HCV第一高变区的免疫学研究进展

HCV属黄热病毒科,感染人体后可引起机体免疫应答发生异常,导致组织损伤,形成慢性持续性感染,并能进一步发展为肝硬化甚至肝细胞肝癌.目前全世界约有1.7亿HCV感染者,约有75%左右的急性丙型肝炎患者转为慢性感染,其中10%～20%慢性丙型肝炎患者发展为肝硬化,1%-5%发展为肝癌[1].丙型肝炎在治疗和预防方面具有很强的局限性,这主要是由于HCV的高度变异性,其中位于E2 NS1区N端第27位氨基酸的变异性最大,通常称之为第一高变区(hypervariable region 1,HVR1).研究证明HVR1中含有优势表位[2],其高度变异性也将对机体产生的针对HCV的细胞和体液免疫应答造成障碍.现本文就近年来有关HCV-HVR1的免疫学研究进展做一综述.     

丙型肝炎病毒第一高变区HVR1的研究进展

ＨＶＲ１含有丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）重要的中和性抗原表位，是疫苗研究的重要靶点。但由于其高度变异性，使ＨＶＲ１成为ＨＣＶ治疗和预防的瓶颈。本文从ＨＶＲ１的高变性、及引起宿主的体液免疫和细胞免疫反应，介绍国际上有关ＨＶＲ１的最新研究进展，这对ＨＣＶ的防治、尤其是对其预防具有重要的参考价值。     

20例中国人HCVⅡ/1b型高变区1序列变异的动态观察

目的 动态研究中国人群ＨＣＶⅡ／１ｂ型包膜蛋白Ｅ２／ＮＳ１高变区１（ＨＶＲ１）序列变异规律、意义及影响因素。方法 应用逆转录巢式ＰＣＲ技术从２０例ＨＣＶⅡ／１ｂ型感染的中国病人血清中扩增了ＨＣＶ部分包膜区基因片段（ｎｔ１４４９～１５８６，ＨＣＶ－Ｊ），纯化后直接采用双脱氧链末端终止法进行序列分析。结果 中国人群ＨＣＶ ＨＶＲ１位于氨基酸（ＡＡ）３８４～４１０位，有６个较保守的ＡＡ位点；３８５位Ｔｈ     

HCV/HBV复合DNA免疫的初步研究

目的 探讨HCV/HBV复合抗原PCX/S免疫原性。方法 将已证实具有良好免疫原性的人工合成的HCV复合多表位抗原基因PCX与HBV的S抗原基因融合于真核表达载体pcDNA3.0,构建真核表达载体pcDNA-PCXS。大量提取质粒并免疫小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCVAb;~3H-TdR渗入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;用~(51)Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTLs杀伤作用。结果 免疫后均能检测到抗-HBsAb和抗-HCVAb,抗体水平随着时间的推移逐渐升高,但后者OD_(450nm)平均值低于抗-HBsAb的OD_(450nm)。免疫小鼠诱发针对PCX或S抗原的CTL反应和淋巴细胞转化。结论 复合型PCX/S抗原基因可诱发特异性免疫应答,为HCV/HBV双价疫苗的研究提供一定实验基础。     

HCV免疫学诊断抗原与链亲和素融合蛋白的制备及应用研究

目的 制备带有链亲和素（SA）标签的丙型肝炎病毒（HCV）融合蛋白,并初步探讨其在抗-HCV ELISA检测中的应用.方法 构建了HCV诊断抗原与链亲和素融合蛋白重组表达质粒pET-11d-C44P-SA,在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,并用Western Blot进行鉴定,表达的融合蛋白经镍金属螯合（Ni-NTA）层析柱进行纯化,透析复性后分别包被生物素化以及普通酶联板,进行人血清抗-HCV检测.结果 成功构建了带有SA标签的重组表达质粒,其在大肠埃希菌BL21（DE3）中实现高效表达,制备的融合蛋白纯度可达90%以上.建立ELISA法进行人血清抗-HCV检测显示：融合蛋白包被生物素化酶联板检测灵敏度与特异性明显高于普通酶联板.结论 构建的融合蛋白作为包被抗原,结合利用SA标签与生物素化酶联板,明显提高了抗-HCV检出的灵敏度与特异性,该策略为进一步提高抗-HCV检测试剂的质量打下了基础.     

山东烟台地区HCV感染的基因分型研究

目的 了解山东烟台地区丙型肝炎病毒的基因分型,结合受试者的肝功能指标观察基因型别与肝损情况是否相关.方法 采用特异性PCR引物对HCV RNA5'UTR区和(或)NS5B区进行扩增,PCR产物进行序列分析,通过与GenBank中参考序列的比对,联合遗传进化树对标本予以分型.结果 9例无偿献血员中检出1b和3a两种基因亚型,分别为8例和1例.33例丙肝患者中,检出1b、2a和6a三种基因亚型,分别为22(66.7％)、10(30.3％)和1(3.03％)例.1b亚型是烟台地区HCV携带者的优势流行基因亚型,在不同人群中分布差异无统计学意义(x2=0.796,P=0.373);不同基因分型的受试者其肝损指标的差异有统计学意义(P＜0.05),2a型携带者的ALT、AST均值明显高于1b型.结论 山东烟台地区HCV基因型呈现多样性,以1b为主,并首次检出3a和6a亚型.HCV基因型与肝损指标具有相关性,2a型HCV感染可能在肝细胞的病变过程中起着重要作用.     

HBV与HCV融合基因免疫的抗肿瘤作用研究

目的 :观察基因疫苗SpcDNA3.1、CpcDNA3.1及融合基因疫苗CSpcDNA3.1诱导BALB c小鼠 (H 2 d)的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达HBsAg和HCcAg的小鼠肥大细胞瘤P815细胞 (H 2 d)接种动物后成瘤性的影响。方法 :3种重组质粒SpcDNA3.1、CpcDNA3 1和CSpcDNA3 1分别肌注免疫小鼠 ,3w后背部皮下接种质粒CSpcDNA3 1转染的P815细胞 ,观察小鼠成瘤和存活时间。LDH法检测免疫小鼠的脾淋巴细胞CTL活性。结果 :融合质粒CSpcDNA3 1可显著抑制肿瘤出现和生长 ,小鼠生存时间明显延长 ,生存率提高 ,CSpcDNA3 1免疫的小鼠脾淋巴细胞体外对转染的P815肿瘤细胞有明显的杀伤作用。结论 :融合基因疫苗CSpcDNA3 1免疫的小鼠能诱发特异性抗肿瘤细胞免疫。     

HCV慢性感染的分子免疫学机制研究进展

丙型肝炎因其所具有的较高的慢性化程度而成为威胁人类健康的重要疾病。近年来报道了很多丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus,HCV)的转基因动物模型及细胞模型,这些研究为探讨HCV慢性化机制提供了一定的基础。该文主要讨论HCV慢性感染的分子免疫学机制,包括由于基因突变导致的免疫逃避及HCV蛋白影响机体免疫功能的机制。     

广州地区HBV/HCV重叠感染患者流行及临床特征研究

目的 探讨广州地区乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒（HBV/HCV）重叠感染患者的流行及临床特征,为提高其诊治提供依据.方法 回顾2005年4月至2011年10月我院收治慢性HBV感染患者临床资料,分析HBV/HCV重叠感染患者流行特征,按照HBeAg状态以及HBV DNA、HCV RNA水平分组分析HBV/HCV重叠感染患者临床特征.结果 HBV/HCV重叠感染率为1.9％（128/6604）,主要见于伴静脉吸毒史的男性中年患者.HBeAg阳性与阴性重叠感染患者之间的生化指标和终末期肝病发生率均无差异.HBeAg阳性患者HBV DNA阳性率高于阴性患者（P ＜0.001）,而HCV RNA水平阳性率低于阴性患者（P =0.007）.HBV DNA阳性患者终末期肝病发生率较阴性组升高（58.1％比37.9％,P=0.027）,而HCV RNA阳性与阴性患者之间发生率相似（43.6％比49.2％,P=0.540）.结论 广州地区HBV/HCV重叠感染率较低,HBV DNA水平可能与患者的疾病进展相关.     

抗-HCV阳性无病毒血症患者HCV特异性免疫反应研究

目的　研究抗HCV阳性无病毒血症患者特异的体液及细胞免疫状态。方法　对 15例抗HCV阳性无病毒血症患者 ,15例慢性HCV持续感染者及 15例正常对照者进行研究 ,通过MTT、LDH释放法、酶联免疫等方法观察患者外周T细胞反应、自然杀伤 (NK)细胞活性、细胞因子分泌及特异性体液免疫反应。结果　无病毒血症者T细胞增殖反应明显大于持续感染者及对照组 ,并且T细胞对核心区抗原增殖最大 ,NS3次之 ,对NS5则无明显增值。而NK细胞活性较持续感染者及对照组稍高 ,但无统计学差异。此外我们观察了患者抗HCV抗体产生 ,发现无病毒血症患者与持续感染者抗 -HCV抗体产生无明显统计学差异。还观察到在无病毒血症组抗原刺激后产生IFN明显高于持续感染组 ,两组在无抗原刺激下IFN产生水平均极低下。结论　抗HCV阳性无病毒血症患者 ,其T细胞免疫及抗体的产生均高于持续感染者 ,这可能在病毒的清除中起一定作用 ,而免疫反应在慢性HCV感染中的作用及机制 ,尚需进一步研究     

HIV／HCV共感染者NK细胞数量和功能的研究

目的 研究HIV/HCV共感染者的NK细胞数量和功能的变化,探讨HIV/HCV共感染对NK细胞的影响。方法 应用流式细胞术（FCM）检测HIV/HCV共感染者（n=18）、单纯HIV感染者（n=20）、单纯HCV感染者（n=30）及健康对照（n=18）的NK细胞数量,用PMA和K562细胞刺激外周血单个核细胞（PBMC）、流式细胞术检测NK细胞分泌IFN-γ的能力,并用流式细胞毒性分析法检测NK细胞对K562细胞的杀伤效率,对各组NK细胞的功能进行分析和比较。结果 HIV/HCV共感染者、单纯HIV感染者、单纯HCV感染者的NK细胞频率、NK细胞分泌IFN-γ的能力以及对K562细胞的杀伤能力都显著低于健康对照;HIV/HCV共感染者的NK细胞绝对值和对K562细胞杀伤能力显著低于HIV和HCV单纯感染者。结论 HIV/HCV共感染对NK细胞数量和功能的影响较单纯HIV和HCV感染更加严重。     

同个体中HCV高变区1序列变异的研究

ＨＣＶ高变区１ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｏｎｅＨＶＲ１基因变异可能与病毒逃避宿主免疫选择作用有关,是病毒在体内持续存在及ＨＣＶ感染易慢性化的重要原因之一１。近年来研究发现,ＨＶＲ１基因可能对ＨＣＶ的免疫预防有重要作用２,３。为此,我们选择了长期、多次进行血液透析的ＨＣＶ感染者作为研究对象,动态观察了ＨＶＲ１的序列变异。以研究其变异极其规律有重要意义。１材料和方法研究对象：血透析患者的血清,由上海医科大学附属中山医院血液透析中心提供。引物设计、ＨＣＶＲＮＡ的提取、逆转录巢式ＰＣＲ、ＤＮ…     

HCV核心蛋白与HBV X蛋白协同反式激活作用的研究

目的：探讨HCV核心蛋白与HBV X蛋白的协同反式激活作用。方法：构建表达HCV核心蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)core和表达HBV X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)X；转染HepG2细胞，从转录和翻译水平鉴定病毒基因的瞬时表达；与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞，检测β－半乳糖苷酶表达活性，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子／增强子功能的影响。结果：构建成HCV核心蛋白及HBV X蛋白的重组表达载体pcDNA3.1(-)core、pcDNA3.1(-)X；在HepG2细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白；单独共转染试验中pcDNA3.1(-)core、pcDNA3.1(-)X组的β－半乳糖苷酶的表达分别是对照的4.9、3.5倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照的9倍；表达质粒对β－半乳糖苷酶表达的激活作用呈剂量依赖性。结论：HepG2细胞中表达的HCV核心蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子／增强子的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本试验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病／癌机制。     

采用TaqMan MGB探针定量检测HCV 1b基因型C区氨基酸70变异

目的 建立一种定量检测HCV 1b基因型C区氨基酸70位点主要野生株（Arg-CGG,70w）和变异株（GIn-CAG,70M）的方法.方法 设计一对分别针对70 W和70 M的TaqMan MGB探针,建立一种实时逆转录聚合酶链反应定量检测方法.验证方法的敏感性、特异性和准确性.结果 所设计的引物和探针具有良好的特异性,敏感性可达5拷贝/反应.进一步的克隆测序证实了新方法的可靠性.结论 建立了一套HCV 1b亚型C区氨基酸70变异的定量检测系统,具有较高的敏感性、特异性和准确性,为研究70 W和70 M在抗病毒治疗中的动态变化提供了技术手段.     

慢性丙型肝炎患者HCV HVR1准种异质性与干扰素疗效关系的研究

目的：研究HCV HVR1准种异质性与干扰素疗效以及与HCV RNA载量之间的关系，为临床选择应用干扰素抗病毒治疗适应症及预测疗效提供理论依据。方法：采用核苷酸序列测定法进行HCV基因分型；分别采用单链构象多态性聚合酶链反应法（SSCP）及克隆测序法进行HVR1准种异质性检测；采用荧光特异性PCR法进行HCV RNA载量检测。结果：14例1b型慢性丙肝患者干扰素治疗前5例为SSCP低复杂性（SSCP条带数≤3），9例为高复杂性（SSCP条带数＞3），干扰素治疗应答组SSCP条带数明显少于无应答组。1b型患者中无应答组HVR1变异株的数目（准种数）和基因的差异性（每个基因位点的平均变异率）均明显高于应答组。HVR1准种异质性程度与HCV RNA含量无正相关关系。结论：感染HCV基因型1b型的慢性丙型肝炎患者HVR1准种异质性程度越高对干扰素无应答的可能性越大。HVR1准种的复杂性程度与HCV RNA含量无关，是预测干扰素疗效的一个独立因素。     

HIV/HCV共感染者自然杀伤细胞表面活化性与抑制性受体表达的研究

目的 比较HIV/HCV共感染、单纯HCV感染、单纯HIV感染者和健康人自然杀伤细胞（NK）数量及其表面受体的变化,了解HIV/HCV共感染者NK细胞表面活化性与抑制性受体表达特点.方法 采用流式细胞术对24例HIV/HCV共感染者,28例单纯HCV感染者,21例单纯HIV感染者外周血NK细胞数量与其表面活化与抑制性受体进行检测并与20例健康人进行比较分析.结果 HIV/HCV共感染组NK细胞绝对值较其他3组显著减少;共感染组、单纯HIV感染组、单纯HCV感染组NK细胞上NKP30和NKP46的表达频率都显著低于健康对照组,但NKP30的频率在前3组之间差异无统计学意义.共感染组和单纯HIV感染组的NKP46表达频率都显著低于HCV单纯感染组,而前2组之间差异无统计学意义;共感染组和单纯HCV感染组的NKG2A表达频率显著高于健康对照组和单纯HIV感染组,而前2组之间差异无统计学意义,但单纯HIV感染组NKG2A表达频率显著低于健康对照组;NK细胞NKG2D、CD158a和CD158b的表达频率在各组间差异无统计学意义.结论 HIV/HCV共感染者NK细胞绝对值明显降低,其表面活化性受体表达减少,某些抑制受体表达增加,甚至高于单纯HIV感染者,HIV/HCV共感染者NK细胞受损更加严重.     

抗一HCV阳性无病毒血症患者HCV特异性免疫反应研究

目的 研究抗ＨＣＶ阳性无病毒血症患者特异的体流及细胞免疫状态。方法 对１５例抗ＨＣＶ阳性无病毒血症患者,１５例慢性ＨＣＶ持续感染者及１５例正常对照者进行研究。通过ＭＴＴ、ＬＤＨ释放法、酶联免疫等方法观察患者外周Ｔ细胞反应、自然杀伤（ＮＫ）细胞活性、细胞因子分泌及特异性体液免疫反应。结果 无病毒血症者Ｔ细胞增殖反应明显大于持续感染者及对照组,并且Ｔ细胞对核心区抗原增殖最大,ＮＳ３次之,对ＮＳ５则无明     

两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）包膜基因E1E2,对核心基因CDNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用。方法：构建包含HCVC或CE1E2基因片段的真有达载体pHCV-C和pHCV-CE1E2,分别接种于Balb/c小鼠股四头肌（以空载体pcDNA3作为对照）,每间隔2wk l次,用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCVC特异性抗体的产生。以pHCV-C转染并表达HCcAg r S p2/0细胞为靶细胞,采用^51Cr翻译放试验检测特异性CTL的杀伤作用。结果,两个实验免疫的20只小鼠均产生抗HCV C特异性抗体,当前／靶细胞比例为100：1时,CTL的杀伤率均明显高于对照组（P＜0．01）;pHCV-CE1E2与pHCV-C组之间,无论是抗HCV C抗体的滴度还是CTL的杀伤率均无显著性差异（P＞0．05）。结论E1E2基因的加入,并没有增加HCV C基因DNA疫苗诱导的抗HCcAg特异性抗体的滴度和CTL的杀伤作用。     

湖北地区119例 HCV 1b 型 NS3丝氨酸蛋白酶区的序列变异研究

目的：分析丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)1b 型非结构蛋白3(non-structure protein 3, NS3)丝氨酸蛋白酶区序列的变异规律及影响意义。方法使用基因型别特异性引物,通过巢式 PCR 的方法扩增119例慢性 HCV 1b 型患者血清中 HCV NS3区。对 PCR 产物进行测序后获得 NS3区核苷酸及氨基酸序列。分析119例 HCV 1b 型 NS3区序列的同源性及种系进化,分析 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异情况及重要功能位点的突变情况。结果湖北地区 HCV 1b 型与 HCV 1b 型标准株及亚洲地区序列同源性较高,核苷酸序列同源性为85.94％及87.68％,氨基酸序列同源性可达96.83％及92.39％,而与欧美地区1b 型同源性较低,核苷酸序列同源性均为85.57％,氨基酸序列同源性分别为92.17％及93.38％。进化树分析提示湖北地区序列与中国其他地区序列亲缘性较接近,而与日本、东南亚地区及欧美地区的1b 型亲缘性较远。 NS3丝氨酸蛋白酶区185个氨基酸内有34个位点有氨基酸突变,但其重要的功能区包括催化酶底物特异性结合位点以及 Zn2﹢结合位点在所有序列中均高度保守,无一例发生突变。结论对湖北地区 HCV 1b型 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异规律及生物学意义的研究进一步丰富和完善了对 HCV 1b 型基因组变异情况的认识。为了解 HCV1b 型在中国地区的进化过程提供一定理论基础。     

1月龄Balb/c小鼠胸腺、脾脏、肝脏、小肠和血液TRBV-TRBJ1-1 CDR3谱型分析

目的初步分析1月龄Balb/c小鼠胸腺、脾脏、肝脏、小肠和血液中TRBV-TRBJ1-1 CDR3谱型特征。方法提取1月龄Balb/c小鼠胸腺、脾脏、肝脏、小肠和血液样本的总RNA,逆转录成cDNA,以22条TRBV基因家族为上游引物,共同的TRBJ1-1基因为下游引物(荧光标记),PCR扩增包含完整CDR3区片断,毛细管电泳激光DNA扫描技术分析CDR3谱型的长度和多态性。结果胸腺样本毛细管电泳激光扫描图呈现标准的中间高两端低的多态性分布;各家族CDR3区最长和最短比较,多数为相差8～15个氨基酸的谱型分布。脾脏、肝脏、小肠、血液样本扫描图显示多数家族呈多态性分布,但均出现数量不等的单峰、寡峰、偏峰、低峰;多数家族表现为相差3～13个氨基酸的谱型分布,部分家族在预测大小位置无对应峰型。结论 1月龄Balb/c小鼠胸腺中基本包含TCR基因随机重排的多种克隆性T细胞;脾脏、肝脏、小肠、血液表现为单、寡、多克隆形式的T细胞分布,部分家族T细胞缺失,本实验结果可为进一步研究Balb/c小鼠的T细胞发育、分布、应答及CDR3谱型与疾病关系提供方法和基础。