过继免疫治疗的新希望--CHAK细胞

目的：探讨CHAK细胞体外常规生物学活性。方法：采用血球计数板计算外周血单核细胞(PBMC)、LAK细胞及CHAK细胞三组细胞的增殖能力，MTT法检测各组细胞对K562肿瘤细胞株杀伤能力，免疫组化检测细胞表型。结果：与PBMC和LAK相比，CHAK细胞显示出更强增殖能力和较高的细胞毒活性，且CD16^ 、CD56^ 细胞表型明显高于其它两组。结论：CHAK是一类不同与LAK细胞的新型高效杀伤细胞，可能会在临床抗肿瘤治疗中发挥重要的作用。     

CIK细胞的诱导及其对肝癌细胞毒作用的体外研究

目的体外诱导细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK),并研究其生物学活性。方法从外周血和脐血分离单个核细胞(PBMC),经过细胞因子诱导、培养并扩增CIK细胞,以LAK作比较,流式细胞仪检测CIK细胞表面标志CD3、CD56。3H-TdR释放法检测CIK的增殖能力,MTT法检测对肝癌细胞系SMMC-7721、Bel-7402,正常胎肝细胞L-02的杀伤活性。结果CIK细胞第二周进入快速增殖期,到第31d扩增倍数超过60倍,CD3+CD56+细胞扩增倍数达800倍以上;CIK对肝癌细胞的杀伤能力明显优于LAK细胞(65%～81%);对正常胎肝细胞的细胞毒作用(<5%)。结论CIK细胞是一种具有很强杀瘤活性的免疫活性细胞,具有临床应用前景。     

慢性乙型肝炎患者CIK细胞生物学特性的研究

目的探讨慢性乙型肝炎外周血CIK细胞的生物学特性,寻求治疗乙型肝炎的一种新方法。方法提取20例慢性乙型肝炎患者和20例健康人外周血单个细胞与IFN-γ、IL-1β、抗CD3mAb和IL-2共同培养诱导CIK细胞,用流式细胞仪检测细胞表型特征和细胞增殖倍数,用LDH酶释放法检测细胞的杀伤活性;同时设立CIK和CD3AK细胞在增殖和杀伤活性作比较。结果慢性乙型肝炎患者CIK细胞的增殖及杀伤活性均低于正常对照组(P<0·01),但较培养前明显增高,于培养后12~24d达高峰。CIK细胞与CD3AK细胞在增殖倍数上无明显差异(P>0·05),但杀伤活性前者比后者有显著提高(P<0·01)。结论慢性乙型肝炎患者CIK细胞的增殖倍数、杀伤活性均低于正常人,但明显高于培养前。诱导12~24d后CIK细胞增殖及杀伤活性均达到高峰,此时期的CIK细胞适合临床应用;CIK细胞其体外杀瘤活性明显优于CD3AK细胞,CIK可作为继CD3AK细胞之后过继免疫治疗乙型肝炎的一种新方法。     

低剂量辐射对脐血LAK细胞体外抗肿瘤活性的影响

目的 探讨低剂量辐射对脐血LAK细胞体外抗肿瘤活性的影响。方法 新鲜分离的脐血单个核细胞用重组白细胞介素2培养72h获取LAK效应细胞,在培养48h时给予1次不同剂量（分别为62mGy,124mGy,186mGy,248mGy）的γ射线照射,应用^3H－TdR释放实验测定LAK体外杀伤肿瘤靶细胞（K562,HL－60）活性。结果 脐血LAK细胞对K562和HL－60的杀伤活性与成人外周血相比差异无显著性（P＞0．05）。接受低剂量辐射的脐血LAK细胞K562和HL－60的细胞毒性显著高于非照射对照组（P＜0．01）。结论 脐血可作为LAK细胞的一个良好来源。低剂量辐射可增强脐血LAK杀伤肿瘤细胞的细胞毒性,从而可能用于清除微小残留病变及在脐血移植时增强移植物抗白血病效应。     

宫颈癌细胞冻融抗原负载树突状细胞激发细胞毒性T淋巴细胞杀伤宫颈癌细胞的体外研究

目的研究HeLa、SiHa两种宫颈癌细胞株冻融抗原负载的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外抗原特异性杀伤官颈癌细胞的能力.方法利用免疫磁珠分离法(MACS)分离纯化脐血CD34 细胞并在体外诱导分化为DC,用反复冻融法分别从两种宫颈癌细胞株(HeLa利SiHa)中提取可溶性冻融抗原并负载DC.流式细胞学检测负载两种抗原后DC表面分子的表达,ELISA法检测DC上清中IL-12的表达,MLR测定DC刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测DC经抗原负载后激活的CTL分别对HeLa和SiHa细胞的杀伤作用.结果与未经抗原负载的DC相比,经HeLa和SiHa冻融抗原负载的DC能更好的表达各种DC分化相关抗原(CD1a、CD83、CD80、HLA-DR以及CD54),刺激T淋巴细胞增殖和IL-12分泌的能力也显著加强(P＜0.05).与未经抗原负载相比,两种宫颈癌细胞冻融抗原负载DC后激发的CTL在体外对官颈癌细胞的杀伤能力也明显加强.此外,HeLa细胞抗原负载DC诱导的CTL在体外对HeLa细胞的杀伤率为72.2%,显著高于它对SiHa细胞的杀伤率(22.3%);而SiHa细胞抗原负载DC诱导的CTL对SiHa细胞的杀伤率为69.5%,也明显高于它对HeLa细胞的杀伤率(28.1%),具有显著的抗原特异性.结论经宫颈癌细胞冻融抗原负载DC激活的CTL在体外具有更强的增殖能力,并具有抗原特异性杀伤宫颈癌细胞的作用.     

LAK细胞和HSV1-TKc/GCV基因治疗系统对卵巢癌细胞的体外作用

[目的]对LAK细胞和HSV1-TKc/GCV基因治疗系统对卵巢癌细胞的体外作用进行研究分析。[方法]分别将不同比例的LAK细胞和AO细胞混合培养6h(4︰1,20︰1,100︰1,500︰1),采用LDH释放法测定LAK的杀伤活性;HSV1-TKc+及HSV1-TKc-AO细胞按照不同比例培养60h(15︰85,35︰65,50︰50,75︰25,65︰35,85︰15),后更换15μg/ml GCV培养液,6d后采用LDH释放法测定其杀伤活性。对两组实验的效靶比与杀伤活性进行相关性检验,比较两组的杀伤活性。[结果]LAK细胞与靶细胞的比值与杀伤活性呈线性相关性(r=0.996,P﹤0.01),其杀伤活性随着效靶比的增大而增加;AO/HSV1-TKc+与AO/HSV1-TKc-的细胞比例与HSV1-TKc/GCV的杀伤活性成线性相关(r=0.984,P﹤0.01),其杀伤活性随着比例的增大而增加,LAK与HSV1-TKc/GCV两组比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。[结论]LAK细胞与HSV1-TKc/GCV基因治疗系统对卵巢癌细胞的体外具有一定的杀伤作用,但两者比较差异无统计学意义。     

LAK、NK及T细胞亚群在肝癌手术前后的动态变化

研究肝癌患者手术前后LAK、NK细胞活性和T细胞亚群免疫功能的动态变化,检测了31例肝癌患者手术前后和30例正常成人志愿者的淋巴因子活化性杀伤细胞(LAK)、自然杀伤细胞(NK)活性以及T淋巴细胞亚群较肝癌患者的LAK、NK活性以及CD3、CD4和CD4/CD8比值均明显降低(P＜0.01),CD8有增高趋势(P＞0.05);术后16d,上述细胞免疫活性与术前相比显著增高(P＜0.05).结果细胞免疫功能在肝癌患者中严重受损并且与肿瘤的消长有密切关系,LAK、NK、TC细胞亚群活性为判断肝癌手术疗效和预后的重要指标,对肝癌的综合治疗有指导意义.     

香烟提取物对人体NK细胞和LAK细胞活性影响

目的　了解烟雾对人类自然杀伤细胞 (NK)和杀伤细胞 (LAK)活性的影响。方法　抽取 4 0名不吸烟的健康自愿者外周血分离单个核细胞 (PBMC) ,将每名自愿者的PBMC分为A、B、C、D 4份 ,A、B用于检测NK细胞 ,C、D用于检测LAK细胞 ,其中B、D不加香烟提取物作为正常对照 ,A、C加入香烟提取物一起培养 ,以K5 6 2 (NK敏感细胞 )为靶细胞经噻唑蓝 (MTT)法检测NK细胞活性 ,以HL 6 0为靶细胞 (NK耐受细胞 )检测LAK细胞活性。观察香烟提取物对NK细胞和LAK细胞的影响。结果　A组NK细胞平均活性为 (43 95± 5 5 7) %,B组为 (45 84±5 6 1 ) %,二者差异无统计学意义 (P >0 0 5 ) ,两组NK细胞活性段位分布比较差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ,C组LAK细胞平均活性为 (2 0 0 7± 1 78) %,D组为 (2 4 5 0± 2 1 7) %,二者差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。结论　香烟提取物可影响LAK细胞活性和少数个体NK细胞活性。降低机体免疫监视功能和对癌变细胞清除的能力 ,可能是吸烟者癌症高发的主要原因之一。     

IL—2激活的正常人PBL裸鼠体内抗肿瘤作用的研究

给裸鼠尾静脉注射Anip973人肺腺癌细胞造成人工肺转移癌模型。应用IL-2激活的PBL细胞进行体外扩增,诱导出具有杀伤活性的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞),对裸鼠体内抗肿瘤作用进行研究。结果表明注入新鲜淋巴细胞组和单纯注入IL-2组均不能明显抑制肿癌的肺转移,单纯注入LAK细胞组可抑制肿瘤的肺转移,LAK细胞与IL-2同时注射时抑制肺癌转移率比LAK细胞组明显提高。病理检查证实了经LAK细胞和IL-2同时治疗的裸鼠,肺转移癌结节明显减少。LAK细胞与rIL-2伍用亦可显著延长荷瘤裸鼠的生存期。     

负载肺癌A549抗原的树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞特异性激活研究

目的 观察负载肺癌A549抗原的树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)特异性肿瘤杀伤活性的作用.方法 由正常人富含淋巴细胞白膜分离、细胞因子诱导制备DC细胞和CIK细胞.用流式细胞术分析DC细胞和CIK细胞的表型.经混合淋巴反应和体外细胞毒性实验观察负载A549抗原的DC对CIK具有特异性激活作用.结果 表型分析显示,CIK细胞以CD3 CD56 自然杀伤细胞为主,成熟DC细胞高表达CD40、CD80、CD86和HLA-DR,并可刺激CIK细胞的增殖诱导混合淋巴反应,而负载A549抗原的DC细胞能显著增强CIK细胞特异性杀伤靶细胞的能力(P＜0.05).小鼠注射CIK、DCCIK和Ag·DC·CIK后的肿瘤直径分别为(65.34±12.33)、(70.17±13.26)和(36.79±9.19)mm,后者的抗肿瘤作用较高(P＜0.05).结论 抗原负载的DC细胞可活化CIK细胞,并使其具有特异性杀伤肿瘤细胞的能力.     

运动对慢性疲劳综合征小鼠免疫功能影响

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome,CFS)是一种疲劳性疾病[1].适量运动能增强机体免疫功能,有效刺激淋巴细胞、臣噬细胞的增殖,促进免疫细胞因子的释放,增强自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子一激活的杀伤(LAK)细胞等杀伤细胞的杀伤活性[2].     

抗原负载树突状细胞对胃癌患者自身肿瘤细胞体外杀伤作用研究

目的探讨用冻融的自身胃癌抗原冲击树突状细胞(DC),体外观察其对自身细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对自身肿瘤细胞杀伤作用的研究。方法从胃癌手术切除肿瘤周围转移引流淋巴结,提取单个核细胞,将贴壁生长的细胞用细胞因子基因重组粒巨集落和生长因子(rhGM-CSF)、基因重组白介素4(rhIL-4)、以及基因重组α-肿瘤坏死因子(rhTNF-α)联合诱导培养DC,然后用经冻融制备的自身肿瘤细胞抗原冲击DC并作用CIK细胞,最后检测CIK细胞体外杀伤三种靶细胞(自身胃癌细胞、K562和SGC-7901细胞)的活性。结果经细胞因子联合诱导培养后,DC含量明显增高,CD1a/CD14和CD80/CD86阳性细胞比刚分离的单个核细胞明显增多。DC和CIK细胞共同培养后,CIK细胞高表达CD3+CD56+。负载胃癌抗原冲击的引流淋巴结DC活化的CIK细胞,杀伤自身肿瘤细胞活性达78.6%,而单纯CIK细胞为35.2%,两者比较有显著性差异p<0.01;而对K562和SGC-7901细胞杀伤活性二者间无明显差异。结论肿瘤周围转移引流淋巴结贴壁细胞在体外能定向诱导扩增出大量DC;胃癌抗原负载的DC和CIK细胞共同培养,可明显提高CIK细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性。     

吡柔比星联合二烯丙三硫抑制膀胱癌细胞生长的协同作用研究

目的探讨吡柔比星(THP)联合二烯丙三硫(DATS)对膀胱癌细胞T24的协同杀伤效应及其机制。方法 MTT法、TUNEL法、流式细胞仪分别检测THP、DATS及二者联合对T24细胞生长、细胞周期及凋亡的影响;western-blot测定Bcl-2、Bax的表达变化;比色法测定caspase-3活性。结果 THP、DATS均能抑制T24细胞生长,DATS可明显提高THP的杀伤效应;THP(0.25mg/L)联合DATS(3mg/L)作用48h的细胞生存率为(32.3±2.6)%,低于单独应用THP(63.2±1.4)%和DATS(61.9±4.2)%,二者具有协同抑瘤作用;联合药物组可明显提高细胞凋亡率及G2/M期细胞比率,并更能显著抑制Bcl-2的表达,促进caspase-3的活性增加。结论 THP联合DATS可通过共同诱导肿瘤细胞凋亡发挥协同作用,抑制膀胱癌细胞生长,该机制可能与细胞周期阻滞、Bcl-2的表达及caspase-3的活性变化有关。     

寡脱氧核苷酸致敏树突状细胞对SKOV-3卵巢癌移植瘤抑瘤作用的研究

目的:探讨含未甲基化胞嘧啶-磷酸二酯键-鸟嘌呤(CpG)基序的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)致敏树突状细胞(DCs)对裸鼠人卵巢癌移植瘤生长的免疫抑制作用。方法:应用CpG ODN2006联合肿瘤表面抗原体外冲击致敏人外周血来源DCs,四唑盐(MTT)比色试验法测定致敏DCs激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)增殖活性及活化的CTLs对SKOV-3卵巢癌细胞株的杀伤能力。CTLs经皮下注射免疫荷瘤裸鼠,测定其对裸鼠人SKOV-3卵巢癌移植瘤生长的抑制作用。结果:CpG ODN2006联合肿瘤表面抗原体外可明显促进淋巴细胞的增殖,增殖活性显著高于未致敏组和单纯肿瘤抗原致敏组(P<0.01),且相同效靶比下所诱导的CTLs对SKOV-3卵巢癌细胞的杀伤活性显著强于未致敏组、单纯CA125致敏组和单纯CpGODN致敏组(P<0.01)。在体实验显示联合致敏组CTLs对裸鼠人SKOV-3卵巢癌移植瘤的生长有显著的抑制作用,抑瘤效果明显优于单纯CpG ODN致敏组和单纯CA125致敏组(PCpGODN<0.05,PCA125<0.01)。结论:CpG ODN联合CA125致敏DCs可促进CTLs增殖,抑制裸鼠人SKOV-3卵巢癌移植瘤的生长,从而为卵巢癌免疫治疗研究开辟了新思路。     

LSC-DC-CIK对慢性粒细胞白血病干细胞杀伤作用的体外试验研究

目的 研究慢性粒细胞白血病(CML)患者来源的干细胞体外扩增诱导生成树突细胞(DC),与同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,对慢性粒细胞白血病细胞株K562干细胞的杀伤作用.方法 提取CML患者的骨髓单个核细胞(BMMC),利用流式细胞术(FCM)分选纯化白血病干细胞(LSC)CD34+CD38-CD44+,体外扩增诱导生成LSC-DC.取同一患者骨髓的BMMC诱导出CIK.LSC-DC与CIK共培养,用光学显微镜观察细胞形态,FCM分析LSC-DC和CIK细胞免疫表型,荧光原位杂交(FISH)检测BCR/ABL融合基因在LSC及LSC-DC中的表达,FCM检测LSC-DC-CIK对慢性粒细胞白血病细胞株K562干细胞的杀伤及凋亡情况.结果 白血病干细胞能成功诱导为LSC-DC,其DC成熟免疫表型CD40、CD80、CD83、CD86及受体(HLA-DR)的表达均高于诱导前;共培养后CIK表面标志CD3、CDs、CD56的表达率高于单独培养CIK,差异有统计学意义(P＜0.01).LSC-DC与CIK共培养后对慢性粒细胞白血病细胞株K562干细胞的杀伤率(66.94％)明显高于单独培养的CIK(31.89％),差异有统计学意义(P＜0.01).LSC-DC-CIK可诱导K562细胞凋亡,凋亡率为52.28％±3.71％,与CIK组(37.51％±1.89％)相比,差异有统计学意义(P＜0.01);但对其中白血病干细胞无明显的诱导凋亡作用.结论 CML来源LSC-DC保留有干细胞特征,其与CIK共培养能杀伤慢性粒细胞白血病细胞株干细胞,但无明显的诱导干细胞凋亡作用.     

胃癌根治术后LAK细胞及rIL-2腹腔灌注的临床疗效

目的探讨胃癌根治术后使用淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞及重组白细胞介素-2(rIL-2)腹腔灌注的疗效。方法选取2016年12月-2019年12月天台县人民医院收治的行胃癌根治术治疗的患者87例,按随机数表法分为对照组(行常规化疗,n=42)与研究组(行LAK细胞过继免疫疗法及rIL-2腹腔灌注治疗,n=45)。术后采集腹腔引流液行真菌培养,对比分析两组患者腹膜转移发生情况,评价相关指标;比较治疗前后两组外周T细胞亚群变化;统计不良反应发生率和感染率。结果研究组真菌感染率、腹膜转移发生率、治疗后血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);研究组治疗后CD3⁺、CD4⁺高于对照组,CD8⁺、自然杀伤(NK)细胞及切口感染、肺部感染、尿路感染发生率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌根治术治疗后预防腹膜转移治疗期间开展LAK细胞过继免疫疗法及rIL-2腹腔灌注效果显著,能够有效控制肿瘤复发,增强患者机体免疫功能,减少不良反应和感染的发生。     

DC-CIK细胞治疗恶性肿瘤的护理

树突状细胞(dendriticcells,DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞,可以在体内、体外向T淋巴细胞递呈抗原,并诱发细胞毒T淋巴细胞反应[1].细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced cells,CIK)具有很强的增殖能力,而且可以从人外周血中获得大量前体细胞,其体外增殖能力可达到1500倍以上,具有较强的抗肿瘤能力[2].     

负载乳腺癌干细胞RNA树突状细胞疫苗抗肿瘤免疫机制的研究

目的:通过制备负载乳腺癌干细胞RNA的树突状细胞疫苗,研究其抗肿瘤免疫机制.方法制备乳腺癌干细胞RNA树突状细胞疫苗的采用细胞毒性试剂盒检测2种乳腺癌干细胞疫苗[(A组,CD44+CD24-+MCF-7-CTLs)、(B组,MCF-7-CTLs)]和(C组,DC-CTLs)的体外细胞杀伤能力.取24只小鼠均分为四组:A1组皮下接种活化的A组疫苗+MCF-7乳腺癌细胞;B1组接种活化的B组疫苗+MCF-7乳腺癌细胞;C1组皮下注射活化的DCs-CTLs+MCF-7乳腺癌细胞;D1组单用MCF-7乳腺癌细胞作为对照.分析裸鼠接种后肿瘤在体内的生长情况.结果:体外对CD44+CD24-+MCF-7乳腺癌细胞杀伤能力强度:A组>B组>C组(P<0.05).体外对MCF-7乳腺癌细胞杀伤能力强度:B组>A组>C组(P<0.05).在体成瘤实验显示,B1组和A1组的成瘤时间分别为第7周和第6周,明显长于D1组(第1周)和C1组(第2周)(P<0.05).结论:CD44+CD24-乳腺癌干细胞RNA树突状细胞疫苗诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞能够产生特异性免疫应答,从而发挥抗肿瘤作用.     

负载乳腺癌抗原的脐血树突细胞外泌体抗肿瘤免疫作用

目的:探讨负载乳腺癌抗原的人脐带血树突状细胞(DCs)分泌的外泌体的抗肿瘤免疫效应。方法:提取新鲜脐血单个核细胞,体外诱导分化为DCs,提取乳腺癌细胞MCF-7肿瘤抗原,并冲击脐血DCs,加入LPS诱导其成熟,利用流式细胞仪检测表型;超速离心法收获负载抗原的脐血DC外泌体;MTT法检测外泌体诱导的T淋巴细胞增殖反应及其激活的CTL对肿瘤细胞的杀伤效应。结果:脐血DC表面标志CD34、CD80、CD86、CD11c阳性细胞数与新鲜脐血单个核细胞相比明显增加(P<0.05);Western-Blot结果显示,负载乳腺癌的脐血DC外泌体携带有MHC-Ⅱ类、CD40、CD80、CD86分子;成熟脐血DC组及负载乳腺癌抗原脐血DC外泌体对同种异体来源的T细胞均有明显促增殖作用;负载乳腺癌抗原的脐血DC及其外泌体激活的CTL均能对乳腺癌细胞MCF-7产生显著地杀伤作用(P<0.05)。且在效靶比100∶1时,外泌体的杀伤作用高于负载抗原的脐血DC(P<0.05)。结论:负载乳腺癌抗原脐血DC分泌大量外泌体,可促进同种异体T细胞增殖,并能诱导特异性抗乳腺癌的免疫效应。     

负载gp96多肽复合物的树突状细胞抗耐药卵巢癌细胞株作用的实验研究

目的:探讨以卵巢癌细胞(SKOV3)热休克蛋白gp96多肽复合物作为抗原,刺激树突状细胞增强其抗原呈递功能,增加对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞在体外的杀伤作用,为临床卵巢癌的辅助免疫治疗提供实验依据。方法:从卵巢癌细胞中提纯出gp96多肽复合物,并对其进行鉴定;与脐血诱导培养的树突细胞(DC)结合,制备gp96-DC复合物;将DC和负载抗原的DC分别加入脐血有核细胞和人外周血T淋巴细胞中,研究二者对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞的体外CTL效应。结果:提取后的蛋白质经WesternBlot鉴定,表明该蛋白为热休克蛋白gp96;两种DC对脐血有核细胞和人外周血T淋巴细胞均有明显的活化作用,但gp96-DC对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞有更强的杀伤活性。结论:卵巢癌细胞提取的热休克蛋白gp96刺激的树突状细胞疫苗在体外对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞具有明显的杀伤功能,作为一种辅助治疗手段为卵巢癌患者的治疗带来希望。