多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞

背景：椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大。目的：探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法。方法：取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较。结果与结论：椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别。说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定。     

多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞

背景:椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大.目的:探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法.方法:取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较.结果与结论:椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别.说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定.     

不同代次免髓核细胞的形态学特征和生物学性状

背景：椎间盘退变是个慢性、复杂的过程,然而椎间盘退变其发生机制尚未完全阐明,很难自行修复。近年来研究细胞移植治疗椎间盘退行性变尚处在实验室阶段。研究髓核细胞的生物学性状可为研究椎间盘退变机制、组织工程构建椎间盘、基因治疗等提供理论依据。目的：研究兔不同代次髓核细胞的生物学特性,旨在找出合适的种子细胞去治疗椎间盘退变性疾病。方法：从新西兰大耳白兔椎间盘髓核组织中,分离并培养髓核细胞同时进行培养传代,对原代及第3,4代髓核细胞进行苏木精一伊红染色观察细胞形态学变化;甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;反转录PCR法测定Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平,观察各代髓核细胞生物学特性的变化。结果与结论：兔椎间盘髓核细胞可以在体外培养并进行传代,原代髓核细胞一般需7d左右贴壁,形状呈类圆形或多角形,原代和第3代髓核细胞都呈圆形或多角形,活力较强,苏木精-伊红染色后细胞核被染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;髓核细胞经过甲苯胺蓝染色后,胞浆内呈现天蓝色,通过Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后,胞浆内表现为黄褐色沉淀。到第4代细胞出现退变,Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平较前几代细胞显著下降。前3代的髓核细胞代谢旺盛,表型一致,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达正常,传第4代后髓核细胞开始出现衰老、退变。     

三维共培养免髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞分化

背景:在椎间盘组织工程研究领域,种子细胞主要有髓核细胞与骨髓间充质干细胞.髓核细胞来源有限,取材不便,增殖能力差,体外培养困难.目的:利用海藻酸盐微球模拟的三维环境下,将兔髓核细胞与骨髓间充质干细胞共培养,观察骨髓间充质干细胞的分化情况.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料;4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,应用Ⅱ型胶原酶消化法及贴壁法分离培养兔椎间盘髓核细胞.取传至第3代骨髓间充质干细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选后,分为2组:单独培养组将转染后的骨髓间充质干细胞单独培养,共培养组将其与髓核细胞按1:1比例于海藻酸盐凝胶微球中进行共培养.共培养14 d后,溶解海藻酸盐凝胶珠,通过流式分选收集骨髓间充质干细胞.主要观察指标:利用RT-PCR法和Westernblot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达.结果:共培养14 d后,共培养组有Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA及蛋白的表达,而单独培养组均呈阴性表达.结论:通过三维共培养,兔椎间盘髓核细胞能够在体外诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞方向分化.     

原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞

背景：髓核细胞在体外培养过程中存在表型丢失问题,包括Ⅱ型胶原、aggrecan、Sox-9等表达的下降,由类软骨细胞向类纤维样细胞转化。目的：体外原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞。方法：经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar大鼠椎间盘髓核组织,第1,2代细胞传代时采用差速贴壁法分离纯化髓核细胞。结果与结论：分离纯化后的第3代髓核细胞呈圆形或多角形,活力强,苏木精-伊红染色细胞核染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性细胞比例为97%;aggrecan免疫组织化学染色阳性细胞比例为95%;扫描电镜可见细胞内有高尔基体、粗面内质网和游离核糖体,未见线粒体,可见少量板层小体;CCK-8生长曲线显示细胞经过2d的生长潜伏期,3d的指数生长期,进入生长停滞期。说明原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致。     

原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞

背景:髓核细胞在体外培养过程中存在表型丢失问题,包括Ⅱ型胶原、aggrecan、Sox-9 等表达的下降,由类软骨细胞向类纤维样细胞转化.目的:体外原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞.方法:经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar 大鼠椎间盘髓核组织,第1,2 代细胞传代时采用差速贴壁法分离纯化髓核细胞.结果与结论:分离纯化后的第3 代髓核细胞呈圆形或多角形,活力强,苏木精-伊红染色细胞核染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性细胞比例为97%;aggrecan 免疫组织化学染色阳性细胞比例为95%;扫描电镜可见细胞内有高尔基体、粗面内质网和游离核糖体,未见线粒体,可见少量板层小体;CCK-8 生长曲线显示细胞经过2d 的生长潜伏期,3d 的指数生长期,进入生长停滞期.说明原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致.     

地塞米松可影响兔髓核细胞增殖及Ⅱ型胶原的表达

背景:地塞米松是细胞增殖的一种常用药物,但能否促进髓核细胞增殖呢?目的:观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞分泌Ⅱ型胶原的影响。方法:无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7d,加入塞米松浓度分别为1,10,100,1000,10000nmol/L,培养1~5d每日MTT常规测一组490nm处的吸光值并制定生长曲线。另选取最佳作用浓度100nmol/L地塞米松加入髓核细胞进行培养,以不加于地塞米松为对照。结果与结论:MTT检测结果表明地塞米松对兔髓核细胞增殖有促进作用,最佳作用浓度为100nmol/L,最佳作用时间为48h;RT-PCR检测结果表明经地塞米松处理的髓核细胞其Ⅱ型胶原表达明显较对照组高(P<0.05)。提示地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内Ⅱ型胶原表达增高。     

共同培养骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响

目的:针对椎间盘退行性变的组织修复目前集中于细胞移植治疗,实验在体外联合培养条件下观察骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响。方法:实验于2005-12/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院卫生部重点实验室进行。①实验方法:4月龄健康新西兰大耳白兔3只,麻醉后于髂嵴处作骨髓腔穿刺,抽吸6mL骨髓,分离骨髓基质干细胞;相同实验兔抽取骨髓后立即处死,取腰骶部脊柱之椎间盘,切开纤维环,取出髓核组织,分离椎间盘髓核细胞,同时设立单独髓核细胞培养组。②实验评估:在相同的培养条件下,定期观察两组髓核细胞在光镜下形态学变化及电镜下细胞超微结构的改变;于诱导培养7,14d通过RT-PCR法、Western blot法和免疫组化法法检测两组髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达。结果:①髓核细胞大体形态学及超微结构变化:髓核细胞与骨髓基质干细胞共同培养后,髓核细胞很快就呈现为圆形或多角形,且细胞形体变大、折光性好,贴壁时间早,数量增殖快,超微结构细胞表面可见许多短而粗的微绒毛突起,胞质内有大量扩张的粗面内质网、丰富的线粒体和高尔基体,细胞合成代谢旺盛。单独培养的髓核细胞胞体小,贴壁、增殖慢,细胞器不丰富。②髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白与聚集蛋白聚糖检测结果:RT-PCR和Western blot检测显示诱导培养7,14d骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组的Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖条带均明显亮于单独髓核细胞培养组,吸光度值比较差异有显著性意义(P<0.01)。免疫组化检测显示骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组中Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖在细胞胞浆中的表达随时间延长而逐渐增加,2周达到高峰,单独髓核细胞培养组中此两种蛋白表达很低,且培养第7,14天无明显变化。结论:骨髓基质干细胞在体外与髓核细胞共同培养时,能激活髓核细胞并促进其增殖分化,增加髓核细胞外基质的合成。提示骨髓基质干细胞与髓核细胞联合培养有利于退变椎间盘的髓核细胞修复、再生。     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景：椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础。目的：观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性。方法：分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平。结果与结论：体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变。对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势。     

成年兔关节软骨创伤模型中软骨细胞的分离及体外培养观察

目的观察成年兔关节软骨损伤模型中能获得的关节软骨和软骨细胞数量,探讨不同浓度的Ⅱ型胶原酶在不同时间段分离软骨细胞的能力及体外培养所获得的软骨细胞的生物学活性。方法建立成年兔关节软骨损伤模型,用0.1%~0.2%Ⅱ型胶原酶消化4小时,每小时收集消化下来的兔膝关节软骨细胞,计数细胞收获率和细胞存活率。体外培养原代及传代细胞,观察细胞形态和生长规律,绘制生长曲线,检测细胞合成Ⅰ、Ⅱ型胶原、蛋白多糖能力。结果成年兔膝关节软骨细胞的收获率平均为3603.6×104个/克,细胞存活率平均为97.3%,胶原酶浓度与细胞的获取率无显著关系,但与细胞的存活率相关,在消化时间超过3h后细胞的存活率显著降低,在培养过程中出现易老化现象,原代细胞贴壁时间为48~72h,甲苯胺蓝异染反应较强,Ⅱ型胶原免疫组化染色反应呈强阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色为阴性,传3代细胞形态由卵圆形、多角形变为梭形,甲苯胺蓝染色异染反应较弱,免疫组化Ⅰ型胶原为强阳性而Ⅱ型胶原表达极弱。结论0.1~0.2%Ⅱ型胶原酶消化、分批收取细胞具有较高的细胞收获率和存活率,体外培养时,从创伤后关节软骨中获得的原代细胞和1代细胞具有良好的软骨表型,第3代及以后的细胞生物学活性低下。     

正常与退变髓核细胞形态学及Ⅱ型胶原蛋白的定量分析

背景：椎间盘退变导致椎间隙狭窄的主要变化是髓核细胞表达软骨特异性基因产物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的减少。 目的：对成人的正常与退变椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色及番红O染色进行定量观察比较。 方法：取成人脊柱侧弯患者与椎间盘突出症患者自愿者术中取出的废弃髓核组织各3例,经培养后每个患者各测量26个细胞,正常组和退变组分别测量78个细胞。对正常与退变椎间盘髓核细胞进行番红“O”染色并行灰度及测定细胞内Ⅱ型胶原蛋白行免疫荧光染色定量测定。 结果与结论：免疫荧光染色显示：退变椎间盘髓核细胞仅轻度染色,染色模糊,其呈类圆形,纺锤形,梭形及不规则形,其内仅有极少量荧光颗粒;Ⅱ型胶原表达较正常髓核细胞降低显著（P〈0.05）。番红O染色显示：退变的髓核细胞肿胀,细胞核肿胀染色略淡,细胞突起延长,胞浆染色不匀伴有空泡,部分细胞崩解,细胞分布零散,混乱,可见成片坏死区。与正常髓核细胞图像灰度值相比差异无显著性意义（P〉0.05）。结果表明退变的椎间盘髓核细胞减少、部分凋亡,其细胞内Ⅱ型胶原蛋白含量较正常髓核细胞显著减少。     

骨髓间充质干细胞移植治疗颞下颌关节骨关节病

背景：随着干细胞技术的发展,利用组织工程技术修复软骨损伤成为一种可能,而骨髓间充质干细胞由于其优良的特性成为研究重点.目的：通过体外培养骨髓间充质干细胞,注入兔颞下颌关节紊乱病动物模型,观察干细胞对兔颞下颌关节紊乱病的治疗效果.方法：通过体外全血贴壁法培养骨髓间充质干细胞并进行鉴定;细胞在体外扩增,诱导成软骨细胞后待用.以Ⅱ型胶原酶进行颞下颌关节腔内注射,建立颞下颌关节紊乱病动物模型,关节腔内注射诱导后成软骨细胞设为实验组,对照组注射未进行诱导的细胞进行比较,通过观察动物咀嚼和组织切片观察治疗效果.结果与结论：实验分离的细胞7-14 d可见少量集落形成,20 d时观察见细胞基本铺满瓶底.经stro-1＋、CD44＋流式细胞及免疫组化测定细胞表达间充质干细胞特性;细胞在诱导成软骨细胞后Ⅱ型胶原免疫组化染色强阳性.兔颞下颌关节注射胶原酶可在2周时出现偏侧咀嚼症状,骨髓间充质干细胞诱导的成软骨细胞关节腔注入动物模型后,实验组明显弱于对照组.组织切片显示诱导的成软骨细胞可促进关节损伤的修复,软骨及胶原生成多于对照组.说明骨髓间充质诱导的成软骨细胞关节腔注入后可促进兔颞下颌关节骨关节病愈合.     

大鼠来源滑膜间充质干细胞的成软骨分化

背景：相比其他组织来源的间充质干细胞,滑膜间充质干细胞有着较强的成软骨特性和克隆能力,因此将是软骨组织工程中最有前景的种子细胞之一。 目的：培养及体外扩增 SD 大鼠滑膜间充质干细胞,鉴定其多向分化潜能及在添加生长因子后三维立体培养条件下的成软骨能力。 方法：无菌条件下获取SD大鼠滑膜组织,Ⅰ型胶原酶消化法分离大鼠滑膜间充质干细胞。体外扩增、培养,取第3代滑膜间充质干细胞进行吉姆萨、生长曲线测定、成脂诱导、成骨诱导和三维条件下成软骨诱导,成软骨诱导21 d后通过甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR对成软骨诱导后产物进行检测。 结果与结论：获取的大鼠滑膜细胞具有间充质干细胞的特性,滑膜间充质干细胞在体外培养呈成纤维样形态,并维持着多向分化的能力。使用生长因子诱导软骨细胞21 d后,可见软骨样组织,蛋白聚糖和Ⅱ型胶原可以在甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色后被检测到。RT-PCR 检测结果显示软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA呈阳性表达。提示大鼠来源的滑膜间充质干细胞具有成软骨能力。     

颈椎不稳对邻近节段椎间盘蛋白多糖及II型胶原的影响

背景：颈椎行减压融合内固定术后邻近节段椎间盘加速退变,单个节段不稳是否也会加速邻近节段椎间盘退变还不清楚。目的：研究颈椎不稳动物模型邻近节段椎间盘形态学、蛋白多糖及Ⅱ型胶原的变化。方法：16只新西兰大白兔,随机分为实验组及对照组,每组8只。实验组通过颈椎前路穿刺破坏纤维环及抽吸C5/6髓核组织建立兔颈椎不稳动物模型,12周X射线证实退变后处死动物取材,切取C4/5椎间盘组织,从矢状面切开,取其髓核组织10 mg,间苯三酚法测定髓核中蛋白多糖的量,另取椎间盘组织制作石蜡切片后进行苏木精-伊红染色和SABC免疫组化染色观察。结果与结论：实验组 C4/5椎间盘髓核脊索细胞减少,被成纤维细胞样细胞取代,偶见圆形的软骨细胞,且椎间盘纤维环变得粗糙,排列紊乱,玻璃样变性及色素沉着,可见纤维软骨细胞,内外层纤维环之间形成裂隙。髓核中蛋白多糖的含量降低,与对照组相比差异有显著性意义。退变椎间盘髓核及纤维环中Ⅱ型胶原也较对照组明显减少。结果表明颈椎不稳可诱发邻近节段颈椎退变,表现为椎间盘发生形态学变化,蛋白多糖、Ⅱ型胶原含量下降。     

微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞及鉴定

微载体培养系统中，种子细胞在培养皿或生物反应器内悬浮的微载体表面上生长，能够在一定时间内收获大量种子细胞，可将种子细胞一微载体复合体直接植入病损部位，而不用依靠支架系统。微载体可以为同源的单层细胞的生长扩增提供足够的空间，同时能节省大量昂贵的生长因子和培养液。利用微载体生物反应器培养系统还可以较容易的进行氧气浓度和物理化学环境的调控，并监控环境中的pH值、氧饱和度、营养成分等，以得到细胞增殖和分化所需的特定环境。在培养过程中可以定期取出少量细胞进行分析而不必浪费其他的细胞。     

新型壳聚糖－胶原支架与牙周膜细胞的生物相容性

背景：目前胶原作为牙周组织工程支架材料仍具有机械强度差、降解速度快等缺点,将其与壳聚糖复合可改善上述问题。 目的：评估新型壳聚糖-胶原支架材料的体外生物相容性。 方法：通过 MTT 法评估100%,75%,50%,25%壳聚糖-胶原支架材料浸提液对人牙周膜细胞的毒性。选择第4-6代生长状态良好的人牙周膜细胞与壳聚糖-胶原支架共培养,观察细胞在支架上的生长情况,并检测与壳聚糖-胶原支架复合培养前后人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的变化。 结果与结论：新型壳聚糖-胶原支架具有双层结构,一侧表面致密,一侧表面疏松多孔。MTT 法检测不同浓度材料浸提液毒性评级为0或1级。扫描电子显微镜及组织学观察可见细胞在壳聚糖-胶原支架上增殖良好,且致密层可起屏障膜作用,阻挡细胞进入支架内部;复合培养24 h后,人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性与复合培养前无明显差异（P 〉0.05）,复合培养48,72 h后人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性高于复合培养前（P 〈0.05）。以上结果提示新型壳聚糖-胶原支架具有良好的生物相容性及屏障功能,可进一步应用于牙周组织工程的研究。