腺病毒介导的双自杀基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨直肠癌的基因治疗方法。方法 用重组腺病毒介导外源胞嘧啶脱氨酶（CD）基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因转移到人直肠癌细胞系HR－8348,通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法）,检测、分析CD和HSV－tk双自杀基因系统对肿瘤细胞的作用。结果 重组腺病毒介导的CD和HSV－tk自杀基因可在HR－8348细胞高效表达。用腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Linkl(CD tk)、Linkl(-)、pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Kinkl(tk）重组腺病毒感染HR－8348细胞,不加5－氟胞嘧啶（5－FC）、环氧鸟苷（GCV）,各组肿瘤细胞的集落形成和存活率的差异无显著性意义（P＞0．05）。应用5－FC、GCV后,pAdCMV-Linkl(CD tk)转染组细胞集落形成和存活率显著低于对照组pAdCMV-Link（－）转染组（P＜0．01）,也低于pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Linkl(tk）转染组（P＜0．05）。CD和5－FC、HSV－tk和GCV系统联合使用较单一自杀基因系统对HR－8348直肠癌细胞的集落形成、细胞生长有更显著的抑制作用,对肿瘤细胞有更强的杀伤能力和“旁观者效应”。结论 CD和HSV－tk双自杀基因联合作为肿瘤基因治疗的一种手段和方法,较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合基因体外抑瘤效果的观察

目的：构建重组腺病毒载体，观察自杀基因对不同大肠癌细胞系的细胞毒作用。方法：利用重组腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk)融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、HCT－8和直肠腺癌细胞系HR－8348，通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法），检测和分析HSV－tk／丙氧鸟苷（GCV）、CD／5－氟胞嘧啶（5－FC）双自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应的大小。结果：Western Blot检测分析融合基因的表达，显示重组腺病毒介导的双自然基因可以在3种肿瘤细胞中表达。不加5－FC和GCV时，各转染组和对照组肿瘤细胞集落形成分别为：94、93、95；96、94，比较差异无显著性（P＞0．05）。在5－FC（80．0mg/L）和GCV（0．8mg/L)浓度下3种肿瘤细胞存活率降至2．1％、4．3％和3．2％，与不同前药相比差异有显著性（P＜0．01）。感染细胞在混合细胞中比例仅仅占5％时，就能获得明显的旁观者效应，细胞杀伤率分别升至22．2％、34．8％和40．4％。结论：CD、TK融合基因联合联合双前药治疗能取得显著的抗肿瘤作用。     

KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因联合survivin基因干扰抑制肝癌细胞生长的体内研究

目的：探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统（Ad-KDRP-CD/TK）联合survivin基因干扰对肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。
　　方法：将20只裸鼠随机分均为模型组（皮下植入BEL-7402肝癌细胞成瘤,不加任何处理）、双自杀基因转染组（皮下植入转染Ad-KDRP-CD/TK的BEL-7402细胞,成瘤后瘤内注射前药更昔洛韦与5-氟胞嘧啶）、survivinsiRNA转染组（皮下注射BEL-7402肝癌细胞,成瘤后瘤内注射survivinsiRNA/Lip-DMEM转染混合物）、联合转染组（双自杀基因转染+survivinsiRNA转染处理）。治疗2周后处死各组小鼠,称取肿瘤质量,计算肿瘤抑制率,检测瘤组织微血管密度（MVD）及survivinmRNA与蛋白表达。结果：各治疗组的肿瘤质量明显小于模型组（均P<0.05）,且联合转染组的抑瘤率最大（均P<0.05）;肿瘤组织MVD、survivinmRNA与蛋白水平均明显降低,且联合转染组的降低程度最为明显（均P<0.05）。
　　结论：双自杀基因联合survivin干扰是抑制鼠肝癌细胞在体内生长的有效途径。     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染和CD/5-FC对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用重组腺病毒介导外源CD基因转移到人直肠癌细胞株HR-8348,通过检测腺病毒的转导效率,CD基因表达,以及集落形成实验,细胞存活率测定,裸鼠移植癌治疗实验,观察分析CD/5-FC对癌细胞的杀伤作用,结果 重组腺病毒介导CD基因转染,在癌细胞中得到高效表达。CD/5-FC系统对转染含CD重组腺病毒HR-8348细胞的集落形成,细胞生长均有明显的抑制作用,而对无CD基因转染癌细胞无影响,在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中,CD/5-FC除了杀伤转染CD基因的癌细胞外,对周围的无CD转染癌细胞也有明显的杀伤作用。表现出很强的“旁观者效应”。裸鼠皮下移植癌治疗实验结果表明,CD/5-FC对HR-8348实体癌生长抑制率为71.5%。结论 CD/5-FC对腺病毒介导CD基因转染的直肠癌细胞有很强的杀伤作用和显著的“旁观者效应”。     

Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为影响的研究

目的：探讨Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为的影响。方法：以正常人外周血单个核细胞（PBMC）为模板，通过RT－PCR方法扩增出Fas全长cDNA，转染人直肠癌细胞HR－8348，检测Fas基因表达，观察细胞生长状态，采用MTT法观察癌细胞对中1芗反应及细胞存活率。采用H3342释放法检测PBMC对癌细胞的杀伤活性，结果，未转染的HR－8348细胞Fas基因表达为阴性，转染Fas后HR－8348细胞Fas表达阳性，两组细胞形态和生长状态无显差异，分别加入化疗药物5－Fu、卡铂，检测细胞存活率，在相同药物浓度下，两组细胞存活率有显性差异（t=4．73，3．84，P＜0．01）。Fas转染组癌细胞存活率低不转染组，Fas表达阳性癌细胞对5－Fu、卡铂的敏感性增强。PBMC对Fas转染组HR－8348细胞的杀伤活性为56％，对未转染组的杀伤活性为21％，两组有显性差异（X^2＝20．73，P＜0．01），PBMC对Fas阳性癌细胞杀活性明显高于对照组癌细胞。结论：转染Fas可提高癌细胞化疗药的敏感性，增强药物对癌细胞的杀伤作用，并促进机体免疫细胞的杀伤活性。     

重组腺病毒介导CD自杀基因联合野生型p53基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 观察重组腺病毒介导胞嘧啶氨酶（ＣＤ）基因和人野生型ｐ５３基因共转染对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用携带ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３基因腺病毒感染直肠癌细胞ＳＷ８３７,计数瘤细胞集落数,采用四唑蓝比色（ＭＴＴ法）检测瘤细胞存活率。于６０只裸鼠移植瘤内注射重组腺病毒、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）,测定肿瘤生长抑制率。结果 用ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３重组腺病毒感染ＳＷ８３７细胞,加５－ＦＣ后细胞集落形成分别为：６、３８、６９。裸鼠移植肿瘤生长抑制率分别为７８．６％、５６．５％、２２．３％。ＣＤ／ｐ５３重组腺病毒感染组肿瘤细胞集落形成和存活率下降最显著（Ｐ〈０．０１）,对肿瘤的抑制作用明显。结论 ＣＤ自杀基因与野生型ｐ５３基因共转染对肿瘤细胞有更强的杀伤作用。     

甲胎蛋白启动子驱动的yCDglyTK双自杀基因治疗裸鼠肝癌的机制研究

目的研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内靶向性治疗肝癌的效果和机制。方法构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因表达质粒,通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721肝癌细胞的裸鼠肝癌皮下种植瘤,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果成功构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因,其靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞种植瘤上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞种植瘤上无表达,氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及两者联合可有效抑制HepG2细胞种植瘤的生长,抑瘤效果GCV＋5-FC〉5-FC〉GCV,而SMMC7721细胞种植瘤的生长未受影响。HepG2细胞种植瘤治疗后有明显的细胞凋亡,而SMMC7721细胞种植瘤内极少凋亡细胞。结论携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

腺病毒介导双自杀基因选择性杀伤血管内皮细胞

目的研究腺病毒介导的双自杀基因在KDR启动子调控下对血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法应用PCR扩增出KDR启动子序列,分别构建携带KDR启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子调控下的CD与TK的融合基因的重组腺病毒AdKDR-CDglyTK、AdCMV-CDglyTK,体外感染脐静脉血管内皮细胞系HUVEC和结直肠癌细胞系LOVO细胞,利用重组病毒携带的GFP基因,在荧光显微镜下观测重组病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV和5-氟胞嘧啶(5-FC),观测杀伤作用,比较两种启动子的转录调控特性。结果成功构建了两种重组病毒,并高效地转染了HUVEC和LOVO细胞。两种重组病毒对两种细胞的转染效率相似,并随重组病毒的感染复数MOI(multiplicityofinfection)增加而升高;以MOI=100的两种病毒分别转染的两种细胞表现出对前药的不同敏感特性:转染了AdCMV-CDglyTK的HUVEC和LOVO细胞以及转染了AdKDR-CDglyTK的HUVEC细胞,对前药的敏感性差异无显著性意义(P>0.05);转染了AdKDR-CDglyTK的LOVO细胞,对前药敏感性低,与其他3组比较,差异存在显著性意义(与其他3组两两间比较,P均<0.001)。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因在血管内皮细胞中的特异性表达,有利于实现双自杀基因靶向恶性肿瘤血管内皮细胞的抑癌疗法。     

X线联合胞嘧啶脱氨酶基因对结肠直肠肿瘤细胞的杀伤作用

目的 提高基因疗法对结肠直肠肿瘤的疗效。方法 以绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因,观察在X线作用下GFP基因对结肠直肠肿瘤细胞的转染效率及表达时间;用克隆形成试验观察X线对胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染的影响;同时用细胞存活率测定试验检测X线联合CD和5－氟胞嘧啶对结肠直肠肿瘤细胞的杀伤作用。结果 X线提高超螺旋质粒对结肠直肠肿瘤细胞的转染效率2－4倍,可提高线性质粒转染效率30倍。肿瘤细胞的存活率：转染CD基因组LoVo细胞为85％,8348细胞为88％;剂量X线联合空载体组为10％;LD90剂量X线联合CD基因组,LoVo细胞为9％,8348细胞为11％,加上X线作用,细胞总体存活率仅为1％。结论 X线联合自杀基因可有效地杀伤结肠直肠癌肿瘤细胞,可成为治疗结肠直肠肿瘤的一种全新有效的方法。     

腺病毒介导HSV-TK/CD基因对胆管癌体内体外的杀伤作用

目的　研究HSV TK /CD融合基因对胆管癌的杀伤作用。方法　腺病毒介导HSV TK /CD融合基因体外转染胆管癌细胞QBC93 9,与单自杀基因对照 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT )比色法测定肿瘤细胞生长抑制率 ,旁观者效应 ;构建胆管癌裸鼠模型 ,瘤内注射重组腺病毒 ,观察肿瘤生长情况。结果　与单一自杀基因转染组对照 ,双基因组表现出更强的抗肿瘤作用。当给予相同浓度的前体药物时 ,融合基因组 ,CD组和TK组的肿瘤细胞存活率分别为 3 .1%、3 2 .1%、5 5 .2 %。体内实验显示 ,融合基因组的肿瘤生长受到明显抑制 ,抑制率达 70 .7%。单自杀基因TK、CD组则分别为 41.2 %和 5 5 .7% ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。组织学检查可见实验组肿瘤发生明显坏死 ,这种现象在融合基因治疗组尤为明显。结论　与单自杀基因相比 ,HSV TK/CD融合基因在体内和体外都具有更强的抗肿瘤活性。     

FasL基因表达对结直肠癌细胞肝转移影响的研究

目的　探讨FasL基因表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响及在肝转移中的作用。方法　采用RT PCR方法检测大肠癌原发灶、癌旁肠黏膜、肝转移灶中FasL基因表达。用细胞转染方法 ,将FasLcDNA转染人直肠癌细胞HR 8348,采用四唑蓝法观测FasL表达对癌细胞生长抑制率及对5 FU、卡铂杀伤作用的影响。　结果　结直肠癌原发灶 (5 8例 )、癌旁肠黏膜 (5 8例 )、肝转移灶 (2 8例 )中FasL基因表达阳性率分别为 2 4 % (14 /5 8)、14 % (8/5 8)、10 0 % (2 8/2 8)。肝转移灶中FasL表达阳性率高于癌原发灶 (χ2 =4 3 4 9,P <0 0 1)和癌旁肠黏膜组织 (χ2 =5 7 6 6 ,P <0 0 1)。肝转移组原发灶FasL表达阳性率高于无肝转移组 (χ2 =3 96 ,P <0 0 5 )。转染HR 8348细胞FasL表达为阳性。用 5 FU、卡铂杀伤FasL转染细胞和未转染细胞 ,2组癌细胞生长抑制率有显著性差异 (t=9 0 2、t=11 93,P <0 0 1)。在相同化疗药物浓度下 ,FasL阳性HR 8348细胞存活率高于对照组癌细胞。　结论　FasL阳性癌细胞对化疗药物有较强的耐受性。FasL基因表达能使癌细胞逃避免疫监视和杀伤并对化疗药物产生抗性 ,促进结直肠癌发生肝转移。     

FasL基因表达对缺氧状态下直肠癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨直肠癌侵袭转移过程中FasL基因表达对细胞增殖凋亡的影响。方法采用北京军区总医院普通外科实验室构建的4组不同侵袭力的人直肠癌HR-8348细胞亚型HR-8348B、HR-8348L、HR-8348F和HR-8348As,并用化学缺氧法构建上述4组细胞的缺氧12h模型,以Western印迹法验证各组细胞内FasL蛋白的表达水平和缺氧状态下细胞内FasL蛋白的表达,流式细胞仪测定细胞周期分布并计算细胞增殖指数,四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞增殖能力改变并计算细胞抑制率,末端标记法（TUNEL）测定细胞凋亡状况。结果Western印迹显示FasL蛋白于40000处显色。常氧条件下HR-8348F细胞内FasL的表达水平显著高于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As（F=361.149。P〈0.01）;缺氧12h时各组细胞均生长良好,形态较常氧状态皱缩;HR-834F,细胞内FasL的表达水平仍显著高于其他3组（F=278.766,P〈0.01）,但其自身常氧与缺氧状态下FasL的水平差异无统计学意义（t=1.762,P〉0.05）。缺氧12h后各组细胞增殖均受到抑制,HR-8348F细胞的增殖指数（60.43±3.72）显著高于HR-8348B（40.01±3.30）、HR-8348L（41.30±4.06）和HR-8348As（35.87±4.39）（F=39.477,P〈0.01）,增殖抑制率（17.30±1.98）和凋亡指数（13.10±1.04）显著低于HR-8348B（33.70±4.33和21.60±1.31）、HR-8348L（34.20±3.92和20.10±1.15）、HR-8348As（38.00±4.55和23.90±1.23）细胞（F分别为28.811和76.462,P〈0.01）。结论缺氧环境中,直肠癌细胞FasL表达增强可导致细胞增殖加速、凋亡减少和侵袭能力增强。促进细胞对微环境缺氧的耐受。     

结直肠癌中缺氧诱导因子1-α与FasL 表达相关性的研允

目的 探讨结直肠癌侵袭转移过程中缺氧诱导因子1-α(alpha,HIF-1α)与FasL表达的相关性.方法 采用分子克隆方法,将我室已构建的FasL-pcD-NA3.1(+)质粒与pcDNA3.1(一)质粒进行重组,得到新的FasL-pcDNA3.1(一)质粒并加以鉴定;通过脂质体转染法将空质粒、FasL-pcDNA3.1(+)与FasL-pcDNA3.1(一)质粒分别转染人直肠癌HR-8348细胞,构建侵袭力不同的结直肠癌细胞HR-8348L、HR一8348F和HR一8348As,未转染细胞HR一8348B为空白对照,应用Tran-swell,小室检测各组细胞的侵袭能力;采用化学缺氧法构建四组细胞的缺氧模型,Western blot方法定量检测缺氧0h、6h、12h及24h各组细胞内HIF-1α的表达.结果 FasL-pcDNA3.1(一)质粒符合要求,FasL片段大小约900bp,测序结果正确率99.2%;单层细胞体外侵袭实验见HR一8348F细胞穿透Transwell滤膜的细胞数目为(12.930±2.434),显著多于HR-8348B(8.133±1.959)、HR-8348L(7.670±2.093)和HR-8348As(7.870±1.685)细胞(P<0.05);Western blot检测示HIF-1α蛋白于120kD处显色,缺氧0h与6h,各组样品中HIF-α仅表达微量,HIF-1α水平无显著性差异(P>0.05);缺氧12h与24h,HR一8348F细胞内HIF-1α水平较0h和6h时明显增高(P<0.05),而HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As细胞内HIF-1α表达与6h时无明显变化(P>0.05),HR-8348F细胞HIF-1α水平显著高于HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As细胞(P<0.01).结论 缺氧环境中结直肠癌细胞FasL表达增强是除低氧分压外另一个诱导HIF-1α表达增高的因素,FasL与 HIF-1α水平呈正相关,高侵袭能力的结直肠癌细胞对缺氧的适应能力加强,促进肿瘤的远处转移.     

5-氟尿嘧啶诱导直肠癌HR8348细胞凋亡作用的研究

目的　探讨 5 氟尿嘧啶 (5 fluorouracil ,5 FU )体外诱导直肠癌HR83 48细胞凋亡的作用及细胞凋亡与bcl 2、bcl xl、bax及 p5 3表达的关系。 方法　经 5 FU处理HR83 48细胞 2 4h后 ,用甲基绿 派若宁染色法和TUNEL法检测细胞凋亡情况 ,并用SP免疫组织化学法检测HR83 48细胞中bcl 2、bcl xl、bax和 p5 3的表达。 结果　HR83 48细胞经 5 FU作用 2 4h后 ,细胞凋亡指数 (AI)明显高于对照组 ,差异有显著性意义 (P<0 .0 1)。 5 FU作用不同时相bcl 2的表达评分结果与对照组比较差异均无显著性意义 ;不同时相bcl xl的表达评分结果与对照组比较稍降低 ;而bax的表达评分结果随时间延长明显增加 ,2 4h、3 6h的表达评分结果明显高于对照组 (P<0 .0 1) ,而 p5 3在 5 FU组和对照组各时相均未见表达。结论　 5 FU具有诱导HR83 48细胞凋亡的作用 ;5 FU可能通过上调bax的表达并改变bax/bcl xl的比值而诱导HR83 48细胞凋亡。     

草酸铂、5-氟尿嘧啶联合多药耐药基因反义RNA对耐药直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的应用基因克隆技术,将多药耐药基因（multidrug resistance gene,MDR1）反义RNA转染入对氟尿嘧啶（5-FU）耐药直肠癌细胞（8348R）中,封闭正义MDR1的转录和表达,联合应用草酸铂及5-FU共同作用于8348R,观察其联合杀伤作用.方法构建含MDR1反义RNA的真核表达质粒PC-MDR1;以绿色荧光蛋白（greenfluorescence protein,GFP）基因作为报告基因,观察在草酸铂作用下GFP基因对8348R细胞的转染效率,用克隆形成试验观察草酸铂对PC-MDR1质粒转染8348R细胞的影响;用MTT试验检测草酸铂联合5-FU及MDR1反义RNA对8348R细胞的杀伤效率.结果转染PC-MDR1质粒后,8348R细胞在5-FU作用下较转染前活性明显下降,转染后细胞出现明显的S期和G2/M期阻滞,细胞凋亡比例显著升高;草酸铂将PC-MDR1质粒对直肠癌细胞的转染效率提高18倍,IC50剂量草酸铂、5-FU联合MDR1反义RNA可大大提高对8348R细胞的杀伤效率,总体杀伤效率可达到75%.结论应用草酸铂、5-FU联合MDR1反义RNA对直肠癌耐药细胞的协同杀伤作用,可望成为治疗对5-FU耐药的直肠癌的有效方法.     

TK基因/9-丙氧鸟苷联合mGM-CSF基因治疗胃癌

目的 观察自杀基因ＴＫ对小鼠胃癌的杀伤作用,并联合ｍＧＭ－ＣＳＦ基因,观察免疫反应在增强ＴＫ杀伤性中的作用。方法 应用逆转录病毒方法转导自杀基因ＴＫ,应用脂质体方法转导细胞因子基因ｍＧＭ－ＣＳＦ。观察ＴＫ基因体外对小鼠胃癌６１５小鼠前胃癌（ＭＦＣ）细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中将病毒上清注入瘤体内,并结合应用其前药９－丙氧鸟苷（ＧＣＶ）和ｍＧＭ－ＣＳＦ基因,分别观察肿瘤的生长情况。通过病理切     

重组可溶性Fas偶联蛋白激酶C抑制剂对结直肠癌细胞靶向杀伤作用的研究

目的针对复发转移结直肠癌细胞膜分子靶点,探讨可溶性Fas偶联蛋白激酶C(PKC)抑制剂对结直肠癌细胞的靶向杀伤作用。方法采用RT-PCR扩增、克隆Fas胞外区,构建真核表达载体pGEX-4T-1-sFas,采用GST融和蛋白纯化法纯化sFas。采用化学偶联法连接sFas与PKC抑制剂Calphoetin C。通过细胞抑制率测定法(MTT法)检测偶联物对FasL阳性结直肠癌细胞的杀伤作用。结果扩增、克隆Fas胞外区571 bp经限制性酶切和DNA序列测定证实无误。转化宿主菌BL21表达纯化,经Western blotting确认sFas蛋白产物。将sFas与PKC抑制剂Calphostin C经化学偶联得到偶联物sFas-Calphostin C。利用PKC酶检测系统检测偶联物具有抑制PKC酶活性作用。偶联物(40 mg/L)对FasL表达阳性结直肠癌细胞HR-8348癌细胞生长抑制率(39．04%)较FasL表达阴性HR-8348癌细胞(33．69%)明显提高(t=4．093,P＜0．05),对外周血单个核细胞杀伤作用不明显(23．08%),偶联物联合氟尿嘧啶对FasL阳性HR-8348细胞的细胞抑制率(68．38±5．07)%明显高于氟尿嘧啶对FasL阳性HR-8348细胞的细胞抑制率(36．02±1．50)%(t=14．05,P＜0．001)。结论重组可溶性Fas偶联PKC抑制剂对侵袭行为较强的结直肠癌细胞具有较强的靶向杀伤作用。     

人FasL全长cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆人FasL全长cDNA并构建其真核表达载体。方法：采用RT-PCR法从健康人外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的FasI。全长cDNA，将之与pGEM-T：Easy质粒连接、测序。构建pcDNA3．1-FasL真核表达载体，用脂质体介导方法转染人直肠癌8348细胞，检测FasL表达情况。结果：RT-PCR扩增的FasL产物经限制性内切酶酶切后生成的片段符合预期大小。克隆测序证实所得的FasL cDNA序列与Gene Bank序列完全一致。pcDNA3．1-FasL重组质粒经：EcoRI XhoI双酶切后，电泳显示898bp目的片段和pcDNA3．1载体片段，证明重组质粒正确。转染直肠癌8348细胞后。用RT-PCR方法检测FasL表达阳性。结论：采用RT-PCR方法成功克隆了人FasL全长cDNA并构建了其真核表达载体．为进一步研究FasL功能奠定了基础。     

FasL cDNA转染对直肠癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨FasLcDNA转染和表达对直肠癌细胞耐药性的影响。方法:用RT-PCR方法克隆人FasL全长cDNA,构建pcDNA3.1-FasL真核表达载体,用脂质体法转染HR-8348人直肠癌细胞,采用MTT法检测顺铂对转染和未转染直肠癌细胞的生长抑制率。结果:DNA测序证实克隆FasLcDNA898bp与GeneBank序列完全一致。构建真核表达载体转染HR-8348细胞后,FasLmRNA表达明显增强。在不同浓度顺铂(1、5、10、20、40mg/L)的作用下,FasL转染组直肠癌细胞抑制率分别为11.0%、25.4%、31.2%、37.8%、42.4%:对照组癌细胞抑制率分别为26.1%、34.4%、37.6%、42.9%、53.2%,其差异有显著性意义(t=4.43,P<0.05)。结论:FasL转染HR-8348细胞可增强癌细胞的耐药性,减弱顺铂对HR-8348细胞的杀伤作用。