测TRF2表达.②MTT法检测转染对细胞生长增殖速度的影响.结果:成功构建TRF2真核表达载体,转染后SGC7901细胞TRF2表达明显增高,对细胞的生长增殖速度无明显影响(P＞0.05).结论:成功构建TRF2真核表达载体及稳定转染细胞株,为进一步研究TRF2功能奠定了基础.     

端粒结合蛋白研究进展

端粒结合蛋白研究是近年来发展比较快的一个新的研究领域.自Chong在1995年发现人端粒重复序列结合因子TRF1后,近几年已发现了包括TRF2、TANK1、TANK2、TIN2、Pinx1、POT1等在内的10余种端粒结合蛋白.这些蛋白与端粒一起形成三维环状结构t-loop,其中端粒结合蛋白、端粒、端粒酶及其它参与细胞功能调控的重要蛋白相互作用,共同完成对DNA损伤修复、细胞周期、有丝分裂、细胞调亡等细胞基本生命活动的调节,与衰老和肿瘤有着密切的联系.展开和深入对该领域的研究,对了解衰老和肿瘤的根本机制,进一步寻求诊断和治疗的途径具有十分重要的意义.为此,就端粒结合蛋白在近几年的研究进展作一概述.     

端粒及端粒长度研究新进展

端粒位于真核细胞染色体末端，它由DNA重复序列和特定的端粒结合蛋白相结合而形成的核染色质组成。端粒DNA是由一小段富含G的简单重复序列，人的端粒DNA序列是由一段高度保守的重复序列d（TTAGGG）n构成的特化区。端粒结合蛋白，主要成分是“端粒重复结合因子”（TRF）。端粒排列成高级的“T-环”结构，像“帽子”一样扣在染色体两端，防止染色体融合、重组、降解，维持其完整性和稳定性。端粒的这种保护功能在基因完整性和细胞生理学其他方面的调节起至关重要的作用。     

端粒重复结合蛋白1与磷酸化激酶Aurora B相互作用研究

目的鉴定端粒重复结合蛋白1(TRF1)的磷酸化位点及其与磷酸化激酶Aurora B在体内外的相互作用。方法用myc-His-TRF1真核表达质粒转染人宫颈癌细胞HeLa,免疫沉淀后行质谱分析。采用免疫沉淀及体外沉降实验研究TRF1与Aurora B的相互作用。结果免疫沉淀实验结合质谱分析鉴定出5个新的TRF1磷酸化位点;运用体外沉降实验和体内免疫共沉淀实验证实Aurora B能够与TRF1在体内外相互结合。结论 Aurora B可能是一个新的TRF1结合蛋白,TRF1与Aurora B能够在体内外相互结合。     

放射线对Tca8113细胞端粒重复序列结合因子2蛋白的影响

目的:研究X线对Tca8113细胞端粒重复序列结合因子2蛋白的影响。方法:采用Western Blot检测X线照射前后端粒重复序列结合因子2蛋白的含量变化,采用AnnexinⅤ-FITC/PI联合染色检测细胞早期凋亡。结果:与照射前相比,细胞早期凋亡率显著升高(P<0.05);经不同剂量X线照射后0.5 h,各组端粒重复序列结合因子2蛋白含量均上升(P<0.05),1 h后,2 Gy组的TRF2蛋白含量降至与未照射时水平相当,3 h和5 h时降至比未照射时更低(P<0.05),其它照射剂量组的TRF2蛋白在照射后1 h时均已降至不可测得的水平。结论:端粒重复序列结合因子2被激活,端粒重复序列结合因子2蛋白含量应激性地短暂升高是经X线照射后的早期事件。     

端粒重复序列扩增法结合微孔板杂交法定量检测端粒酶活性

目的探讨定量检测端粒酶活性的非放射性检测方法。方法将端粒重复序列扩增测定法（ＴＲＡＰ）与微孔板杂交 相结合建立了非放射性检测方法,对３例正常肝组织和４例肝癌患者治疗前后的肝癌组织、瘤旁组织、肝癌凋亡组织 进行检测。结果肝癌组织具有比较高的端粒酶活性,而正常肝组织和瘤旁组织无此酶活性,肝癌凋亡组织端粒酶活性 显著降低。结论　该定量分析方法简单、灵敏、特异性强,可以比较准确地反映组织的端粒酶活性状态。     

端粒重复序列扩增法结合微孔板杂交法定量检测端粒酶活性

目的 探讨定量检测端粒酶活性的非放射性检测方法。方法 将端粒重复旬扩增测定法（TRAP）与微孔板杂交相结合建立了非放射性检测方法。对3例正常肝组织和4例肝癌患者治疗前后的肝癌组织、瘤旁组织、肝癌凋亡组织进行检测。结果 肝癌组织具有比较高的端粒酶活性,而正常肝组织和瘤旁组织无此酶活性,肝癌凋亡组织端粒酶活性显著降低。结论 该定量分析方法简单、灵敏、特异性强,可以比较准确地反映组织的端粒酶活性状态。     

端粒结合因子－1在脑膜瘤中的表达及临床意义

目的探讨端粒结合因子－1（TRF1）在脑膜瘤及正常脑组织中的表达及其临床意义。方法选取26例脑膜瘤（其中良性脑膜瘤18例,恶性脑膜瘤8例）和10例正常脑组织（脑外伤患者内减压切除的脑组织）石蜡切片标本作为研究对象,应用免疫组化技术检测各组TRF1的表达水平,应用半定量法计算不同标本肿瘤细胞免疫标记的频率和强度积分。结果所有肿瘤组织及正常脑组织中均检测到TRF1表达,其中正常脑组织中TRF1表达高积分构成比为90．00％,良性脑膜瘤的TRF1高积分构成比为66．67％,恶性（间变性）脑膜瘤组为12．50％。经统计分析发现,TRF1在脑膜瘤中的表达与其恶性程度成负相关（L=－0．586,P=0．002）。结论TRF1在人脑膜瘤组织及正常脑组织中均有广泛表达,其在脑膜瘤中的表达水平与其恶性程度呈负相关,TRF1可作为脑膜瘤病理分级及恶性程度判断的参考指标。     

P53与端粒重复序列结合蛋白质1的体外相互作用

目的:通过分析端粒主要结合蛋白中端粒重复序列结合蛋白质1(Telomeric repeat binding protein 1,TRBP1)与P53的体外结合,探讨P53通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制.方法:谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)和人P53-GST融合蛋白经大肠杆菌表达、谷胱甘肽-SepharoseTM4B纯化后,和人乳腺癌细胞MCF-7细胞蛋白进行体外结合反应(pull down),Western blot检测反应物中P53和TRBP1的结合.融合蛋白中人P53包括野生型(1～393)、C端缺失体P53 N5(2～293)、N端缺失体P53 2C(95～393)、175单个氨基酸突变体P53 R175H(R→H).结果:聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝R250染色显示,纯化的GST和4种P53-GST蛋白纯度在90%以上,且分子量与预计的完全一致.TRBP1的Western blot显示,野生型P53和P53-R175H均能沉淀MCF-7中的TRBP1,且结合力相似,而单独的GST则无沉淀TRBP1的作用.与野生型P53和P53 R175H相比,P53 2C与TRBP1的结合力明显增加,P53 N5与TRBP1的结合力明显减弱.结论:P53和TRBP1可以直接体外结合,P53的C端(293～393)是与TRBP1结合的结构域.P53和TRBP1结构域依赖性的结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关.     

人端粒保护蛋白（hPOT1）的研究进展

2001年，Baumann等发现并鉴定出人端粒保护蛋白（human protection of telomeres，hPOT1），它是至今发现的唯一能与人类端粒单链DNA结合的蛋白质。hPOT1最重要的功能是对端粒有直接而重要的保护作用。hPOT1能直接与端粒DNA富G单链结合，似“帽子”戴在染色体两端，防止端粒DNA序列丢失、降解、重组，人们形象地称hPOT1为“端粒保镖”。