氧化型极低密度脂蛋白诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡

探讨氧化型极低密度脂蛋白诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的作用。应用低温超速离心法分离健康人血浆极低密度脂蛋白，用CuCl2氧化得到氧化型极低密度脂蛋白。琼脂糖凝胶电泳观察巨噬细胞凋亡DNA断裂“梯状”图谱；流式细胞仪和二苯胺法分别测定凋亡巨噬细胞百分率和：DNA片断百分率；光镜观察凋亡巨噬细胞形态变化。结果发现：①氧化型极低密度脂蛋白能诱导巨噬细胞发生凋亡及DNA断裂；②抗氧化剂二甲基硫脲能部分抑制氧化型极低密度脂蛋白诱导的：DNA断裂；③核转录因子核因子kB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐可完全抑制氧化型极低密度脂蛋白诱导的DNA断裂。提示氧化型极低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡可能是动脉粥样硬化形成机制之一；氧化型极低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡的作用可能与自由基和激活核因子kB有关。     

灰树花多糖诱导HeLa细胞凋亡的体外实验

目的 观察灰树花多糖(PGF)对HeLa凋亡的影响.方法 采用MTT法研究PGF对HeLa细胞增殖的体外抑制作用,HE染色观察凋亡细胞形态,免疫组化法检测caspase-3蛋白表达.结果 PGF以时间和剂量依赖的方式抑制HeLa细胞的生长,HE染色观察到凋亡细胞的形态学改变,免疫组化检测到caspase-3蛋白高表达.结论 PGF促进HeLa细胞凋亡,其作用机制可能与caspase-3蛋白表达增高有关.     

布鲁杆菌病患者体内T细胞免疫功能研究

目的探讨布鲁杆菌病人体内T淋巴细胞及相关细胞因子的变化。方法用流式细胞术检测外周血单个核细胞中CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞和CD4／CD8比例;用ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5。结果试验组外周血CD4^＋T细胞和CD4／CD8比例明显高于对照组（P〈0．05）,而CD8^＋T细胞与对照组相比无显著差异（P〉0．05）;试验组血清中IFN-γ和IL-2水平明显高于对照组（P〈0．05）,而IL-4和IL-5水平与对照组相比无显著差异（P〉0．05）。结论布鲁杆菌感染后T细胞免疫主要表现为Th1功能增强,这可能对机体清除病原菌有重要意义。     

雷米普利对慢性心力衰竭大鼠肾脏细胞凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3及细胞色素C的影响

目的观察雷米普利对慢性心力衰竭大鼠肾脏细胞凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3和细胞色素C的影响。方法 40只雄性Wistar大鼠,按随机数字表法平均分组,正常对照组10只,余均采用肾上腹主动脉缩窄法建立CHF大鼠模型,将建模成功的20只随机均分为模型组和雷米普利组,分别采取苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠肾脏细胞的形态结构,原位末端标记法(TUNEL)测定肾脏细胞凋亡率;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肾脏组织中caspase-3及细胞色素C mRNA的表达;Western印迹法检测肾脏组织caspase-3蛋白及细胞色素C蛋白含量。结果与正常对照组相比,模型组肾脏组织凋亡指数(AI)显著增高,caspase-3和细胞色素C mRNA及蛋白表达明显增加(P0.01);与模型组相比,雷米普利组肾脏组织AI显著减少,caspase-3和细胞色素C mRNA及蛋白表达量均显著降低(P0.01)。结论雷米普利能够降低CHF大鼠肾脏组织凋亡率,减少肾组织中caspase-3和细胞色素C mRNA及蛋白表达,其抑制肾脏细胞凋亡的作用可能是改善肾功能的作用机制。     

姜黄素诱导A549细胞凋亡过程中活性氧水平和caspase-3活性的变化

目的 探讨姜黄素诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的发生机制.方法 采用MTT法检测姜黄素对A549细胞增殖的影响;Hoechst33258荧光染色法观察姜黄素对A549细胞凋亡的影响; DCFH-DA为细胞内活性氧(ROS)探针,激光共聚焦扫描显微镜检测姜黄素对A549细胞ROS水平的影响,分光光度法测定姜黄素对A549细胞内caspase-3活性的影响.结果 不同浓度的姜黄素作用12、24、36、48 h后均可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖并诱导其发生凋亡作用;激光共聚焦扫描显微镜下观察姜黄素作用后细胞ROS明显上升,细胞内caspase-3活性增强.结论 姜黄素对人肺腺癌A549细胞有明显的抑制生长和诱导凋亡作用,对细胞ROS和caspase-3活性的影响在其诱导A549细胞凋亡中发挥作用.     

布鲁杆菌BP26重组卡介苗的构建及对小鼠CD4+和CD8+T细胞的影响

目的 构建预防布鲁杆菌病的新型疫苗——布鲁杆菌BP26重组卡介苗(rBCG-BP26),观察rBCG-BP26对免疫小鼠CD4+、CD8+T细胞的影响.方法 利用常规分子生物学技术构建重组穿梭分泌载体pMV261-Ag85B-BP26,电转入卡介苗(BCG)后经过卡那霉素抗性筛选,对获得的基因重组株进行PCR鉴定.采用Western免疫印迹法检测菌体和液体培养基中BP26蛋白表达情况.选用45只BALB/c小鼠进行安全性实验分析,将其分成3组:目标实验(rBCG-BP26)组、阳性对照(BCG)组、阴性对照(PBS)组,每组15只.分别在小鼠皮内接种100μl rBCG-BP26[含106克隆形成单位(CFU)]、BCG、PBS.观察各组小鼠体征,在小鼠免疫后的第10、20、30、40天称量体质量,并于尾部采血,用流式细胞仪分析CD4+、CD8+T细胞含量.结果 成功构建rBCG-BP26重组疫苗株.在菌体和液体培养基中均能检测到BP26蛋白的表达.安全性实验分析表明,3组小鼠在免疫后第10、20、30、40天体质量比较,差异无统计学意义[rBCG-BP26组分别为(19.16±0.55)、(20.89±0.20)、(22.15±0.76)、(24.60±0.64)g; BCG组分别为(19.90±0.02)、(21.53±1.57)、(21.95±0.55)、(24.70±0.39)g;PBS组分别为(19.24±0.54)、(21.37±0.66)、(22.83±0.62)、(25.06±0.37)g;F值分别为2.468、0.331、1.520、0.739,P均＞0.05].在免疫后第10、20天时,rBCG-BP26组小鼠全血CD4+T细胞含量(13.40％、26.70％)低于BCG组(26.70％、33.07％)和PBS组(33.85％、29.33％),rBCG-BP26组CD4+/CD8+T细胞含量比值随时间延长而逐渐增长(0.69％、1.27％、1.57％、1.70％).结论 rBCG-BP26能高效表达布鲁杆菌BP26蛋白,并具有毒力弱、能激活机体CD4+、CD8+T细胞的特点,可作为预防布鲁杆菌病的疫苗候选株之一.     

灰树花多糖联合顺铂诱导HeLa细胞凋亡

目的探讨灰树花多糖(PGF)联合顺铂(DDP)诱导He La细胞凋亡及其可能的分子机制。方法四甲基偶氮唑蓝比危法(MTT)检测细胞增殖抑制率,RT-PCR法检测survivin和caspase-3 m RNA的表达。结果 MTT法显示,联合用药抑制率均高于单药组(P<0.05)。PGF0.05 mg/L与DDP 1 mg/L联合作用24 h时,Q>1.15;RT-PCR显示,联合用药组与两单药组比较survivin m RNA表达下调,caspase-3 m RNA表达上调。结论联合用药对He La细胞的抑制率较单独用药组有明显提高。联合用药24 h时点,二者有协同作用。联合用药诱导He La细胞凋亡可能与凋亡基因survivin表达下调和caspase-3基因表达上调有关。     

氧化型低密度脂蛋白的不同组分在诱导巨噬细胞凋亡中的作用

通过观察调居噬细胞的特征性ＤＮＡ梯形图谱和细胞核的形态变化，研究了氧化型低密度脂蛋白的不同组份在其诱导的巨噬细胞凋亡中的作用。结果发现；氧化型低密度脂蛋白可引起巨噬细胞凋亡，表现在ＤＮＡ图谱呈典型的梯形，细胞核固缩，正常和乙酰化低密度脂蛋白均未引起巨噬细胞的明显凋亡，用谷胱苷肽过氧化物酶模拟物ｅｂｓｅｌｅｎdisplay structure     

醋酸铅诱导人肝细胞系L-02细胞凋亡与caspase-3表达关系的影响

目的:探讨醋酸铅对人肝细胞系L-02细胞凋亡与caspase-3表达的关系.方法:不同浓度(0、2.5、40、100、200、400μmol/L)的醋酸铅处理的L-02细胞24 h及(或)48 h后,MTT法观察L-02细胞生长的影响,Hoechest33258染色法观察细胞凋亡形态学变化,RT-PCR和Western...     

Bcl-xl阻断肿瘤坏死因子α诱导的caspase 8活化及细胞凋亡

目的探讨BCl-xl对肿瘤坏死因子α(TNFα)介导的细胞凋亡信号通路以及细胞凋亡的影响。方法将iκBα负性突变体质粒pmiκB与绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒pEGFP-Cl，pmiκB、DBcl-xl／HA与pEGFP-Cl分别共转染HeLa细胞；将pBcl-xl／HA转染核因子κB(NFκB)／p65基因敲除的p65／MEF细胞，并用嘌呤霉素筛选及westernblot鉴定获得稳定表达Bcl-xl的细胞系p65／／Bcl-xlMEF。用TNFα处理HeI。a／miκB、IteLa／miκB／Bcl-xl细胞以及p65／MEF、p65／／Bcl-xlMEF细胞，并在冠微镜下观察细胞形态变化、台盼蓝染色计算死亡细胞以检测各组细胞凋亡情况；采用western blot检测凋亡信号通路中caspase8活化及腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)裂解情况。结果单独转染pmiκB的HeLa细胞，TNFα诱导的细胞凋亡明显，表现为细胞变圆、脱落、死亡，而PBCl-xl／HA与PmiκB共转染的HeLa细胞，TNFα处理后未见细胞凋亡。P65／MEF细胞经TNIrα处理发生凋亡，该作用在TNFα处理后4h即可出现，处理12h后绌胞死亡率为90％，而在表达Bcl-xl的p65／／Bcl-xlMEF细胞，TNFα处理24h也未见细胞凋亡或死亡发生。Westernblot检测表明单独转染pmiκB的HeLa细胞，TNFα诱导了caspase8裂解活化及PARP裂解，而pBcl-xl／HA与pmiκB共转染、表达Bcl-xl的HeLa细胞，TNFα诱导的caspase8裂解活化及PARP裂解被阻断。结论在NFκB被抑制的实验细胞系统，Bcl-xl能阻断TNFα介导的细胞凋亡信号通路以及细胞凋亡，这对于进一步研究TNFα相关疾病发生机制及治疗措施有重要价值。     

基于RNA-Seq的羊种布鲁氏菌新转录本与非编码RNA鉴定

目的 对羊种布鲁氏菌的转录本进行测序,鉴定基因组中新的转录本和非编码RNA。方法 提取羊布鲁氏菌的总RNA,去除rRNA后连接接头逆转录成cDNA,PCR扩增后进行测序,以羊布鲁氏菌16M的基因组序列为参照对测序得到的reads进行比对作图,通过生物信息学方法进行新转录本和非编码RNA的鉴定。结果 测序数据分析显示,reads在基因组上覆盖度较好。与现有注释基因相比,有773个基因的5'或3'端在基因组的原有位置基础上发生了延伸,并发现了16个新的转录本。根据测序结果,共鉴定出241条候选的非编码RNA(sRNA),进一步的RT-PCR验证结果显示,预测的sRNA在体外条件下有表达。结论 布鲁氏菌基因组中存在除了预测以外的新的转录本,布鲁氏菌中存在非编码RNA且在不同条件下有差异表达。     

内蒙古羊种布鲁氏菌传播模式调查研究

目的 调查内蒙古羊种布鲁氏菌的传播模式和流行规律。方法 采用AMOS-PCR对60株布鲁氏菌的种型进行鉴定,用Hunter-Gaston Diversity Index(HGDI)评价菌株的遗传多态性特征,采用MLVA-16分型方法对菌株进行基因分型,确定菌株的亲缘关系。结果 60株试验菌全部为羊种布鲁氏菌。MLVA-16对菌株具有极高的分辨力,多态性指数为0.981;Panel 1,Panel 2A和Panel 2B的多态性指数分别为0.264,0.345和0.980;Panel 2B中Bru16位点的多态性指数最高,多态性指数为0.835。60株羊种布鲁氏菌聚为5大类37个基因型,其中15个共享基因型包括38株羊种布鲁氏菌,聚类率为63.3%(38/60),提示病例多为有流行病学关联的暴发流行;另外22株菌表现为独特基因型表明菌株无明显的流行病学相关性。共享基因型GT5包括2株分别分离自羊和骆驼的菌株且有相同的MLVA-16基因型,提示布鲁氏菌在羊和骆驼中循环传播;3个共享基因型(GT11、GT17和GT23)分别包含来自人和羊的菌株并呈现完全相同的MLVA-16基因型,表明羊是人间布病的传染源。GT35由3株分离自羊脾的菌株构成且共享相同的基因型,提示布病在羊中呈暴发流行。类群E由12个来自不同宿主(羊,牛,野生骆驼和人)的菌株构成,共享相同或相似的MLVA-16基因型,揭示了内蒙古羊种布鲁氏菌潜在的传播模式。结论 疫羊是主要传染源,野生动物(骆驼)是贮藏宿主。羊种布鲁氏菌在羊牛(骆驼)和骆驼(羊牛)中相互循环传播,最后传染给人是内蒙古羊种布鲁氏菌的潜在传播模式。     

感染性心内膜炎患者血液中分离到羊种布鲁菌

目的从患者血液中分离出的病原菌进行生物学性状研究和种及型的临床鉴定;探讨布鲁菌病在热带海岛海南的流行特点。方法按布鲁菌标准鉴定方法进行细菌学实验(包括形态学、培养特性、生化特征、血清学试验和噬菌体试验等),并对患者的流行病学、临床资料、实验室资料进行系统分析。结果患者血液中病原微生物的形态学、培养特性、生化特征、血清学诊断和噬菌体诊断结果均符合羊种布鲁菌生物2型;与我国近几年分离到的羊种布鲁菌生物1型和3型相比明显不同;羊种布鲁菌尿素酶试验为不定(V),也没有强阳性的报告,而海南分离株为强阳性。结论海南省首次发现人布鲁菌病,由羊种布鲁菌2型引起。该病在海南省存在分散的点状流行,应引起医务人员及有关部门的重视。     

Molecular characteristics of Brucella melitensis isolates from humans in Qinghai Province,China

Background::The prevalence of human brucellosis in Qinghai Province of China has been increasing rapidly, with confirmed cases distributed across 31 counties. H...     

羊布鲁杆菌M5-90 BP26抗原单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高亲和性的羊布鲁杆菌M5-90 BP26抗原单克隆抗体,并对抗体进行鉴定.方法 将质粒pET-28a-BP26转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21 (DE3),构建原核表达质粒pET-28a-BP26,用镍离子金属螯合亲和层析法(Ni-NTA)纯化、重组BP26蛋白(rBP26).将纯化后的rBP26蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合成乳化抗原,接每只100 μg/0.1 ml在BALB/c小鼠皮下多点注射进行初次免疫;2周后,按每只50μg/0.1ml 在小鼠皮下多点注射进行再次免疫.再次免疫后2周,小鼠尾静脉取血测效价,检测免疫效果;在细胞融合前3天,将乳化抗原按每只小鼠50μg腹腔注射加强免疫.将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞按1∶5比例在聚乙二醇( PEG) 1450作用下进行细胞融合,置于37℃、5％CO2培养箱中培养;10 d后取细胞培养上清液,用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定,筛选分泌抗rBP26抗体的杂交瘤细胞;再经过反复3次克隆,筛选出单克隆全阳性的杂交瘤细胞建株,用杂交瘤细胞株制备BP26抗原单克隆抗体,并以初始杂交瘤细胞克隆导命名.利用羊布鲁杆菌M5 -90疫苗株制备膜蛋白提取物(NMP),采用免疫印迹法(Western)及斑点间接酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)对筛选的单克隆抗体进行免疫学特性鉴定,用单克隆抗体亚型试剂盒进行抗体分型和Kappa (κ)和Lambda(λ)轻链鉴定.结果 成功地获得2株能稳定分泌抗rBP26抗原的高亲和性杂交瘤3C3和5A5单克隆抗体,并能与羊布鲁杆菌M5-90疫苗株上的NMP结合,构建成M5-90 BP26抗原单克隆抗体,抗体亚型分别为IgG1和IgG2b,轻链均为κ链.结论 鉴定结果表明,成功制备2株羊布鲁杆菌BP26抗原的高亲和性单克隆抗体,抗体具有识别M5-90疫苗株的膜蛋白构象表位的能力,优势表位的识别可为羊布鲁杆菌M5-90疫苗株的改造提供实验依据.     

贵州省两株山羊源羊种布鲁菌MLST分析

目的了解贵州省2010年分离自山羊的两株羊种布鲁菌的等位基因序列型(Sequence type, ST)及遗传学特征,为动物间和人间布病疫情的预防和控制提供科学依据。方法应用布鲁菌属特异性PCR(BCSP31-PCR)和种/型特异性PCR(AMOS-PCR)对2010年分离自山羊的两株布鲁菌进行鉴定,采用多位点序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)技术对两株布鲁菌菌株的7个管家基因、1个外膜蛋白基因及1个基因间区的序列进行测定,将各个基因的序列与参考菌株的等位基因型进行比对,确定其等位基因谱及序列型(STs),分析与两株菌ST型与各种型布鲁菌代表菌株的遗传进化关系。结果来自贵州省山羊的两株布鲁菌株经BCSP31-PCR鉴定为布鲁菌属细菌,AMOS-PCR将其鉴定为羊种布鲁菌。MLST分析显示,两株菌的9个等位基因序列型为ST8型,与同属羊种布鲁菌的ST7、ST9~ST12、ST34和ST35遗传关系最近。结论贵州省2010年分离的2株布鲁菌分离株均为ST8型布鲁菌,与同属羊种布鲁菌的ST型遗传关系最近,结果为贵州省人间和动物间布病疫情的预防和控制提供了科学依据。     

人工诱变利福平抗性布鲁氏菌转录组测序分析

目的 筛选布鲁氏菌中参与利福平代谢相关基因(除rpoB基因外)。方法 利用人工诱变技术获得利福平抗性菌株,通过转录组测序获得标准菌株和利福平抗性菌株全基因组水平的基因表达量,利用EBSeq算法筛选差异表达基因,预测利福平代谢相关基因及主要代谢途径。结果 通过不同浓度的利福平人工诱变,能够获得抗性表型稳定的布鲁氏菌变异菌株。转录组测序发现利福平抗性菌株中有121个基因表达量上调,197个基因表达量下调,差异基因功能主要集中于催化活性、细胞膜和细胞成分、代谢过程和细胞过程;主要参与抗生素的生物合成、细菌分泌系统和ABC 转运蛋白等代谢通路。结论 包括virB操纵子在内的涉及碳代谢等代谢通路的基因,通过表达量的改变参与抵抗利福平的作用。 本研究为布鲁氏菌耐药相关基因的筛选提供新思路,同时为布鲁氏菌耐药菌株的防控提供基础性数据。     

用羊种布鲁氏菌16M菌株感染豚鼠脾组织的超微病理学观察

本实验采用强毒羊种布鲁氏菌16M菌株感染豚鼠,于感染后3个月时取脾组织在透射电镜下观察其超薄切片,发现了亚细胞结构(细胞器)的病理改变。所见到的主要改变为线粒体普遍发生肿胀增大,嵴减少和断裂等表现,同时有高尔基复合体和溶酶体明显地增多。     

布鲁氏菌疫苗株S2全基因组测序及牛羊布鲁氏菌比较基因组学研究

目的 为了了解布鲁氏菌S2疫苗株全基因组结构及分子生物学功能。方法 对布鲁氏菌疫苗株S2进行全基因组测序,并与GenBank公布的6株牛羊布鲁氏菌进行比较基因组学研究。结果与结论 通过全基因组测序发现S2基因组大小为3 331 982 bp,预测基因有3 243个,GC含量为57.23 %。S2预测基因中大多数基因功能主要与糖代谢﹑氨基酸代谢﹑氨基酸转运和膜转运有关。通过比较基因组学研究发现S2有20个特有基因。另外S2与GenBank公布的S2序列进行比对发现有19个差异基因。     

牛羊猪种布鲁氏菌快速鉴别PCR方法的建立及评价

目的 建立一种可在一个反应体系中同时鉴别布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的快速PCR鉴别方法。方法 将布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的扩增引物进行优化组合,建立全新的BAMS-PCR方法;随后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对现场分离的219株布鲁氏菌进行鉴别,评价其在布鲁氏菌鉴别中的应用价值。最后,用该方法对临床标本中布鲁氏菌的DNA进行扩增,评价其在临床诊断中的实用性。结果 BAMS-PCR方法可在同一反应中同时鉴别布鲁氏菌及牛种(1,2,4型),羊种(1,2和3型)和猪种(1型)布鲁氏菌,并有较好的特异性和敏感性。布鲁氏菌属,牛种,猪种和羊种布鲁氏菌引物的检测灵敏度分别为10 pg/μL,100 pg/μL, 10 pg/μL和100 pg/μL。BAMS-PCR对219株临床分离菌株的鉴定结果和常规生物分型方法的鉴定符合率为100%。经BAMS-PCR检测,97份临床血清样本仅6份为阳性,全血和组织(羊脾)样本全部为阴性。结论 BAMS-PCR是一种简便、快速、高效、准确的布鲁氏菌鉴别方法,可作为临床分离菌株的首选鉴别方法。