犀角地黄汤合银翘散通过PKC-SSeCKS通路抑制TNF-α诱导的肺微血管内皮细胞通透性增加

目的:观察犀角地黄汤合银翘散(XDY)对TNF-α诱导的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)通透性的影响及其与PKC-SSeCKS信号通路的关系,以探究该方治疗病毒性肺炎的作用环节和分子机制。方法:原代培养大鼠PMVEC,在Transwell小室上用电导法于不同时点监测TNF-α诱导的PMVEC跨内皮细胞单层电阻(TER)测定其通透性。不同的干预因素作用24 h后,检测PMVEC的TER、PKC活性、SSeCKS mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平,激光共聚焦显微镜观察PMVEC中SSeCKS的定位和F-actin的结构变化。结果:TNF-α作用24 h后PMVEC通透性达高峰;与对照组比较,TNF-α组TER降低,PKC活性增强;与TNF-α组比较,TNF-α加PKC抑制剂组和TNF-α加XDY含药血清组PKC活性降低,而TER升高且与对照组无差别。与对照组比较,TNF-α组SSeCKS的mRNA和蛋白表达升高;与TNF-α组比较,TNF-α加XDY含药血清组SSeCKS的mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平降低。对照组PMVEC中F-actin主要分布在细胞周边和核周,形成致密周围束,SSeCKS均匀散在分布于细胞中;TNF-α组细胞周边的F-actin致密束基本消失,SSeCKS集中分布于核周;TNF-α加含XDY含药血清组F-actin结构及SSeCKS的分布趋于正常。结论:犀角地黄汤合银翘散可以抑制TNF-α诱导的PMVEC PKC信号通路的激活,降低PKC结合底物SSeCKS的表达,最终影响肌动蛋白的变构、阻止内皮细胞变形而降低PMVEC的通透性。     

犀角地黄汤合银翘散通过促进流感病毒感染的小鼠巨噬细胞自噬而降低线粒体ROS水平

目的:探究犀角地黄汤合银翘散(XDY)对自噬调节的流感病毒感染小鼠巨噬细胞线粒体活性氧(mtROS)水平的影响.方法:以流感病毒PR8感染小鼠巨噬细胞J774A.1为模型,进行下列实验:(1)分为正常组、模型组(PR8感染24 h)、XDY干预组(PR8感染及162.5 mg/L XDY干预24 h)、3-甲基腺嘌呤(...     

OX-LDL诱导内皮细胞条件培养液对内皮细胞VCAM-1和 ICAM-1的影响

目的探讨受损内皮细胞的自分泌和旁分泌对内皮细胞自身的影响。方法利用正常内皮细胞条件培养液和用氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导内皮细胞的条件培养液分别作用于正常内皮细胞和受损内皮细胞,用酶联免疫细胞化学法检测血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的变化。结果正常内皮细胞的条件培养液和OX-LDL诱导的内皮细胞条件培养液对正常内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的表达作用不明显(P>0.05),而对受损内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的表达具有明显的下调作用(P<0.01)。结论正常和受到氧化损伤的内皮细胞的自分泌和旁分泌作用对正常内皮细胞黏附分子没有影响,而对受损内皮细胞黏附分子有下调作用,说明内皮细胞可通过下调黏附分子的表达来实现自身的抗损伤作用。     

氯沙坦对实验兔颈动脉粥样硬化和血清ICAM-1、VCAM-1的影响

目的:观察氯沙坦对动脉粥样硬化程度和黏附分子的影响.方法:将24只雌雄各半新西兰白兔随机均分为对照组、高脂组、治疗组.对照组喂普通饲料,高脂组喂以高脂饲料,治疗组为高脂饲料加用氯沙坦25mg/(kg·d).分别于实验开始前、开始后第4、8、12周清晨空腹取各组实验动物耳中央静脉血0.5ml,分别测定并比较各组空腹状态下...     

红花黄素对大鼠肺动脉内皮细胞P-选择素及ICAM-1表达的影响

目的观察红花黄素在缺氧复氧条件下对大鼠肺动脉内皮细胞P-选择素(Ps)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)基因表达的影响。方法采用细胞培养、RT-PCR、W estern b lot、免疫细胞化学染色法等技术,观察在常氧、缺氧、复氧及红花黄素干预等不同条件下大鼠肺动脉内皮细胞Ps、ICAM-1 mRNA及蛋白表达的变化。结果常氧组细胞1、6、12 h各个时间点,Ps、ICAM-1 mRNA及蛋白表达水平没有明显变化,缺氧组的各个时间点Ps、ICAM-1表达水平与同时间点常氧组相比无统计学差异(P分别>0.05)。缺氧1 h后再给氧1、6、12 h,Ps、ICAM-1 mRNA及蛋白的表达均明显高于相同时间点常氧组与缺氧组(P分别<0.05);缺氧1 h后再给氧同时给予红花黄素干预组Ps、ICAM-1 mRNA及蛋白的表达均明显低于相同时间点单纯缺氧复氧组(P分别<0.05)。结论单纯缺氧状态下大鼠肺动脉血管内皮细胞Ps、ICAM-1表达无明显变化,缺氧复氧条件下Ps、ICAM-1表达上调,红花黄素可抑制缺氧复氧条件下Ps、ICAM-1的过度表达。     

登革病毒感染对血管内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的探讨登革病毒2型（DV2）体外感染对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表达细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）的影响。方法原代分离培养HUVEC，用生长良好的2、3代细胞进行实验。用CCK-8法测定DV2感染前后的细胞活性。流式细胞仪测定DV2感染组和对照组细胞在不同实验时间点细胞表面ICAM-1蛋白表达的情况。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和图像定量分析技术分析DV2感染组和对照组在不同实验时间点HUVEC内ICAM-1 mRNA水平。结果病毒感染HUVEC对细胞活力的影响与对照组相比差异无统计学意义。DV2感染HUVEC促进ICAM-1 mRNA转录，DV2组与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。其中，正常状态下HUVEC有一定水平ICAM-1 mRNA转录，但感染后显著增加（P〈0．05），24—72h维持于高水平，与其他时间表达差异有统计学意义（P〈0．05）。DV2感染HUVEC，细胞表达ICAM-1蛋白在12～72h显著升高，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论DV2感染上调HUVEC的ICAM-1 mRNA水平和蛋白表达，从而诱发并加重血管内皮局部的损伤，破坏血管的屏障功能，促进血管渗漏的形成与发展。这可能是DV2感染诱发患者血管通透性升高和血浆渗漏的重要分子机制之一。     

LPS的直接诱导对肺微血管内皮细胞ICAM-1的表达及对PMN黏附作用影响的研究

目的探讨内素毒(Endotoxin LPS)的直接诱导作用对肺微血管内皮细胞(PMVEC)ICAM-1表达的影响及诱导发生的PMVEC对多形核中性粒细胞(PMN)黏附作用的影响。方法100ng/m l LPS刺激PMVEC 0、2、4、6、8 h或10、50、100 ng/m l LPS刺激6 h,同时检测PMVEC ICAM-1的表达(免疫细胞化学法)、PMVEC-PMN黏附率及抗ICAM-1抗体对黏附作用的影响,并进行PMVEC与PMN黏附作用的扫描电镜观察。结果LPS的直接刺激可诱导PMVEC ICAM-1的表达增加,且表现为随LPS刺激的时间、剂量增加而增加;同时LPS直接刺激也促进了PMVEC对PMN的黏附率增加,其变化在时间与方式上几乎与ICAM-1的表达增加同步。Anti-ICAM-1抗体可以显著地抑制LPS诱导的PMVEC-PMN黏附(P<0.01)。扫描电镜可以直观地显示PMVEC-PMN黏附的超微结构表现,并且首次通过这种方式观察到了“间接系链”现象的存在。结论表明细菌致病因子LPS的直接诱导可以促进PMVEC表达ICAM-1,从而为PMVEC-PMN的黏附提供物质基础,而“间接系链”的发生更扩大和巩固了黏附效果。     

红花含药血清对缺氧复氧条件下大鼠肺动脉内皮细胞P-选择素及ICAM-1表达的影响

目的：观察红花含药血清在缺氧复氧条件下对大鼠肺动脉内皮细胞P-选择素(Ps)及细胞间黏附因子-1(ICAM-1)基因表达的影响。方法：用细胞培养、RT-PCR、Western blotting、中药血清药理学方法、免疫细胞化学染色法等技术,观察在常氧、缺氧、复氧及红花含药血清干预等不同条件下大鼠肺动脉内皮细胞P-选择素及细胞间黏附因子-1基因的表达变化。结果： 缺氧组1、6和12 h各个时点P-选择素及ICAM-1 mRNA及蛋白水平与同时点常氧组明显差异。缺氧1 h后再给氧（缺氧复氧组）1、6和12 h后P-选择素及ICAM-1 mRNA及蛋白表达均明显高于同时点缺氧组及常氧组；缺氧1 h后再给氧同时给予红花含药血清干预各个时点P-选择素及ICAM-1 mRNA及蛋白明显低于单纯缺氧复氧组（P＜0.05）。结论：缺氧复氧条件下P-选择素及ICAM-1过度表达，可能参与肺栓塞溶栓后缺血再灌注损伤的机制，红花注射液对其有显著缓解作用。     

低体温降低内毒素性急性肺损伤大鼠肺血管ICAM-1表达

目前认为急性肺损伤(acute lung iniury,ALI)“早期事件”是肺内中性粒细胞聚集和激活,而中性粒细胞和肺血管内皮细胞之间的黏附作用需要细胞间黏附分子表达上调。有研究显示,低温可降低细胞问黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达及随后的中性粒细胞迁移,从而减轻缺血性损伤。据此,本研究探讨中度低温对内毒素(lipopolvsacchalide,LPS)性ALI大鼠肺血管ICAM—1表达及肺内中性粒细胞聚集的影响。     

葡萄糖胺对TNF-α诱导的血管内皮细胞VCAM-1表达的影响

目的探讨葡萄糖胺对肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)诱导的人脐带血管内皮细胞(HUVEC)血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)表达的影响。方法实时逆转录聚合酶链式反应(Real time RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)分别测定葡萄糖胺对VCAM-1的表达情况;Western blot法测定HUVEC核因子-κB(nuclear factor,NF-κB)磷酸化程度。结果葡萄糖胺抑制TNF-α诱导的VCAM-1在HUVEC的表达;NF-κB抑制剂BMS-345541抑制TNF-α诱导的VCAM-1的表达;葡萄糖胺抑制TNF-α诱导的NF-κB的磷酸化。结论葡萄糖胺抑制TNF-α诱导的VCAM-1的表达与抑制NF-κB的活化相关。     

大鼠肺微血管内皮细胞磷酸二酯酶mRNA表达与活性检测

目的 检测大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)内磷酸二酯酶(PDE)同功酶mRNA表达及基础酶活性,明确PMVECs存在的PDE亚型及体外活性. 方法 采用植块法分离培养PMVECs,RT-PCR法测定PDE mRNA表达,以高效液相色谱(PHLC)检测环核苷酸在酶反应前后的含量变化,计算PDE活性. 结果 检测结果 显示,PMVECs中含有PDE1A、1C、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、10A、11A共17种PDE mRNA,而PDE1B mRNA 未见表达,酶量在5～20μl范围内与PDE活性存在良好的线性关系. 结论 PMVECs中存在17种PDE基因表达,并有较高的基础酶活性.     

小鼠肺微血管内皮细胞的培养鉴定及其血管形成功能的研究

目的: 建立一种简单有效的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)原代培养方法,并对其体外血管形成功能进行研究。方法: 取小于1周龄的C57BL/6小鼠的肺组织边缘,采用组织贴块法培养原代PMVECs。经形态学观察、免疫细胞化学鉴定后,以每孔2×10⁴的密度接种于铺有基质胶的96孔细胞板,在倒置显微镜下观察(2 h 1次)其24 h 体外血管形成过程。结果: 镜下可见原代培养的PMVECs呈梭形或多角形,单层融合呈铺路石样。细胞抗Ⅷ因子相关抗原(ⅧF-Ag)染色阳性。免疫荧光显微镜下可见大部分细胞摄取四甲基吲哚碳花青标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL),胞质呈现红色荧光,细胞膜表面与异硫氰酸荧光素标记的异植物血凝素(FITC-BSI)结合,呈现黄绿色荧光。PMVECs接种4~6 h后出现明显的管腔结构,10~12 h呈蜂窝状结构,此后管腔结构逐渐减少。结论: 组织贴块法培养原代PMVECs操作简单,细胞得率和纯度高,并可在体外成功建立血管形成模型进行相关研究。     

白藜芦醇对TNF-α诱导的离体大鼠肺动脉内皮细胞损伤及MCP-1表达的影响

目的:探讨中药单体白藜芦醇(resveratrol,Res)对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的离体大鼠肺动脉内皮细胞(rat pulmonary artery endothelial cells,RPAECs)中单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的作用。方法:采用组织贴块法培养RPAECs,随机分为空白对照组(control组)、溶剂对照组(solvent组)、TNF-α(10μmol/L)组和Res(50μmol/L)+TNF-α组(Res组),每组又分成1、4和8 h三个时点(n=6),在8 h增加TNF-α+C1142(MCP-1特异性中和抗体)组(C1142组)。采用Western blot方法检测RPAECs中MCP-1蛋白表达,real-time PCR方法检测MCP-1 mRNA表达。结果:C1142可显著减少TNF-α诱导的RPAECs凋亡(P0.05)。相同时点solvent组的MCP-1蛋白和control组比较差异无统计学显著性;TNF-α组的MCP-1蛋白及mRNA较control组增高(P0.05);Res组的MCP-1蛋白及mRNA表达较TNF-α组降低(P0.05)。结论:MCP-1参与TNF-α诱导的RPAECs损伤;Res可降低TNF-α诱导的RPAECs中MCP-1表达,从而减少内皮细胞损伤。     

咳宁方对流感病毒性肺炎小鼠肺组织HSP70表达的影响

目的:探讨咳宁方对实验性小鼠流感病毒性肺炎预防作用及其机制。方法:将NIH小鼠50只随机分为5组,即正常对照组、模型组、病毒唑组、咳宁I方组、咳宁Ⅱ方组。将冻存的流感病毒鼠肺适应株(FM₁)复苏,在鸡胚中繁殖,用乙醚将各组小鼠分别轻度麻醉后,以FM₁ 15个LD₅₀滴鼻感染小鼠,正常对照组给等量蒸馏水滴鼻。各组感染病毒前2 d,开始灌胃给药或等量生理盐水,每日2次,每次0.3 mL,直至感染后4 d共给药6 d。小鼠于感染后第4 d处死,取肺组织置－70 ℃冰箱保存。用Lowry法测定肺组织总蛋白,Western blot测定HSP70含量,并用光镜观察小鼠肺组织的病理变化。结果:模型组、3个用药组HSP70均显著高于正常对照组(P＜0.01), 咳宁I方组HSP70显著高于模型组(P＜0.05),且与病毒唑组亦有显著差异(P＜0.05)。咳宁I方组和病毒唑组小鼠肺组织病变程度明显轻于模型组(P＜0.05)。结论:流感病毒性肺炎小鼠的肺组织中HSP70表达显著增加,咳宁I方诱导流感病毒性肺炎小鼠肺组织HSP70表达增加,提示咳宁I方对流感病毒性肺炎小鼠的肺组织有保护作用。     

LPS对鼠肺微血管内皮细胞水通道蛋白-1表达及其功能的影响

目的：通过观察脂多糖（LPS）刺激对肺微血管内皮细胞水通道蛋白-1 mRNA表达和功能的影响，以探讨急性肺损伤肺水异常代谢的机制。方法： 在体外培养的大鼠肺微血管内皮细胞（RLMEC），分别使用浓度为100 μg/L、1 mg/L、10 mg/L的LPS与之孵育4 h、12 h、24 h后, 应用氚水掺入法测定RLMEC内氚水的信号强度，并用RT-PCR法测定AQP-1 mRNA的表达。结果： LPS刺激组氚水的信号强度显著低于对照组（P<0.01）；同时LPS刺激组AQP-1 mRNA的表达显著低于对照组。结论： LPS刺激RLMEC AQP-1 mRNA表达和摄水功能下降，提示AQP-1在急性肺损伤时可能与肺水代谢异常有关。     

高致病性禽流感病毒H5N1安徽株A/Anhui/1/2005感染人肺癌上皮细胞(A549)的差异表达分析

目的 筛选人细胞中与高致病性禽流感病毒致病相关的基因,探讨高致病性禽流感病毒的致病机理.方法 分别用高致病性禽流感病毒安徽株和普通人流感病毒H1N1株分别感染人肺癌上皮细胞,通过人类全基因表达谱芯片技术对不同时段感染细胞进行差异表达分析,筛选出与高致病性禽流感病毒感染相关的候选基因,以实时定量荧光PCR法验证差异表达基因.结果 获得了不同致病性流感病毒感染细胞后的差异表达谱,验证了细胞凋亡通路、mTOR通路中以及与免疫相关的16个基因的差异表达.结论 H5N1感染后与普通人流感病毒H1N1相比具有促进细胞凋亡的趋势.     

罗格列酮对人腹膜微血管内皮细胞AQP1、VEGF-A及COX-2表达的影响

目的:探讨罗格列酮对人腹膜微血管内皮细胞水孔蛋白1(AQP1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)及环氧合酶2(COX-2)蛋白的影响。方法:(1)体外培养人腹膜微血管内皮细胞并分为4组;用倒置显微镜观察细胞形态学变化;(2)Western blotting检测细胞AQP1、VEGF-A和COX-2蛋白的表达;(3)real-time PCR检测细胞AQP1、VEGF-A及COX-2 mRNA的表达。结果:罗格列酮可促进人腹膜微血管内皮细胞增殖,上调AQP1蛋白及基因的表达(P0.05),下调VEGF-A和COX-2蛋白和mRNA的表达,过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)拮抗剂GW9662可部分抑制罗格列酮上调的AQP1表达(P0.05),但对VEGF-A及COX-2表达无明显影响(P0.05)。结论:罗格列酮能够上调腹膜微血管内皮细胞AQP1的表达,下调VEGF-A及COX-2的表达,这可能与罗格列酮增加腹膜水转运、减轻腹膜纤维化有关。     

黄芩、板蓝根等清热解毒药对流感病毒所致肺炎小鼠炎性因子蛋白表达的影响

目的 研究清热解毒代表药物对流感病毒FM1感染肺炎小鼠肺匀浆炎性细胞因子的影响,以筛选出对流感病毒具有更好免疫调控作用的清热解毒中药.方法 建立流感病毒鼠肺适应株(FM1)感染的小鼠肺炎模型,采用双抗夹心ELISA法分别在感染后第1、3、5、7天检测空白对照组、模型对照组、黄芩组、板蓝根组、白头翁组、虎杖组、白花蛇舌草组小鼠肺匀浆TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1、IL-10含量的变化.结果 流感病毒感染小鼠后,模型组TNF-α,IL-1,IL-6,IFN-γ的蛋白表达高于正常空白组,在第3天达峰值,差异有统计学意义(P＜0.05).清热解毒代表药物黄芩、板蓝根均可以降低TNF-α、IL-6、IL-1含量,提高IL-10、IFN-γ的含量,第3、5天时作用较明显,有统计学意义(P＜0.05).白头翁、虎杖及白花蛇舌草对炎性细胞因子在一定程度上有调节作用,但效果不及黄芩和板蓝根.结论 清热解毒代表药物黄芩、板蓝根可通过调节细胞因子水平来干预流感病毒引起的免疫损伤,从而发挥抗流感病毒的作用.     

Effect of palmitic acid and linoleic acid on expression of ICAM-1 and VCAM-1 in human bone marrow endothelial cells (HBMECs)

Introduction

The amount and type of fatty acids (FAs) in the diet influence the risk of atherosclerosis. Palmitic acid and linoleic acid exist at high levels in Iranian edible oils. In this study, we investigated the effect of palmitic acid and linoleic acid on expression of soluble and cell-associated forms of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in human bone marrow endothelial cells (HBMECs).

Material and methods

The endothelial cells were induced with bacterial lipopolysaccharide (LPS) or tumor necrosis factor α (TNF-α), and thereafter incubated with palmitic or linoleic acid. The level of soluble and cell-associated VCAM-1 and ICAM-1 were analyzed using ELISA and western blot.

Results

Our findings indicated that palmitic acid up-regulates the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in HBMECs when these cells are induced with TNF-α or LPS. In addition, the results suggest that linoleic acid could sustain up-regulated ICAM-1 and VCAM-1 in activated endothelial cells.

Conclusions

Chronic activation of endothelial cells in the presence of palmitic and linoleic may account for pathogenesis of cardiovascular events. These findings provide further support for the detrimental effects of these fatty acids, especially palmitic acid, in promotion and induction of cardiovascular diseases which are prevalent in the Iranian population.