兔骨关节炎软骨细胞中caspase-3表达及其细胞凋亡的研究

[目的]观察兔骨关节炎软骨细胞中caspase-3的表达,探讨其与软骨细胞凋亡的关系.[方法]Hulth法建造兔右膝骨关节炎动物模型.造模4周后,解剖其双侧膝关节,取出关节软骨观察软骨退变情况,观测软骨细胞caspase-3的表达,检测软骨细胞凋亡.[结果]骨关节炎组软骨细胞caspase-3的表达以及软骨细胞凋亡率均高于对照组(P＜0.05).[结论]骨关节炎软骨细胞中caspase-3的高表达,与软骨细胞凋亡密切相关.     

软骨细胞凋亡与骨性关节炎

骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是人类最常见的一种关节疾病,是以关节软骨退行性变和关节周围继发性骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节病。多见于中老年人,女性多于男性。患者主要表现疼痛、僵硬等,给患者带来较大的痛苦,严重影响患者的生活质量。随着人口老龄化进程的加速,这一问题日益突出。但是,由于OA的病因和发病机制尚未完全阐明,目前还缺乏特异性的治疗手段。     

骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素

目的:近年来国外对骨关节炎的发生及发展机制有许多研究成果,骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的研究颇具新意。资料来源:应用计算机检索Medline1985-01/2004-12与骨关节炎中软骨细胞凋亡相关的文献,检索词“osteoarthritis,chondrocyte,apoptosis”并限定文献语种为English。资料选择:对资料的摘要进行阅读初审,选取包括试验组和对照组的文献,开始查找全文。纳入标准:①随机对照试验。②试验包括对照组。排除标准:①没有设立对照组的文献。②综述类文献、Meta分析、重复研究。资料提炼:共收集到111篇关于骨关节炎中软骨细胞凋亡影响因素的试验,纳入符合标准的文献35篇。排除的文献为综述类文献28篇和重复研究48篇。35篇文献多为软骨细胞体外培养有关的试验,分别对各种凋亡影响因素进行评价。资料综合:在骨关节炎患者和老年人的软骨中,由于细胞外基质成分降解或通过高级糖基化、酪氨酸亚硝基化等修饰作用破坏了正常的细胞外基质从而使软骨细胞发生炎症反应并促进其死亡。各种机械性刺激是软骨细胞功能的重要调节因素,施加机械压力的加速率也决定软骨损伤和软骨细胞死亡的类型与程度。经某些细胞因子作用的正常软骨和分离培养的软骨细胞产生高水平的NO,而NO产物又能诱导软骨细胞死亡。肿瘤坏死因子受体超家族成员与相应的死亡配体结合能激活凋亡信号通路,当存在其他前凋亡因子或缺乏某些促存活因子时肿瘤坏死因子α能诱导软骨细胞凋亡。正是由于能量代谢受损使软骨细胞对其他的致死因子变得更加敏感。在发育和骨关节疾病相关过程中,软骨细胞的死亡虽然有p53的参与,但其精确的机制有待阐明,同时没有足够的直接证据表明c-myc能够影响软骨细胞的存活或死亡。结论:骨关节炎中影响软骨细胞凋亡的因素很多,机制复杂,许多因素导致软骨细胞凋亡的通路有待进一步阐明。     

促红细胞生成素对发育期小鼠脑损伤后神经细胞凋亡和caspase-3表达的影响

目的 研究促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid,Ibo)致发育期小鼠兴奋性脑损伤后神经细胞凋亡和caspase-3表达的影响.方法 以144只健康雌性昆明小白鼠作为实验动物,其中7日龄(P7)、21日龄(p21)和42日龄(P42)小鼠各48只；再将同日龄小鼠随机(随机数字法)分为假手术组(n=16)、Ibo模型组(n=16)和EPO治疗组(n=16).采用颅内微量注射法向小鼠左侧海马注射Ibo 1μl(5μg)建立脑损伤模型.EPO治疗组小鼠海马注射Ibo后,腹腔注射5000 U/ (kg·d) EPO,连续3 d；Ibo模型组和假手术组腹腔注射等体积生理盐水.各组小鼠在建模后3d处死,Nissl染色观察小鼠海马神经细胞凋亡病理改变；双抗体夹心ABC-ELISA法检测caspase-3含量变化；分光光度法检测caspase-3活性改变.结果 光学显微镜观察结果显示,与假手术组相比,Ibo模型组小鼠海马区神经细胞发生明显变性和死亡,神经细胞数量明显减少；EPO治疗组小鼠海马区神经细胞凋亡程度较轻.Ibo模型组与假手术组相比,caspase-3含量和活性明显升高(P ＜0.05)；EPO治疗组caspase-3含量和活性的升高幅度明显低于Ibo模型组(P＜0.05).结论 Ibo致脑损伤时,脑组织caspase-3的表达增强,导致神经细胞凋亡.EPO可减轻脑损伤后神经细胞凋亡,起到脑保护的作用,其机制可能与下调caspase-3的表达有关.     

体外冲击波对兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的影响

目的:探讨体外冲击波(extracorporeal shock wave,ESW)对兔膝骨性关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞凋亡的影响.方法:18只新西兰兔,根据是否给予前交叉韧带(ACL)离断和ESW干预分为3组(n=6):空白对照组;ACL组;ESW+ACL组.ESW干预8周后,观察膝关节大体情况,并应用DAPI、TUNEL、Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术三种方法检测对软骨细胞凋亡的影响.结果:DAPI和TUNEL法观察到凋亡软骨细胞主要集中在浅表层、中间层,而Annexin Ⅴ-FITC/PI双标法显示ACL+ ESW组有(10.240±0.760)％的软骨细胞凋亡,而ACL组有(17.465±0.621)％的软骨细胞凋亡,两组差异具有统计学意义.结论:ESW可抑制兔膝OA软骨细胞凋亡,减轻对关节软骨破坏,可作为治疗OA的新途径,为临床应用ESW治疗OA提供参考.     

揉髌手法对兔膝关节软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax和Fas表达的影响

背景：现代研究证实细胞的过度凋亡加速软骨组织的退变,而手法的力学刺激对关节软骨影响的分子层面研究至今少有报道。目的：观察揉髌手法对兔膝关节软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Fas表达的作用。方法：50只新西兰兔随机等分为正常组、假手术组、模型组、手法组和针剂组,后3组建立右下肢骨内高压型膝关节骨性关节炎模型。造模1周后,手法组使用揉髌手法隔天治疗1次,每次10min,共治疗5周共17次;针剂组关节内注射玻璃酸钠液0.6mL,每周1次,共5次。结果与结论：造模后8周末取兔右膝关节内侧胫骨平台软骨组织,苏木精-伊红染色提示模型组软骨组织退变明显,软骨细胞凋亡率明显增加（P〈0.01）,胫骨平台软骨组织中Bcl-2、Bax、Fas表达率明显升高（P〈0.01）,而手法组和针剂组软骨组织退变轻微,软骨细胞凋亡率及Bax、Fas表达率较模型组降低（P〈0.01）,但胫骨平台软骨组织中Bcl-2表达升高（P〈0.01）。说明揉髌手法与关节内注射玻璃酸钠一样可以明显降低兔膝关节软骨细胞的凋亡率,其作用机制与上调Bcl-2表达,下调Bax、Fas表达有关。     

高功率微波辐射对大鼠心肌超微结构和caspase-3表达的影响

目的 探讨高功率微波（HPM）辐射后大鼠心肌超微结构和caspase-3表达的改变及其机制。方法 采用平均功率密度为2，10，50mW／cm^2的S波段HPM辐射60只Wistar雄性大鼠，应用电镜、PAS染色、免疫组织化学分析和图像分析技术，定量研究HPM辐射后大鼠心肌超微结构、糖原颗粒的改变及caspase-3表达的变化规律。结果 均率密度为10，15mW／cm^2的HPM辐射可造成大鼠心肌细胞核染色质边集、浓缩，肌原纤维排列紊乱、肌丝断裂、溶解，线粒体肿胀、主化，肌浆网扩张，糖原颗粒减少；HPM辐射后1d心肌细胞PAS阳性颗粒明显减少，28d恢复，且呈一定的剂量-效应关系；HPM辐射后1d，左心室心内膜下及肌层心肌细胞浆caspase-3表达增强（P〈0．01），28d恢复。结论 一定功率密度的HPM辐射可造成心肌细胞超微结构损伤，心肌细胞caspase-3表达增强，与HPM辐射所致心脏损伤的病理生理过程有关。     

揉髌手法对兔膝关节软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax和Fas表达的影响

背景:现代研究证实细胞的过度凋亡加速软骨组织的退变,而手法的力学刺激对关节软骨影响的分子层面研究至今少有报道.目的:观察揉髌手法对兔膝关节软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Fas 表达的作用.方法:50 只新西兰兔随机等分为正常组、假手术组、模型组、手法组和针剂组,后3 组建立右下肢骨内高压型膝关节骨性关节炎模型.造模1 周后,手法组使用揉髌手法隔天治疗1 次,每次10 min,共治疗5 周共17 次;针剂组关节内注射玻璃酸钠液0.6 mL,每周1 次,共5 次.结果与结论:造模后8 周末取兔右膝关节内侧胫骨平台软骨组织,苏木精-伊红染色提示模型组软骨组织退变明显,软骨细胞凋亡率明显增加(P < 0.01),胫骨平台软骨组织中Bcl-2、Bax、Fas 表达率明显升高(P < 0.01),而手法组和针剂组软骨组织退变轻微,软骨细胞凋亡率及Bax、Fas 表达率较模型组降低(P < 0.01),但胫骨平台软骨组织中Bcl-2 表达升高(P < 0.01).说明揉髌手法与关节内注射玻璃酸钠一样可以明显降低兔膝关节软骨细胞的凋亡率,其作用机制与上调Bcl-2表达,下调Bax、Fas 表达有关.     

稳定性骨折愈合对软骨细胞增生和凋亡的影响

目的：骨折愈合过程中骨折断端间稳定性对软骨细胞增生、分化与凋亡的影响。方法：实验于2004-04．／11在第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室完成。选择8-10周的野生型小鼠48只，分成两组，每组24只。制作小鼠胫骨不稳定模型(不稳定骨折组)和稳定模型(稳定骨折组)。于3，5，7，10，14，21d取材，每组各时间点4只。用X射线片、苏木素-伊红染色、5-溴-2脱氧尿苷染色、原位杂交等手段检测软骨细胞在整体、组织、细胞水平中软骨细胞增生、分化与凋亡的差异。5-溴-2脱氧尿苷阳性细胞为棕色的细胞核，代表正在增生期的细胞；原位杂交阳性细胞为胞浆内蓝色的颗粒，Ⅱ型胶原探针为阳性表示增殖和分化的软骨细胞，X型胶原探针为阳性表示肥大的软骨细胞。结果：48只小鼠均进入结果分析。①两组小鼠胫骨愈合X射线检测结果：骨折后第21天不稳定骨折组骨折断端间仍有较多骨痂，稳定骨折组已基本完成骨痂的重新塑性。②软骨细胞组织学观察：第21天苏木精一伊红染色可见不稳定骨折组骨折断端间软骨细胞正被成骨细胞替代，而稳定骨折组基本完成骨痂的重新塑性，与X射线结果相符合。③软骨细胞增生的检测结果：小鼠骨折后的5-溴-2脱氧尿苷染色第3，10，14天可见不稳定骨折组有大量软骨细胞增生，增生的成骨细胞并不多，而稳定骨折组增生的软骨细胞较少，被大量增生活跃的成骨细胞替代。④原位杂交检测软骨细胞标记物结果：两组骨痂中的软骨细胞在出现和消失的时间上没有明显的差别。结论：骨折断端问的稳定固定可以减慢软骨细胞的增生，加速其凋亡，但对软骨细胞的分化没有明显影响。     

膝骨关节炎脂肪垫对关节软骨细胞的影响

目的:观察人膝骨关节炎(OA)脂肪垫对正常及OA关节软骨细胞的影响。方法:24例人膝脂肪垫和膝关节软骨均由骨科手术室提供,12例为膝关节急性外伤手术患者,12例为膝OA患者行关节置换术后。切取正常及OA膝脂肪垫行苏木精-伊红染色(HE)及瘦素免疫组织化学染色;用OA膝脂肪垫制作脂肪垫培养液(FCM);于急性膝外伤手术标本的表面完整处提取正常软骨细胞,于膝OA关节置换术标本提取OA软骨细胞,分别进行体外培养并鉴定,随机分成正常组、OA组、正常+FCM组及OA+FCM组,其中正常组和OA组均加入完全高糖培养基,正常+FCM组和OA+FCM组均加入FCM,对各组细胞进行形态学观察,于第14天将各组软骨细胞予Ⅱ型胶原(COL2)免疫组化染色及油红O染色,同时应用Western blot技术检测各组软骨细胞中COL2、聚蛋白多糖(Acan)和基质金属蛋白酶(MMP-13)的表达情况。结果:(1)COL2免疫组化染色:OA组软骨细胞内的COL2免疫组化染色平均吸光度比正常组显著降低(P0.05)。与OA组相比,正常+FCM组软骨细胞内的COL2免疫组化染色平均吸光度无明显差异,而OA+FCM组显著降低(P0.05)。与正常+FCM组相比,OA+FCM组软骨细胞内的COL2免疫组化染色平均吸光度显著降低(P0.05)。(2)油红O染色:OA组软骨细胞内的油红O染色平均吸光度与正常组相比差异无统计学意义。与OA组相比,正常+FCM组和OA+FCM组软骨细胞内的油红O染色平均吸光度均有增高(P0.05),但OA+FCM组增高更为显著(P0.05)。(3)Western blot结果:OA组COL2、Acan的表达水平低于正常组(P0.05),而MMP-13的表达高于正常组(P0.05)。与OA组相比,正常+FCM组COL2、Acan和MMP-13的表达水平无明显差异;相较于正常组及正常+FCM组,OA+FCM组COL2、Acan的表达水平降低(P0.05),而MMP-13的表达水平增高(P0.05)。结论:OA膝FCM能使正常及OA软骨细胞形态上发生脂肪样变,并通过代谢途径提高软骨细胞MMP-13的表达,加速软骨细胞COL2、Acan的降解,且对OA软骨细胞的破坏更为显著。     

慢性高原病患者骨髓造血细胞凋亡及caspase-8和caspase-9表达研究

目的 探讨慢性高原病( CMS)患者骨髓造血细胞凋亡指数及caspase-8和caspase-9mRNA表达变化的意义.方法 选取18例CMS患者,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记(TUNEL)技术定量研究骨髓单个核细胞(BMMNC)凋亡指数,同时采用RT-PCR半定量方法检测BMMNC caspase-8和caspase-9 mRNA的表达.以16例骨科单纯骨折患者为对照.结果 ①CMS患者BMMNC凋亡指数[(8.51±3.35)％]明显低于对照组[(16.00±4.28)％](P＜0.01).②CMS患者caspase-8和caspase-9 mRNA的相对表达水平分别为0.28 ±0.07和0.23±0.08,对照组分别为0.45±0.09和0.41±0.09,CMS组均明显低于对照组(P值均＜0.01).③CMS患者caspase-8和caspase-9mRNA表达水平与血红蛋白浓度呈负相关(r值分别为-0.520及-0.610,P值均＜0.05),与凋亡指数均未发现明显相关性(P值均＞0.05),CMS患者凋亡指数与血红蛋白浓度呈负相关(r=-0.890,P＜0.01).结论 CMS患者BMMNC凋亡指数及caspase-8和caspase-9表达水平均降低,提示CMS患者骨髓造血细胞凋亡减少,caspase-8和caspase-9均参与CMS骨髓造血细胞凋亡异常机制.     

沉默caspase-3基因影响骨髓间充质干细胞的增殖和凋亡

背景：缺血缺氧的心肌微环境导致植入的细胞存活率低。目的：观察沉默caspase-3基因对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和体外缺血缺氧环境下凋亡的影响。方法：构建靶向caspase-3的shRNA重组慢病毒并转染骨髓间充质干细胞为转基因组,以正常细胞组和空载体组做对照,采用MTS法检测各组细胞增殖情况。建立缺血缺氧模型,real-timePCR和免疫组织化学分别检测缺血缺氧环境各组细胞的caspase-3mRNA和蛋白表达水平,应用流式细胞术检测不同缺血缺氧时间点（0,6,12,24,48h）各组细胞的凋亡率。结果与结论：重组慢病毒成功转染骨髓间充质干细胞,且细胞增殖活性升高（P〈0．05）。缺血缺氧环境下,转基因组细胞caspase-3在mRNA和蛋白表达水平相比对照组下降（P〈0．05）。沉默caspase-3能显著降低骨髓间充质干细胞的凋亡率（P〈0．05）,且随着缺血缺氧时间的延长凋亡率缓慢升高。结果提示,沉默caspase-3能加快骨髓间充质干细胞的生长速度和提高在体外缺血缺氧环境下的抗凋亡能力。     

补肾通络方对大鼠膝关节炎软骨中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3的调节

目的:观察补肾通络方对骨性关节炎大鼠模型膝关节软骨半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3表达的调节作用。方法:实验于2005-05/2006-03在上海中医药大学动物中心实验室完成。将30只雄性清洁级SD大鼠抽签随机分为正常对照组、骨关节炎模型组、补肾通络方组,每组10只。造模方法:氯胺酮经腹腔注射,麻醉后纵行切开右膝部内侧皮肤,切断内侧副韧带,打开关节腔,切除内侧半月板,切断前后交叉韧带,缝合皮肤。干预方法:正常对照组随意放养,不做处理。补肾通络方药物组成:杜仲、山萸肉、熟地黄、秦艽、寄生、独活等,由上海中医药大学脊柱病研究所提供。自造模第2周开始灌药,2次/d,连续4周。骨性关节病模型组自造模第2周开始灌服等量生理盐水。干预4周后,拉颈处死动物。电镜观察细胞微观形态,免疫组化法检测关节软骨半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3蛋白表达,阳性表达为棕黄色,主要存在于细胞浆内。用平均灰度值和平均吸光度对阳性信号进行量化。RT-PCR法检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3mRNA的表达强度。结果:30只大鼠均进入结果分析,无脱失。①半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3表达:骨性关节病模型组明显高于正常对照组,差异非常显著(平均灰度值:142.07±4.04,195.65±2.71,P<0.01;平均吸光度:0.25±0.01,0.12±0.01,P<0.01);补肾通络方组与骨性关节病模型组相比,差异非常显著[平均灰度值:167.62±2.70,142.07±4.04,P<0.01;平均吸光度:0.18±0.01,0.12±0.01,P<0.01]。②半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3mRNA表达:骨性关节病模型组明显高于正常对照组,差异非常显著(3.16±0.26,0.19±0.03,P<0.01);补肾通络方组与骨性关节病模型组相比,差异非常显著(0.41±0.05,3.16±0.26,P<0.01)。结论:补肾通络方能够下调膝骨性关节炎半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3的表达。     

补肾通络方对大鼠膝关节炎软骨中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3的调节

目的：观察补肾通络方对骨性关节炎大鼠模型膝关节软骨半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3表达的调节作用。 方法：实验于2005—05／2006—03在上海中医药大学动物中心实验室完成。将30只雄性清洁级SD大鼠抽签随机分为正常对照组、骨关节炎模型组、补肾通络方组，每组10只。造模方法：氯胺酮经腹腔注射，麻醉后纵行切开右膝部内侧皮肤，切断内侧副韧带，打开关节腔，切除内侧半月板，切断前后交叉韧带，缝合皮肤。干预方法：正常对照组随意放养，不做处理。补肾通络方药物组成；杜仲、山萸肉、熟地黄、条艽、寄生、独活等，由上海中医药大学脊柱病研究所提供。自造模第2周开始灌药，2次／d，连续4周。骨性关节病模型组自造模第2周开始灌服等量生理盐水。干预4周后，拉颈处死动物。电镜观察细胞微观形态，免疫组化法柃测关节软骨半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3蛋白表达，阳性表达为棕黄色，主要存在于细胞浆内。用平均灰度值和平均吸光度对阳性信号进行量化。RT—PCR法检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3 mRNA的表达强度。 结果：30只大鼠均进入结果分析，无脱失。①半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3表达：骨性关节病模型组明显高于正常对照组，差异非常显著（平均灰度值：142.07&;#177;4．04，195．65&;#177;2.71，P〈0．01；平均吸光度：0．25&;#177;0．01，0.12＋0．01，P〈0．01）；补肾通络方组与骨性关节病模型组相比，差异非常显著[平均灰度值：167．62&;#177;2．70，142.07&;#177;4．04，P〈0．01；平均吸光度：0．18&;#177;0．01，0．12&;#177;0．01，P〈0．o1]。②半胱氨酸天冬氨酸特异性蚤白酶3 mRNA表达：骨性关节病模型组明显高于正常对照组。差异非常显著（3．16&;#177;0．26，0．19&;#177;0．03，P〈0．01）；补肾通络方组与骨性关节病模型组相比，差异非常显著（0．41&;#177;0．05，3．16&;#177;0．26，P〈0．01）。 结论：补肾通络方能够下调膝骨性荚节炎半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3的表达。     

大鼠脑血肿周围组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达变化与尼莫地平的影响

目的:观察脑出血后血肿周围半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达,及尼莫地平对其的影响。方法:实验于2004-07在大连医科大学中心实验室进行。取120只SD雄性大鼠随机分为3组:①尼莫地平组(n=50):尾壳核注射自体股动脉血50μL复制脑出血模型,造模即刻腹腔注射尼莫地平1.6mg/kg(即8μL/g),以后每天1次。②模型组(n=50):同前造模,术后腹腔注射等量生理盐水。③假手术组(n=20):手术,但进针入尾壳核后不注血。各组分为术后6,24,48,72h、5d5个时间点。造模动物醒后进行Bederson评分,评估其行为和神经功能缺陷(0～3分,评分越高,神经功能缺陷越重,评分≥2分为造模成功)。入组动物在以上5个时间点进行Bederson评分后,麻醉状态下处死取脑,经尾壳核行冠状切片,行免疫组化测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达。结果:80只大鼠进入结果分析。①Bederson评分:模型组、尼莫地平组大鼠醒后迅速出现偏瘫,24h后评分趋于稳定,至72h之间评分最高,然后逐渐下降,5d时仍有体征。模型组、尼莫地平组各时间点评分均高于对照组(P<0.01),尼莫地平组术后48,72h评分低于模型组(P<0.05)。②血肿周围组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达:假手术组进针侧脑组织表达很少,模型组6h后即有表达,24h达高峰,持续72h后逐渐下降,5d后仅有少量表达;尼莫地平组动态变化趋势与模型组相同,但各时间点的数值均较低,尤其是术后24～72h(P<0.01)。结论:①脑出血后血肿周围组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达升高,提示其与脑出血血肿周围组织损伤有一定关系。②尼莫地平降低脑出血后血肿周围组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,从而减轻细胞凋亡程度,对神经细胞起到保护作用,降低神经功能缺陷。     

大鼠脑血肿周围组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达变化与尼莫地平的影响

目的：观察脑出血后血肿周围半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。及尼莫地平对其的影响。方法：实验于2004—07在大连医科大学中心实验室进行。取120只SD雄性大鼠随机分为3组：①尼莫地平组（n=50）：尾壳核注射自体股动脉血50μL复制脑出血模型，造模即刻腹腔注射尼莫地平1．6mg／kg（即8μL／g），以后每天1次。②模型组（n=50）：同前造模，术后腹腔注射等量生理盐水。③假手术组（n=20）：手术，但进针人尾壳核后不注血。各组分为术后6，24，48，72h、5d 5个时间点。造模动物醒后进行Bederson评分，评估其行为和神经功能缺陷（0—3分。评分越高，神经功能缺陷越重，评分≥2分为造模成功）。人组动物在以上5个时间点进行Bederson评分后，麻醉状态下处死取脑，经尾壳核行冠状切片，行免疫组化测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达。结果：80只大鼠进入结果分析。①Bederson评分：模型组、尼莫地平组大鼠醒后迅速出现偏瘫，24h后评分趋于稳定，至72h之间评分最高，然后逐渐下降，5d时仍有体征。模型组、尼莫地平组各时间点评分均高于对照组（P〈0．01），尼莫地平组术后48，72h评分低于模型组（P〈0.05）。②血肿周围组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达：假手术组进针侧脑组织表达很少，模型组6h后即有表达，24h达高峰，持续72h后逐渐下降，5d后仅有少量表达；尼莫地平组动态变化趋势与模型组相同，但各时间点的数值均较低，尤其是术后24～72h（P〈0．01）。结论：①脑出血后血肿周围组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达升高，提示其与脑出血血肿周围组织损伤有一定关系。②尼莫地平降低脑出血后血肿周围组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达，从而减轻细胞凋亡程度，对神经细胞起到保护作用，降低神经功能缺陷。     

小脑颗粒神经元细胞凋亡中caspase-8基因变化与二乙酰吗啡的影响

背景:半胱-天冬氨酸蛋白酶8(Caspase-8)是细胞凋亡过程起始的重要因子,二乙酰吗啡可致神经元细胞凋亡,其与二乙酰吗啡致小脑颗粒神经元细胞凋亡之间关系尚未见报道。目的:验证二乙酰吗啡诱导小脑颗粒神经元细胞凋亡与caspase-8基因表达情况,明确caspase-8参与二乙酰吗啡致神经元凋亡过程。方法:取出生7 d SD大鼠小脑颗粒神经元细胞进行体外培养,第7天后,以不同质量浓度的二乙酰吗啡(10,40,80,100,120 mg/L)和C-jun氨基末端激酶通路特异性抑制剂SP600125作用小脑颗粒神经元细胞24 h,并分对照组(0 mg/L二乙酰吗啡),80 mg/L二乙酰吗啡组,二乙酰吗啡+SP 600125组;采用Hoechst 33258荧光染色观察细胞形态学改变,流式细胞仪测细胞凋亡率,免疫荧光、RT-PCR及Western Blotting检测caspase-8 mR NA和蛋白表达情况。结果与结论:1施加不同质量浓度二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡,凋亡细胞出现透亮深蓝色的凋亡小体,细胞核呈现固缩、凝聚及断裂,随给药浓度增加细胞凋亡率呈现升高趋势(P<0.05)。2与对照组相比,在80 mg/L二乙酰吗啡干预时caspase-8 mR NA和蛋白表达明显明显表达(P<0.05);caspase-8 m RNA随给药浓度增加呈现升高趋势(P<0.05),二乙酰吗啡+SP600125组中caspase-8 m RNA和蛋白较80 mg/L二乙酰吗啡组明显下调(P<0.05)。结果提示caspase-8参与二乙酰吗啡致小脑颗粒神经元细胞凋亡过程,同时也是C-jun氨基末端激酶信号通路中的重要候选促凋亡因子。     

Cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖凋亡及Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响

目的研究cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的作用及对Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法体外培养的PC-3细胞应用cyclopamine处理后,通过MTT测定细胞增殖抑制情况;电镜下观察肿瘤组织形态学变化;流式细胞仪检测凋亡率;Western印迹技术检测Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白的表达变化。结果MTT法结果显示4μmol/L,8μmol/L及12μmol/L浓度的cyclopamine对PC-3细胞增殖有显著抑制作用,与对照组相比差异有显著性(P0.05或P0.01),抑制效果都随着浓度的增大及时间的增加而增强。电镜下可观察到典型的凋亡细胞;流式细胞仪检测结果表明cyclopamine诱导PC-3细胞发生凋亡;Western印迹技术的结果:经培养72h后,随着药物浓度增大,Bcl-2蛋白表达呈逐渐减少,而Bax,有活性的caspase-9蛋白表达逐渐增多。结论Cyclopamine抑制PC-3细胞增殖,在一定剂量和时间范围内呈时间、浓度依赖关系,并可诱导其凋亡。Cyclopamine诱导PC-3细胞凋亡可能通过Bcl-2,Bax,caspase-9介导。     

Sequential activation of caspase-1 and caspase-3-like proteases during apoptosis in myelodysplastic syndromes

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a group of hematopoietic disorders characterized by the concomitant presence of peripheral cytopenias and normocellular to hypercellular BM. This paradox has been proposed to be due to the presence of excessive proliferation matched by excessive intramedullary apoptosis of hematopoietic cells. When cultured in vitro MDS BM mononuclear cells (BMMC) undergo apoptosis within 4 h. We measured caspase-1-like and caspase-3-like activity in 22 MDS and 4 normal BM immediately following cell separation or after 4 h culture. When cultured in vitro, MDS BMMC demonstrated an increased apoptotic index within 4 h as measured by in situ end-labeling of fragmented DNA that was matched by a concurrent increase in caspase-3-like specific activity, and the two were significantly correlated. During the 4 h culture, a sequential activation of caspase-1-like and caspase-3-like activities was detected. Caspase-1-like specific activity was detected early and transiently at approximately 15 min, followed by a gradual increase in caspase-3-like-specific activity peaking at 2 h. When the broad-spectrum caspase inhibitor, Z-VAD.FMK, was included in the MDS BM aspirate 4 h culture, apoptosis was attenuated. We conclude that sequential activation of caspase-1-like and caspase-3-like activities may form the central biochemical pathway of apoptosis in BMMC from some MDS patients, and prevention of this process by caspase inhibitors may be of significant therapeutic value for these patients, in whom supportive care continues to be the mainstay of therapy.     

薯蓣皂苷元诱导人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞凋亡依赖caspase-3途径

目的研究薯蓣皂苷元（Diosgenin,Dio）诱导人胃低分化粘液腺癌（MGC-803）细胞死亡的机理。方法四唑蓝（MTT）比色法检测Dio对肿瘤细胞生长抑制作用;流式细胞仪检测Dio对MGC-803细胞膜Annexin V表达的影响;APO-BRDU试剂盒检测Dio对MGC-803细胞DNA的影响;酶联免疫分析仪测定Dio对MGC-803细胞caspase-3活力和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO对Dio诱导细胞死亡的影响。结果一定浓度范围内Dio对MGC-803细胞增殖有剂量、时间依赖性抑制作用;经Dio处理后Annexin V-FITC＋/PI-的凋亡细胞逐渐增多;随Dio剂量增大,DNA断裂碎片增多,凋亡细胞也逐渐增多。Dio作用细胞24 h,明显增强细胞caspase-3的活性。caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO能部分抑制MGC-803细胞的凋亡。结论 Dio通过caspase-3途径诱导人胃低分化粘液腺癌细胞凋亡。