真核表达载体pcDNA3-CTLA41g的构建及体内表达

背景:CTLA-41g的制备过程比较复杂,单克隆抗体的价格比较昂贵,而且应用CTLA-41g单克隆抗体注射本身存在着血浆药物浓度不稳定的问题.目的:探讨Ctla41g表达质粒构建的可行性.设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2005/2006在中国医科大学中心实验室完成.材料:雄性Wistar大鼠10只,近交系昆明小鼠10只.方法:提取Wistar大鼠总RNA,反转录成cDNA第1链,PCR扩增CTLA4基因,将其和真核表达载体pcDNA3酶切、连接.转化感受态菌DH5α,培养后挑取刚性克隆、提取质粒,酶切鉴定重组子、测序,最后转染近交系昆明小鼠,应用Westen Blot法检测血清CTLA41g水平.主要观察指标:构建的Ctla41g表达质粒基因序是否正确以及能否在小鼠体内进行蛋白表达.结果:对含有pcDNA3-CTLA4质粒的LB菌液进行鉴定测序,目的基因片断大小为288 bp,与Genebank上公布的CTLA4序列完全一致,质粒构建正确.利用阳性脂质体载体包被pcDNA3一CTLA41g转染小鼠,有3只在第7天血清检测CTLA41g阳性,显示pcDNA3-CTLA41g能够在鼠肌细胞内表达.结论:利用基因合成和重组技术成功构建了真核表达载体pcDNA3-CTLA41g,利用脂质体法成功的将pcDNA3-CTLA41g转染到鼠肌细胞内并进行表达.     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景:阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于(-淀粉样多肽的异常.目的:构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株.方法:采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达.结果与结论:人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株.     

构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3及其在脐血CD34^＋细胞中的表达

目的：构建真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3配体,为研究Flt3配体对急性放射复合伤造血功能恢复作用提供实验物质基础.方法：实验于2003-05/09在第三军医大学劳动卫生教研室完成.先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUMVC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列（0.8kb）,两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点.然后用NheⅠ和XhoⅠ酶切鉴定;最后用脂质体转染的方法将重组质粒转入脐血CD34^＋细胞中,经过G418筛选,在荧光显微镜下观察其表达.结果：①构建了双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-FLT3.②重组质粒pIRES2-EGFP-FLT3能在脐血CD34^＋细胞中的表达,凝胶电泳和测序结果证明将FLT3 cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内,荧光显微镜下可见脐血CD34^＋细胞胞体发出绿色荧光.③转染效率为10.3%.结论：①携带标记基因的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3能稳定地转入真核细胞表达载体.②该质粒转染到分离纯化的脐血CD34^＋细胞中,并获得阳性转染细胞的克隆.     

B7-H3在急性胰腺炎大鼠血清中的表达及意义

目的观察急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）大鼠血清协同刺激分子B7家族3（B7-H3）表达水平的变化及其与肿瘤坏死因子α（TNF-α）、胰腺病理学评分的关系,探讨其在AP发病过程中的作用及意义。方法健康雄性SD大鼠30只,随机分为5组：对照组,AP模型组（分为AP6h组、AP12h组、AP24h组、AP48h组）,每组6只。酶联免疫吸附测定法测定血清B7-H3和TNF-α水平并分析两者表达水平变化的相关性;切取胰腺组织行胰腺病理学评分并分析其与B7-H3表达水平变化的相关性;全自动生化分析仪测定血清淀粉酶水平。结果AP组血清中B7-H3、TNF-α和淀粉酶水平及胰腺病理学评分均显著高于对照组（P〈0．01）。血清B7-H3与TNF-α水平和胰腺病理学评分变化均呈显著正相关（r=-0．969、0．952,均P〈0．01）。结论协同刺激分子B7-H3在AP血清中的表达水平与AP病情的严重程度有关,B7-H3可能通过影响TNF-α的产生而参与了AP的炎症反应过程。     

pEGFP-BMI-1真核表达载体的构建、鉴定及其表达

本研究构建真核表达载体pEGFP-BMI-1并观察其在HeLa细胞中的表达。将BMI-1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pEGFP-N1,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pEGFP-BMI-1真核表达载体;采用脂质体转染法,将融合基因pEGFP-BMI-1转入HeLa细胞,用荧光显微镜和Western blot检测其表达,SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。结果表明:重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入BMI-1的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFP-BMI-1的HeLa细胞中存在荧光分布;Western blot检测发现存在外源性融合蛋白BMI-1-EGFP的表达。在HeLa细胞中过表达BMI-1显著下调P16INK4a mRNA的表达为对照组的9.2%(P<0.01)。结论:成功构建了真核表达质粒pEGFPBMI-1,转染HeLa细胞后可表达融合蛋白BMI-1-EGFP。这为今后研究BMI-1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。     

构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3及其在脐血CD34+细胞中的表达

目的构建真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3配体,为研究Flt3配体对急性放射复合伤造血功能恢复作用提供实验物质基础.方法实验于2003-05/09在第三军医大学劳动卫生教研室完成.先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUMVC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列(0.8kb),两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点.然后用NheⅠ和XhoⅠ酶切鉴定;最后用脂质体转染的方法将重组质粒转入脐血CD34+细胞中,经过G418筛选,在荧光显微镜下观察其表达.结果①构建了双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-FLT3.②重组质粒pIRES2-EGFP-FLT3能在脐血CD34+细胞中的表达,凝胶电泳和测序结果证明将FLT3 cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内,荧光显微镜下可见脐血CD34+细胞胞体发出绿色荧光.③转染效率为10.3%.结论①携带标记基因的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3能稳定地转入真核细胞表达载体.②该质粒转染到分离纯化的脐血CD34+细胞中,并获得阳性转染细胞的克隆.     

共刺激分子B7-H3在肿瘤免疫中的作用

共刺激信号对T细胞抗原特异性激活是必需的,并具有启动、维持以及调节活化连锁反应的作用,决定T细胞是增殖还是抑制或转复为无反应状态以及凋亡。B7-H3作为共刺激分子家族中的新成员,通过与其受体TLT-2相互作用而在T细胞活化增殖中发挥主要作用。B7H3及其受体TLT-2在肿瘤中的表达对于研究肿瘤的发展与预后有着重要的意义。本文就B7-H3的T细胞抗原特异性激活的作用机制以及在肿瘤免疫中的作用进行综述。     

共刺激分子B7-H 3在肿瘤免疫中的作用

共刺激信号对T细胞抗原特异性激活是必需的,并具有启动、维持以及调节活化连锁反应的作用,决定T细胞是增殖还是抑制或转复为无反应状态以及凋亡.B7-H3作为共刺激分子家族中的新成员,通过与其受体TLT-2相互作用而在T细胞活化增殖中发挥主要作用.B7H3及其受体TLT-2在肿瘤中的表达对于研究肿瘤的发展与预后有着重要的意义.本文就B7-H3的T细胞抗原特异性激活的作用机制以及在肿瘤免疫中的作用进行综述.     

肺表面活性物质相关蛋白C真核表达载体的构建及体外表达

目的 克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(SP-C)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/SP-C,并检测其在体外的表达,为SP-C的批量生产提供可靠的方法.方法 提取肺癌手术患者病灶周围正常肺组织总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得SP-C cDNA序列.用NotI和XhoI内切酶双酶切SP-C cDNA序列和质粒pcDNA3.1(+),胶回收后体外连接.酶切和测序后,用脂质体包裹转染人乳腺癌细胞株MCF-7,采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测SP-C的表达.结果 能够正确克隆人SP-C基因并插入至质粒pcDNA3.1(+)中;重组质粒体外转染MCF-7细胞后可以表达SP-C蛋白.结论 采用体外重组技术,成功构建了人SP-C真核表达载体 pcDNA3.1(+)/SP-C,并能在体外表达SP-C,为下一步构建人SP-C乳腺特异表达载体,利用乳腺生物反应器大量生产SP-C奠定了基础.     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建

背景:脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。目的:拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。方法:采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoRⅠ、xhoⅠ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。结果与结论:RT-PCR产物为749bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生749bp和5446bp的片段,DNA测序证实749bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建

背景：脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。目的：拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。方法：采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoRⅠ、xhoⅠ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。结果与结论：RT-PCR产物为749bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生749bp和5446bp的片段,DNA测序证实749bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

pcDNA3.1-bFGF真核表达载体的构建及其在犬骨髓基质干细胞中的表达

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。     

人FOXC2真核表达载体的构建及稳定转染C-33A细胞系的建立

目的构建人FOXC2真核表达载体,并转染人宫颈癌C-33A细胞,建立稳定转染的细胞系。方法应用PCR方法从人FOXC2克隆中扩增其cDNA编码区序列,并将其构建于pcDNA3.1（-）真核表达载体。经PCR和测序鉴定后,利用脂质体进行宫颈癌C-33A细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达FOXC2的细胞系,通过RT-PCR及Westernblot法检测FOXC2的表达情况。结果成功构建pcDNA3.1（-）/FOXC2真核表达载体,建立稳定转染FOXC2的C-33A细胞系,并鉴定了FOXC2目的基因在C-33A细胞中的过表达。结论FOXC2真核表达载体的成功构建为进一步研究FOXC2基因在宫颈癌中的功能奠定了良好的实验基础。     

MACC1基因shRNA真核表达载体的构建及其在OVCAR-3细胞中的表达

目的:构建结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1,MACC1)小发卡RNA(small hair RNA,shRNA)的真核表达载体,观察其在卵巢癌细胞OVCAR-3中的表达。方法:设计、合成MACC1特异性shRNA序列,插入载体p-super-EGFP-I中,重组载体转染OVCAR-3,半定量RT-PCR和western blot技术检测转染前后OVCAR-3细胞中MACC1的表达。结果:成功构建MACC1shRNA真核表达载体,转染后OVCAR-3细胞中MACC1的表达受到显著抑制。结论:成功构建MACC1特异性shRNA表达载体,为进一步研究MACC1参与卵巢癌发生发展的机制奠定实验基础。     

重组pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的构建与鉴定

背景:腺病毒临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的:将人骨形态发生蛋白9的cDNA构建于pcDNA4 His/Max,得到重组真核表达载体pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9。方法:将已有的Padtrack-cmv-人骨形态发生蛋白9进行PCR扩增,电泳回收人骨形态发生蛋白9片段,将pcDNA4 His/Max用NotⅠ和KpnⅠ双酶切,得到pcDNA4His/Max酶切片段,连接人骨形态发生蛋白9和pcDNA4 His/Max片段得到重组质粒pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9,将该载体用DH5α转化,阳性克隆扩增及纯化、序列分析鉴定。结果与结论:通过PCR及序列分析证明pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的人骨形态发生蛋白9基因长度为1.3kb,与报道的人骨形态发生蛋白9全长序列一致,无突变。结果证实,实验成功构建了pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体。     

人血管生成素1真核表达载体的构建及测序

背景：血管生成素1具有抑制内皮细胞凋亡，促进血管出芽、迁徙、趋化，维持血管稳定，防止液体渗漏和减轻局部炎症等作用。应用载体携带血管生成素1基因表达血管生成素1治疗各种损伤正被广泛研究。目的：构建人血管生成素1（human angiopoietin 1,hAng-1）真核表达载体pcDNA3．1＋-hAng1。设计、时间及地点：单一样本观察。实验于2007—10／2008～03在唐都医院中心实验室完成。材料：人血管生成素1基因为中国医科大学马腾博士赠送；pcDNA3．1＋为Invitrogen公司产品；JM109感受态细胞为TAKARA公司产品。方法：血管生成素1基因片段经巢式聚合酶链反应方法扩增，血管生成素l基因片段及载体pcDNA3．1＋分别经HindⅢ Xho I双酶切，之后经T4连接酶连接，构成pcDNA3．1＋-hAng1。主要观察指标：①酶切鉴定。②合成载体测序鉴定。结果：所构建的pcDNA3．1＋-hAng1载体经HindⅢ和NXhoI酶切，TBE胶电泳可得1．5kb的hAng1片段及5．4kb的pcDNA3．1＋片段。合成载体送北京奥科测序，结果正确，与GenBank中AY121504一致。结论：利用基因重组和双酶切构建出了pcDNA3．1＋hAng1，为进一步研究其功能和活性奠定了基础。     

pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取VEGF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T/VEGF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1/VEGF真核表达质粒。结论为进一步研究利用VEGF基因修饰骨组织工程骨,促进血管再生提供实验基础。     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景:在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚.目的:课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力.设计、时间及地点:细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成.材料:人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意.健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供.方法:从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组:pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组.转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染.主要观察指标:使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况.结果:转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性.pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P<0.05或0.01).结论:实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力.