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1.
目的:为获得高表达有活性的p16蛋白,构建含p16cDNA的重组转移载体。方法:EcoRIxhoI双酶切克隆质粒pBLUESCRIPT-p16,低融点琼脂糖回收0.8kb的P16CDNA片段,插入质粒pSXIVVI^+X3,构建含P16的重组载体PX3-P16,并对重组子以菌落原位杂交和酶切电泳两种方法进行鉴定。结果:电泳证实低融点琼脂糖回收的片段为0.8kb。菌落原位杂交筛选8个阳性克隆,酶切电 相似文献
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癌胚抗原cDNA真核表达重组质粒的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:将人特异表达的癌胚抗原(CEA)-cDNA克隆到逆转录病毒质粒载体pLXSN中,构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA,为进一步表达表达人CEA的动物肿瘤细胞模型作准备。方法:用内切酶EcoRI酶切质粒pLXSN及p91023B-CEA-17,得到线状载体pLXSN及外源基因CEA-cDNA,然后通过连接酶的连接反应将CEA-cDNA插入到pLXSN的EcoRI位点,用EcoRI和BamHI鉴定。结果:成功地将CEA-cDNA克隆到pLXSN中,通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒pLXSN-CEA。结论:利用基因克隆技术能将人CEA-cDNA定向插入逆转录病毒质粒载体中,构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA,为进一步建立CEA阳性动物肿瘤细胞模型及研究CEA阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。 相似文献
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运用DNA重组技术,将用RT-PCR方法克隆的大鼠肾皮质受体相关蛋白319个氨基酸的核苷酸序列导入载体pBluescript和表达载体pGEX中,分别构建了重组质粒pBSK9RAP和pGEX-9RH7,转化入大肠杆菌XL1-Blue和DH5α中,经IPTG,x=gal抗生素筛选阳性克隆,扩增后,重组质粒用限制性内切酶图谱分析及DNA测序分析,证明插入了方向正确,表达阅读框架正确。 相似文献
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pCDM8-GFP报告载体的构建及鉴定 总被引:3,自引:0,他引:3
1 实验资料 pDM 8 PBLcDNA文库由Jackson博士惠赠 ,pEGFP N3真核表达载体购自Clontech公司 .NotI、HindⅢ和T4DNA连接酶购自大连宝生物公司 .COS7细胞为本室冻存。pCDM8 GFP载体的构建方法参照文献 .提取 pCDM8 X(X表示载体中插入的未知cDNA片段 )和 pEGFP N3质粒 ,分别用NotI和HindⅢ进行双酶切 ,回收酶切片段 ,用T4连接酶进行连接 ,转化感受态宿主菌。挑单菌落培养 ,提取质粒用NotI和HindⅢ双酶切进行阳性克隆鉴定 .提取重组pCDM8 GFP载… 相似文献
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饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达 总被引:5,自引:0,他引:5
目的 通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法 应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段。并克隆到pUC19载体中,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX-4T-1表达载体中,经BamHI和EcoRI双酶切后1.2%凝胶电泳鉴定,IPTG诱导表达产物经SDS-PAGE分析。结果 克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF138300记载的序列完全一致,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65.6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论 本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST-Decorin融合蛋白。 相似文献
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目的 克隆H-2K^bcDNA及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 RT-PCR法扩增H-2K^bcDNA,克隆入双顺反子逆转录病毒载体pGCEN,PA317包装出重组病毒后,分别感染NIH3T3、COS7及MM45T.Li,PCR和RT-PCR分析目的基因表达,FACS分析H-2K^b在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体pGCEN介导,分别建立了H-2K^b基因转导细胞:NIH3T 相似文献
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卵巢癌的p53基因治疗实验研究:人野生型p53基因真核细?… 总被引:1,自引:0,他引:1
本实验构建了人野生型P53基因与真核表达载体pcDNA3的重组体,为进行卵巢癌基因治疗研究打下基础,方法:利用分子生物学基固然我隆技术从质粒pGEX^-p53中用双酶切下目的片段,挤压法回收与pcDNA3构成重组体。结果成功的构建了人野生型P53基因真核细胞表达质粒。 相似文献
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人乳头瘤病毒16型完整E6开放读码框的基因克隆和鉴定 总被引:5,自引:2,他引:3
利用聚合酶链反应(PCR)技术从人乳头瘤病毒16型(HPV16)基因组中扩增得到555bp的E6DNA片段,并重组到载体pGEMEX^TM-1中,构建克隆扩增质粒p16E6-G,将此重组质粒转化大肠杆菌JM109,经菌落原位杂交鉴定和限制性酶切图谱分析,证实该产物为E6基因完整开放读码框(ORF),从而为获得E6ORF基因片段提供了一个高效、方便的新方法。 相似文献
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建立人多肿瘤抑制基因第二外显子cDNA的表达克隆。方法 用反转录-PCR取得MTS1第二外显cDNA,并将春直接联接入质粒pGEM-T中,构建为重组质粒pGEM-p16。结果 重组质粒的酶谱分析表明其酶切位点与原设计相符,插入cDNA-PCR片段大小为307bp,与引物区间大小一致。 相似文献
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应用多聚酶链反应(PCR),直接从SIV感染的猴艾滋病(SAIDS)模型猴的外周血淋巴细胞总DNA中扩增出767bp的SIV核心蛋白P27基因片段。扩增产物经EcoRI及SalI双酶切后,克隆入相同酶切的表达质粒pBV220中,获得含SIV核心蛋白基因片段的重组质粒pBVSG,并进行DNA序列分析。用该重组质粒转化大肠杆菌DH5a经筛选、增殖及42℃温度诱导,SDS-PAGE表明外源基因表达蛋白含量占菌体总蛋白14.5%,Western-blot证实表达产物能被SIVP27单克隆抗体及SAIDS模型猴血清中特异性抗体识别。 相似文献
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为获取具有生物学活性的p16蛋白,采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒pBluescript-p16得到的p16cDNA片段连接到双酶切的原核表达载体pBV220上,转化大肠杆菌TG1得到含重组表达质粒pBV220-p16的工程菌,温度诱导表达后,经SDS—PAGE和Western-blot检测证实含有p16蛋白。结果表明,p16原核表达载体构建成功并表达出p16非融合蛋白。 相似文献
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目的:使重组人促红细胞生成素(rhEPO)在CHO细胞中获得高效表达。方法:利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素cDNA重组表达质粒pED-EPO和pEF-EPO,分别用DEAE-dextran法转染COS7细胞,作瞬时高表达,选pEF-EPO用磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr-细胞,加入氨甲喋呤(MTX)扩增、选择,作稳定性高表达。结果:pED-EPO和pEF-EPO转染COS7细胞后72h表达量分别为17.8和21.0ng/ml,pEF-EPO转染CHO-dhfr-细胞,随着MTX浓度的增加,CHO-dhfr+的克隆数减少,而混合克隆的EPO表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达rhEPO的细胞株,其3d表达量为16μg/ml。结论:rhEPO在CHO细胞中获得了高表达 相似文献
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目的 鉴定新疆皮肤利什曼病病原体,方法 用利什曼原虫属特异引物R222和R333,从皮肤利什曼病患者皮肤病变组织,婴儿利什曼原虫和热带利什曼原虫基因组DNA中扩增出一特异SSUrDNA多变区片段,将其克隆到pGEM-TEasyVector上,并筛选和鉴定出重组质粒。结果 以EcoRI酶切,PCR扩增和Southern杂交证实获得的重组质粒包含SSUrDNA多变区片段。结论 皮肤利什曼病病原体,婴儿 相似文献
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目的:构建携带绿色荧光蛋白基因(gfp) 的真核表达载体pcTKGFP,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建提供基因材料。方法:采用PCR技术从商品质粒pEGPC1 中扩增出gfp(799 bp),PCR产物用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切后定向克隆至真核表达载体pcTK,重组质粒pcTKGFP用限制性内切酶和DNA序列分析进行鉴定。结果:部分DNA 序列分析证明PCR产物为gfp,成功筛选到携带gfp 的真核表达载体pcTKGFP。结论:pcTKGFP真核表达载体的构建,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建奠定了基础。 相似文献
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克隆人肝脏再生增强因子(hALR)cDRNA,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法:提取胎儿肝组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增出hALRcDNA,克隆于载体pGEM-T,酶切鉴定后亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,测序证实序列正确并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白GST-hALR,表达物通过谷胱甘肽Sepharose4B亲和层析纯化后进行Thrombin酶切, 相似文献
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免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库基因的亚克隆与鉴定 总被引:7,自引:0,他引:7
目的 亚克隆免疫筛选日本血吸虫cDNA文库得到的基因。方法 在体外将血吸虫cDNA文库基因的PCR产物和pGEM-T载体连接,转染大肠杆菌XL1-Blue,经抗生素及呈色底物X-gal粗筛,再用限制性内切酶及PCR方法进一步鉴定。结果 成功地将文库中4个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中,获得4个重组子。结论 为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。 相似文献
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目的:通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)cDNA在大肠杆菌DH5a中的表达,为bFGF进一步研究提供材料来源,方法:用多聚酶链反应(PCR)及DNA重组技术将PCR产物克隆到pGEM-5Z载体并测序,然后克隆到表达载体pXH上。结果:转化重组质粒pLX1的大肠杆菌经42℃温控诱导4 ̄5h,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约35000,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体 相似文献
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目的:用大肠杆菌融合蛋白表达载体pGEX-2T构建人单核细胞趋化蛋白-1融合表达质粒PGT-MCP-1,方法:采用PCR技术和DNA重组技术,结果:将编码人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因克隆至融合表达载体PGEX-2T ,DNA测序证实正确。结论:获得融合表达的质粒PGT-MCP-1,为进一步研究MCP-1的同效表达奠定了基础。 相似文献