转染细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白基因的同供体大鼠树突状细胞对胰岛移植物存活的影响

目的　探讨转染细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(转染CTLA4Ig基因)的同供体大鼠DC细胞对同种大鼠胰岛移植的影响。方法　链尿菌素(STZ) 60mg/kg体重腹腔内注射制作SD大鼠糖尿病模型,胶原酶法分离、Ficoll 40 0密度梯度离心法纯化胰岛,GM CSF +IL 4诱生培育的方法,获得高纯度的DC ,含目的基因CTLA4Ig重组腺病毒AdvCTLA4Ig ,转染同供体DC细胞,与胰岛细胞同时移植于糖尿病受体大鼠肾包膜下,免疫组织化学、Dot ELISA、逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测CTLA4Ig基因在实验组和对照组DC细胞中的表达,并检测受体大鼠的血糖浓度变化,同时观察受体存活情况。结果　实验组DC细胞有CTLA4Ig表达,而对照组DC细胞没有CTLA4Ig表达,实验组正常血糖维持时间(17.3±2 .4)d较对照组(10 .1±1.5 )d、空白对照组(8.3±1.2 )d显著延长,实验组、对照组和空白对照组受体大鼠存活天数分别为(3 4.5±3 .4)d、(14 .7±2 .3 )d和(11.2±1.4)d ,实验组高于对照组(P <0 .0 1)。结论　表达CTLA4Ig基因的DC细胞可能诱异胰岛移植免疫耐受,延长胰岛移植物的存活时间     

移植物局部转染CTLA4Ig基因对大鼠小肠移植排斥反应的预防作用

目的探讨CTLA4Ig基因在移植小肠局部转染表达及表达产物对排斥反应的预防作用。方法大鼠小肠移植前,经肠系膜上动脉给供肠灌注脂质体包裹的CTLA4IgcDNA重组质粒,术后应用组织免疫学及逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测移植小肠中CTLA4Ig转基因产物的表达,并行组织病理学检查,同时设立无CTLA4Ig基因转染的对照组。结果对照组(n=8)的移植小肠在术后7～14d全部坏死;实验组(n=18)7只受鼠的移植小肠于术后56～90d坏死,11只受鼠的移植小肠于术后90d时仍存活良好。对照组移植物组织切片见单核细胞广泛浸润,肠壁肌层及黏膜出血坏死,绒毛及隐窝结构消失;实验组存活超过90d者组织切片仅见少量单核细胞浸润,黏膜轻度增厚,但无明显的肠绒毛缩短及隐窝细胞减少等改变。组织免疫学及RTPCR结果显示,在移植后28d内移植小肠中有CTLA4Ig转基因产物的表达,但第56d及90d则检测不到其表达。结论经肠系膜上动脉体外灌注脂质体包裹的CTLA4IgcDNA重组质粒可有效转染移植小肠,CTLA4Ig基因在移植小肠局部转染对术后的排斥反应具有预防作用。     

共刺激信号阻断剂基因局部转染对大鼠移植肾存活的影响

目的　观察CTLA 4Ig基因局部转染延长移植肾存活的效能。 方法　以CTLA 4Ig基因重组腺病毒为载体 ,将CTLA 4Ig基因转入BN大鼠肾脏。以BN大鼠为供者 ,Lewis大鼠为受者 ,行同种肾移植术。用经CTLA 4Ig基因转染的供肾移植给受者为转染组 ;用未转染CTLA 4Ig基因的供肾移植给受者为对照组。观察移植肾存活时间和术后肾功能变化。结果　转染组移植肾存活 (32± 8.0 )d ,对照组移植肾存活 (8.5± 1.4 )d ,转染组存活时间明显延长 ;转染组术后血清肌酐较同期对照组明显为低。结论　CTLA 4Ig基因局部转染供肾可明显延长移植肾的存活时间。     

睾丸支持细胞与共刺激通路阻断剂对异体移植肾细胞的保护作用

目的　研究表达Fas配体 (FasL)的睾丸支持细胞与共刺激通路阻断剂细胞毒性T细胞相关抗原 4免疫球蛋白 (CTLA 4Ig)对异体移植肾细胞的保护作用 ,以提高移植肾的免疫耐受性。方法　酶消化法制备睾丸支持细胞及肾细胞。取 10 6个细胞混合移植于大鼠肾包膜下 ,实验大鼠分为 3组 :对照组 (10只 )、混合细胞移植组 (混合移植组 ,16只 )、联合CTLA 4Ig组 (CTLA组 ,10只 )。分别于术后 1、7、14、2 0d检测血清白细胞介素 2 (IL 2 )水平变化。术后 2 0d取出移植物 ,以亲和素 生物素 过氧化物酶复合物技术观察肾细胞存活状况 ;MD 2 0图像分析系统测定混合移植物灰度值 ;末端脱氧核糖核酸转移酶介导的X dUTP缺口末端标记 (TUNEL)法观察移植物中凋亡的细胞。　结果对照组无移植物存活 ;混合移植组 14只移植物存活 ,灰度值为 0 36 2± 0 0 17;CTLA组 10只移植物均存活 ,灰度值为 0 4 4 5± 0 0 2 1;混合移植组与CTLA组间灰度值差异有显著意义。术后CTLA组血清IL 2水平较混合移植组低 ,差异有显著意义 ;混合移植物中可见凋亡的淋巴细胞。　结论　异体肾细胞移植中 ,睾丸支持细胞与CTLA 4Ig对移植肾细胞具有协同保护作用。     

激活型Akt1转染大鼠胰岛联合应用细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白延长异种胰岛移植存活

目的 观察激活型Akt1基因转染大鼠胰岛对异种胰岛移植功能和存活的影响.方法 提取大鼠胰岛培养转染,AO/EB和Tunel染色检测存活和凋亡;BALB/C糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植.分4组,实验组:Akt1转染胰岛联合应用细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA-4Ig);Akt1组:移植Akt1转染的胰岛;未转染组:单纯胰岛移植,CTLA-4Ig组:单纯胰岛联合应用CTLA-4Ig;观察胰岛移植后功能存活时间和平均生存时间.结果 Akt1转染胰岛体外细胞抗凋亡生存率提高了25%;实验组移植物功能存活(32.5±6.6)d,平均生存时间(39.6±5.9)d比Akt1组(15.4±3.5)、(22.5±1.7)d和CTLA-4Ig组(18.7±4.5)、(21.7±3.5)d未转染组(4.5±2.8)、(6.8±3.1)d明显延长(P<0.05).结论 激活型Akt1转染大鼠胰岛联合应用CTLA-4Ig,可减少移植胰岛凋亡,延长异种胰岛移植物存活时间.     

小剂量环孢素A联用细胞毒T淋巴细胞A4-Ig治疗器官移植排斥反应

目的　研究小剂量环孢素A(CsA)联用细胞毒T淋巴细胞A4 Ig(CTLA4 Ig)治疗器官移植排斥反应的效果。　方法　采用Ono′s方法建立大鼠心脏移植排斥反应动物模型 ,将实验动物分为 4组。A组 :对照组 ,未给予任何治疗 ;B组 :腹腔内注射CsA ,10mg·kg-1·d-1,连续 7d ;C组 :术后第 2天 1次性注射CTLA4 Ig 10 0 μg ;D组 :术后 1～ 7d连续腹腔内注射CsA ,2mg .kg-1.d-1,术后第 2天加用CTLA4 Ig 5 0 μg。观察移植心脏存活天数及术后IL 2含量和组织学变化。　 结果　A、B、C、D 4组大鼠移植心脏存活时间分别为 ( 7 2± 0 7)、( 19 4± 2 1)、( 3 1 6± 1 8)和 ( 2 4 6± 2 1)d ,与对照组相比 ,各治疗组大鼠心脏存活时间明显延长 ,差异有显著性意义 (q =3 2 7 83 ,P <0 0 5 ) ,D组与C组相比差异无显著性意义 (q =1 86,P >0 0 5 ) ;各治疗组术后IL 2含量明显减低 ,与对照组相比差异有非常显著性意义 (q=9 82 ,P <0 0 1) ;A、B、C和D组排斥反应分级分别为Ⅳ、Ⅲ、Ⅰ和Ⅰ级。　结论　CTLA4 Ig抗排斥反应能力比CsA强 ,小剂量CsA联合使用CTLA4 Ig能增强治疗排斥反应疗效 ,两者具有正协同作用。     

CTLA4Ig和西罗莫司短期联合使用延长异种胰岛移植物的存活

目的 观察细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(CTLA4Ig)与西罗莫司(SRL)联用阻断共刺激通路对异种胰岛移植物存活的影响.方法 取C57BL/6小鼠,腹腔注射链佐星,制成糖尿病模型.采用随机单位组设计分组法将糖尿病小鼠分为7组,各组均于小鼠左肾包膜下移植SD大鼠胰岛300胰岛当量.CTLA4Ig组分别于移植当天及移植后第2、4、6天腹腔注射CTLA4Ig 0.5 mg/d;SRL组分别于移植当天及移植后第1、2天给予SRL灌胃,0.2 mg·kg-1·d-1,其后隔天用药1次,共用2周;MRI组分别于移植当天及移植后第2、4天腹腔注射仓鼠抗小鼠CD154单克隆抗体(MR1)0.5 mg/d;CTLA4Ig和SRL联用组(SRL联用组)、CTLA4Ig和MRl联用组(MR1联用组)以及CTLA4Ig、MR1和SRL联用组(三药联用组)各药物的剂量与用法同上述各组;对照组仅行胰岛移植,不予以药物.观察至移植后200 d,通过监测受者血糖水平来判断排斥反应的发生情况.记录各组移植物的存活(即无排斥反应)时间.发生排斥反应者,或未发生排斥反应、移植物存活时间＞200 d者,取移植胰岛,行HE染色及免疫荧光染色,进行组织学观察.结果 对照组移植物存活时间中位数为17 d,该组最终均发生排斥反应.SRL组、MRl组和CTLA4Ig组移植物存活时间中位数分别为34 d、98 d和77 d.均明显长于对照组(P＜0.05),三组中分别有90%(9/10)、62.5%(5/8)和83.3%(5/6)的小鼠发生排斥反应.SRL联用组移植物存活时间中位数为130 d,明显长于上述4组(P＜0.01),有50%(3/6)的小鼠发生排斥反应.MR1联用组以及三药联用组移植物存活时间中位数均＞200 d,分别有42.9%(3/7)和25%(2/8)的小鼠发生排斥反应.组织学检查结果显示,对照组发生排斥反应时,其移植胰岛破坏严重,可见大量CD4+和CD8+淋巴细胞及巨噬细胞浸润,并可见IgG、IgM和补体C3沉积.其它组发生排斥反应者的组织学改变与对照组相似.SRL联用组存活200 d的小鼠,其移植胰岛组织中未见或仅有少量炎症细胞浸润,胰岛素和胰高血糖素染色阳性,未见IgG、IgM和补体C3沉积.结论 短期联合使用CTLA4Ig和SRL能显著延长小鼠体内大鼠来源的胰岛的存活时间.     

抑制巨噬细胞对异种胰岛移植物的作用

目的　观察普伐他汀 (pravastatin)对异种胰岛移植物存活的影响。方法　将猪→小鼠胰岛移植模型分成A组 (对照组 )、B组 (CsA组 )、C组 (普伐他汀组 )、D组 (CsA +普伐他汀组 )。观察指标 :移植物存活时间、病理检查、免疫组化染色、血清NO含量及移植物IFN γmRNA的表达。结果　A、B、C和D组移植物平均存活时间分别为 (6 .2±0 .82 )d、(9.2± 1 .92 )d、(7.2± 1 .30 )d及 (1 1 .2± 1 .76)d,D组存活时间明显长于其它 3组 (P<0 .0 5) ;D组移植物浸润细胞较其它 3组少。术后第 4天 ,血清NO水平A组为 (1 0 5 .8± 1 9.3)mmol/L ,明显高于B组的 (88.2± 2 1 .4)mmol/L(P<0 .0 5)、C组的 (70 .7± 1 7.8)mmol/L(P<0 .0 1 )及D组的 (56 .3± 1 6 .4)mmol/L(P<0 .0 1 ) ,出现移植排斥时 ,C、D组的血清NO水平分别为 (83 .7± 1 0 .6)mmol/L及 (71 .3± 1 3 .8)mmol/L ,仍较A组低 (P<0 .0 5) ,B组为 (1 0 4 .7± 1 6 .3)mmol/L ,与A组比较差异无显著性意义 (P>0 .0 5)。术后第 4天血清IFN γmRNA表达 ,D组为 2 3 .5± 4 .6 ,较A组的2 8.8± 4 .8低 (P<0 .0 5) ,而B、C组与A组间差异无显著性意义 (P>0 .0 5)。结论　普伐他汀能抑制巨噬细胞活性 ,延长异种胰岛移植物存活 ,尤其与CsA联用效果更好     

CTLA4Ig基因和CD40Ig基因转染供肾对异种大鼠移植肾存活的影响

目的 探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(CTLA4Ig)基因和CD40Ig基因转染供肾对异种大鼠移植肾存活的影响.方法 以PcDNA3.1质粒为载体,通过脂质体2000将CTLA4Ig基因和CD40Ig基因转染豚鼠肾脏,再移植(异位肾移植)给SD大鼠.实验分4组进行:第1组供肾以PcDNA3.1空载体脂质体复合物转染(空载体组);第2组供肾转染CD40Ig基因(CD40Ig转染组);第3组供肾转染CTLA4Ig基因(CTLA4Ig转染组);第4组供肾同时转染CTLA4Ig基因和CD40Ig基因(双基因转染组).术后观察各组血清肌酐、移植肾组织病理改变以及移植肾存活时间.结果 空载体组、CD40Ig转染组、CTLA4Ig转染组和双基因转染组受者的存活时间分别为(6.8±1.9)d、(40.7±10.9)d、(49.3±9.5)d和(75.7±8.0)d,3个转染组明显长于空载体组(P＜0.01),其中双基因转染组移植肾存活时间最长,与其他3组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).各组术后血清肌酐水平呈上升趋势,但升高幅度以双基因转染组为最低(P＜0.01).术后第30天,CD40Ig转染组和CTLA4Ig转染组存活大鼠的移植肾组织中可见大量淋巴细胞浸润,而双基因转染组的移植肾组织中仅见少量淋巴细胞浸润.结论 供肾局部同时转染CTLA4Ig基因和CD40Ig基因可明显延长其异种移植后的存活时间.     

基因转移CTLA4-Ig和抗CD154抗体在异种胰岛移植排斥反应中的作用

目的 探讨基因转移细胞毒性T细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4-Ig)和抗T细胞分化群154(CD154)抗体在异种胰岛移植排斥反应中的作用及机理.方法 建立人-大鼠异种胰岛移植模型,用携带CTLA4-Ig基因的重组腺病毒感染移植胰岛细胞,并用抗CD154抗体进行治疗,观察糖尿病大鼠胰岛移植后血糖变化、生存情况及移植物病理形态学改变,检测移植物CTLA4-Ig、胰岛素的表达和移植大鼠白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平变化.结果 (1)糖尿病大鼠移植后2 d血糖降至正常,对照组血糖平均在移植后8 d升高,抗体治疗组、转染组和联合治疗组血糖分别在18、25和36 d升高.(2)对照组、抗体治疗组、转染组和联合治疗组的移植物存活时间分别为(10.0±2.1)d、(22.0±8.2)d、(28.0±6.5)d和(37.0±9.3)d,各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);移植大鼠生存时间分别为(21.0±5.7)d、(35.0±6.5)d、(48.0±8.5)d和(65.0 ±12.5)d,各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).(3)对照组在移植后1周内,IL-2、TNF-α的水平均急剧上升,较移植前显著升高(P＜0.01).(4)各治疗组移植物见成片的胰岛细胞团,未见淋巴细胞浸润,转染组和联合治疗组移植物可见CTLA4-Ig和胰岛素的表达.结论 基因转移CTLA4-Ig和抗CD154抗体均可抑制异种胰岛移植排斥反应,二者联合效果优于单独使用.     

利用腺病毒载体导入CTLA4Ig基因对大鼠同种心脏移植免疫抑制作用的研究

目的　探索CTLA4Ig基因在实验动物体内的表达以及对大鼠同种心脏移植后的免疫抑制作用。方法　利用腺病毒作载体 ,将CTLA4Ig基因导入同种心脏移植的受体鼠体内 ,以编码 β 半乳糖苷酶的有复制缺陷的腺病毒重组体 (Adex/LacZ)为对照 ,观察该基因在实验动物体内的表达以及对同种异体心脏移植后的免疫抑制作用。逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)法检测CTLA4Ig基因在大鼠体内的表达 ,并用流式细胞仪来测定血中CTLA4Ig蛋白质的浓度变化。 结果　导入的CT LA4Ig基因能够在大鼠肝脏中表达 ,血中CTLA4Ig的浓度明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,而且移植后心脏的存活时间显著长于对照组 (P <0 .0 1)。结论　CTLA4Ig基因能在大鼠体内良好表达并明显拮抗同种移植排斥反应     

Prevention of Acute Lung Allograft Rejection in Rat by CTLA4Ig

CTLA4 immunoglobulin (CTLA4Ig), which binds with a high affinity to B7-1 and B7-2, interrupts T-cell activation by inhibiting costimulatory signal. CTLA4Ig has been used in hopes of achieving antigen-specific tolerance induction in several solid organ transplants. In lung allograft rejection, however, its use has been controversial in terms of its effect on prevention of rejection. In the present study, the effect of murine CTLA4Ig on rat-lung allograft rejection was investigated. Rat left-lung transplantation was performed in an RT1 incompatible donor (Brown Norway; BN)-recipient (F344) combination. All allografts (n = 12) without any treatment were rejected within 7 days after transplantation. A single injection of murine form CTLA41g at a dose of 100 microg intraperitoneally (ip) or intravenously (iv) on day 1 post-transplantation achieved long-term graft survival (>90days) in 2/5 (40%) and 3/8 (38%), respectively. Moreover, 6/7 (86%) allografts in rats that received iv injection of 500 microg CTLA4Ig survived more than 90days. Allograft survival in the CTLA4Ig 500 microg iv recipient group was significantly longer than that in the no-treatment control or control immunoglobulin group (p <0.01). Four out of seven recipients bearing functional allografts for more than 90 days with the CTLA4Ig treatment accepted donor-specific skin grafts, whereas all third-party skin grafts (n=3) were rejected. Prevention of rat-lung allograft rejection could be achieved by intravenous administration of CTLA4Ig, resulting in long-term allograft survival with acceptance of donor-specific skin grafts.     

环孢素对共刺激阻断剂延长移植肾存活效应的影响

目的:探讨环孢素(CsA)对共刺激阻断剂CTLA4Ig延长移植肾存活效应的影响。方法:肾移植大鼠分为对照组(第1组)、CTLA4Ig组(第2组)、CsA CTLA4Ig组(第3组)、CTLA4Ig IL-2组(第4组)和CsA CTLA4Ig IL-2组(第5组),观察术后血肌酐(Scr)、移植肾病理改变、移植肾存活时间。结果:与第1组、第4组相比,第2组、第3组、第5组移植肾存活时间显著延长(P<0.01),其中,第3组移植肾存活时间最长(66.1±10.6)d;术后15天,第2组Scr显著低于第3组、第5组(P<0.05);术后30天,第3组、第5组Scr显著低于第2组(P<0.01);术后30天,第3组、第5组移植肾淋巴细胞浸润明显少于第2组。结论:CsA可增强CTLA4Ig延长移植肾存活的效应,对外源性IL-2逆转CTLA4Ig的效应具有抵抗作用。     

Blockade of both CD28/B7 and OX40/OX40L co-stimulatory signal pathways prolongs the survival of islet xenografts

CTLA4Ig, a recombinant fusion protein composed of the extracellular domain of human CTLA4 and the constant region of human IgG1, inhibits the interaction of CD28/B7 pathway by binding the B7 molecule. OX40Ig, a recombinant fusion protein composed of the extracellular domain of human OX40 and the constant region of human IgG1, abrogates the interaction of OX40/OX40L pathway by binding the OX40L on APCs. So blockade of CD28/B7 or OX40/OX40L co-stimulatory pathways alone in mice with CTLA4Ig or OX40Ig can result in finitely prolonging the survival of islet grafts (43.2 +/- 4.81 and 67.7 +/- 7.74 days, respectively). In this study, a novel replication-defective adenovirus containing both of the CTLA4Ig and OX40Ig genes, AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig, was constructed by homologous recombination and injected into the streptozocin-rendered diabetic BalB/c mouse recipients (H-2d) through the tail vein, at the same day, the freshly isolated islets from Lewis rats (RT-1) were transplanted under the left kidney capsule of the recipients. The results showed that the mean survival time of the islet xenografts in the AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig-treated diabetic mice was significantly prolonged (100.3 +/- 14.94 days), while those in the untreated or AdEGFP-treated mice were rejected in normal fashion (6.7 +/- 0.94 and 7.0 +/- 1.0 days, respectively). In conclusion, utilizing AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig in vivo which can simultaneously express CTLA4Ig and OX40Ig proteins can improve the survival of Lewis-->BalB/c islet xenografts.     

腺病毒介导的hCTLA4-Ig和FasL基因转移诱导大鼠同种异体肾移植长期存活的作用

目的 探讨腺病毒介导hCTLA4-Ig和FasL基因转移延长异基因大鼠肾移植物存活时间及其相关机制.方法 供、受者分别为SD系大鼠和Wistar系大鼠,建立大鼠肾移植模型.实验分为4组:对照组、空载病毒Ad-EGFP处理组、Ad-CTLA4-Ig处理组、Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL处理组.对照组不予处理,其他各组在供肾冷保存时,经供肾动脉灌注(1×10~9-5 ×10~9)PFU/ml Ad-EGFP、Ad-CTLA4-Ig、Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL.术后比较各组的存活时间、移植肾组织学、肾功能和免疫组织化学等的改变.结果 肾移植受者平均存活时间Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL处理组(64.67±6.41)d、Ad-CTLA4-Ig处理组(31.33 ±6.77)d与对照组(8.17±1.17)d,空载病毒Ad-EGFP处理组(8.00±1.55)d比较明显延长(P均＜0.01),并且Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL处理组优于Ad-CTLA4-Ig处理组(P＜0.01);对照组和空载病毒Ad-EGFP处理组术后血清肌酐浓度迅速上升,其余两组移植肾功能保持稳定.结论 Ad-CTLA4一Ig和Ad-FasL介导的基因转移能够诱导异基因肾移植物长期存活;该效应为供体特异性,与调节性T细胞和同种反应性T细胞的删除有关.